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1、FISH技术在乳腺癌检测中的应用技术在乳腺癌检测中的应用第1页，共38页。 细胞遗传学技术 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA 靶序列杂交 观察：荧光显微镜 原位观察（细胞、组织）细胞核 彩色探针信号 目的：获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种 基因状态的信息。荧光原位杂交荧光原位杂交（FISH）Fluorescence in situ hybridization第2页，共38页。荧光标记探针探针变性样本DNA变性杂交用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈
2、线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位FISH原理原理第3页，共38页。操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合，可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析方法敏感，能迅速得到结果探针为直接标记，特异性好 ，信号强标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测FISH技术的特点技术的特点第4页，共38页。CSPCSP探针：染色探针：染色体着丝粒探针体着丝粒探针GLPGLP探针：位点探针：位点特异性探针特异性探针 WPPWPP探针：全染探针：全染色体或染色体区色体或染色体区域特异性探针域特异性探针centromeretelom
3、ere subtelomerelocusspecificwhole chromosome paintFISH探针的种类探针的种类第5页，共38页。制片制片 预处理预处理 FISH结果分析结果分析 破坏细胞膜利于探针破坏细胞膜利于探针 杂交。杂交。 蛋白酶消化、蛋白酶消化、HCl处理处理 变性变性 杂交杂交 洗涤洗涤 复染复染操作流程简图操作流程简图第6页，共38页。乳腺癌乳腺癌 Her-2基因基因Her-2基因表达的蛋白产物为人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2)，也称为neu、C-erbB-2、Her-2/neu。第7页，共
4、38页。乳腺癌乳腺癌 Her-2基因基因l 致癌基因：致癌基因：Her-2基因；基因；l 位点：位点：17q11.2-q12；l 编码蛋白：跨膜蛋白（与编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）；表皮生长因子受体部分同源）；l 25-30%乳腺癌病人都有乳腺癌病人都有HER-2的扩增；的扩增；l HER-2基因扩增是决定基因扩增是决定Herceptin治疗治疗是否有效的关键是否有效的关键性指标。性指标。第8页，共38页。Her-2基因的检测方法基因的检测方法检测方法检测方法检测指标检测指标优点优点缺点缺点IHCHer-2蛋白费用低光镜即可观察结果准确性差，主观性强，假阳性率高CISHH
5、er-2 DNA光镜即可观察结果对低度扩增及染色体非整倍扩增检测灵敏度下降FISHHer-2 DNA对于低倍、高倍染色体非整倍性扩增检测准确性高，灵敏度特异性好，结果判断客观相对费用较高第9页，共38页。HER-2检测和荧光原位杂交技术检测和荧光原位杂交技术(FISH)nFISH成为检测HER-2的金标准nFISH方法的操作简单，探针重复性好n检测结果明确，只需计数红绿信号的比例，方法简单、直观结果可以通过软件分析,客观第10页，共38页。HER-2探针探针第11页，共38页。HER-2探针探针第12页，共38页。疾病疾病名称名称检测探针检测探针标记颜色标记颜色探针定位探针定位探针名称探针名称
6、乳腺癌GLP Her2 / CSP17 红/绿Her2： 17q11.2-q12CSP17:17p11.1q11.1 CSP17:17号染色体着丝粒正常: 2红/2绿异常: 红信号大于2为异常细胞(绿色信号不少于2个的细胞)Her-2基因基因FISH 探针组探针组第13页，共38页。HER-2基因扩增模式基因扩增模式第14页，共38页。评价评价17号染色体的意义号染色体的意义 17号染色体非整倍性：每个细胞中号染色体非整倍性：每个细胞中17号染色体多于或少于号染色体多于或少于2个；个； 乳腺癌遗传学特征之一，可能预示预后不良；乳腺癌遗传学特征之一，可能预示预后不良； 17号染色体多体性是导致号
7、染色体多体性是导致IHC 3+但但FISH检测为阴性的主要原检测为阴性的主要原因；因； 有实验室完成病例中有实验室完成病例中17号染色体非整倍性发生率为号染色体非整倍性发生率为33.3%。评价评价Her-2基因状态的同时应考虑基因状态的同时应考虑 17号染色体数目的变化号染色体数目的变化第15页，共38页。第16页，共38页。DAPI染色后与染色后与HE切片对比图切片对比图观察浸润部分观察浸润部分导管内癌导管内癌第17页，共38页。计数细胞核选择计数细胞核选择第18页，共38页。结果判断结果判断统计统计Ratio值（计数值（计数浸润性部分浸润性部分的的20个细胞）个细胞）l Ratio值20个
8、细胞核中红信号总数/绿信号总数l Ratio2.0 为阴性结果l Ratio2.0或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果l 比值比值24为低度扩增为低度扩增l 410为中度扩增为中度扩增l 10为高度扩增为高度扩增lRatio在1.8-2.0 之间时，则需要再计数20个细胞核中 的信号。如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明。 第19页，共38页。第20页，共38页。第21页，共38页。A. 无须计数的大簇团信号无须计数的大簇团信号（高度扩增）（高度扩增）B. 颗粒状信号（颗粒状信号（R10，高度扩增），高度扩增）C. 须计数的颗粒状信号须计数的颗粒状信号（R=3.5，低度扩增），低度扩增
9、）ACBHer-2基因扩增状况基因扩增状况第22页，共38页。Her-2基因无扩增情况基因无扩增情况红信号数红信号数2，同时绿信号非整倍体，同时绿信号非整倍体R2，无扩增，无扩增红信号与绿信号红信号与绿信号均为两点，均为两点，R=1第23页，共38页。常见问题分析常见问题分析第24页，共38页。实验操作第25页，共38页。实验操作第26页，共38页。实验操作第27页，共38页。实验操作第28页，共38页。实验操作第29页，共38页。实验操作第30页，共38页。实验操作第31页，共38页。实验操作第32页，共38页。实验操作第33页，共38页。实验操作第34页，共38页。注意事项注意事项n组织固
10、定保持形态，推荐的固定剂：10%中性缓冲福尔马林n脱蜡彻底n蛋白酶预处理过消化或消化不足n各种试剂的PH值要严格测定 试剂偏酸影响红色信号 试剂偏碱影响绿色信号n变性、杂交、洗涤温度的要求n合适的滤光片红色，橙色n显微镜的汞灯光源100瓦特，使用不到2年第35页，共38页。及时固定标本很重要及时固定标本很重要n备检标本应及时固定及处理n乳腺癌：不超过1小时n胃 癌：20分钟之内n从机体移除至组织开始降解之过程称为“组织缺血”。组织缺血影响：nHER2检测n雌激素及孕激素受体(ER 和PR)检测 从手术切除到实验室接收之间的组织处理不当会造成不理想和不一致的HER2检测结果 最坏的情况下，检测有可能失败规范的标本固定是HER2检测质量的保障；保存良好的组织形态，防止细胞内蛋白和核酸的丢失第36页，共38页。质量检查质量检查第37页，共38页。Thank you！第38页，共38页。
