《最新过程分子生物学(1 2012)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《最新过程分子生物学(1 2012)（86页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、过程分子生物学过程分子生物学张张 惠惠 展展分子生物学是生命科学的主导性学科分子生物学是生命科学的主导性学科基因的表达与调控是分子生物学的主题思想基因的表达与调控是分子生物学的主题思想过程分子生物学是分子生物学理论发展的高级阶段过程分子生物学是分子生物学理论发展的高级阶段1953-19831953-1983 基础分子生物学阶段基础分子生物学阶段2020世纪世纪5050年代年代 DNADNA双螺旋模型的建立双螺旋模型的建立2020世纪世纪6060年代年代 遗传密码的破译遗传密码的破译2020世纪世纪7070年代年代 DNADNA重组技术的诞生重组技术的诞生1983-1983-？ 过程分子生物学阶
2、段过程分子生物学阶段2020世纪世纪8080年代年代 动植物转基因技术的问世动植物转基因技术的问世2020世纪世纪9090年代年代 人类基因组计划的实施人类基因组计划的实施2 21 1世纪世纪0000年代年代 RNARNA干扰现象的发现干扰现象的发现过程分子生物学5 2 3 4 1 6 基因表达的调控机制基因表达的调控机制细胞通讯的分子机制细胞通讯的分子机制免疫多样性的分子识别免疫多样性的分子识别胚胎发育的基因表达谱胚胎发育的基因表达谱肿瘤发生的分子机制肿瘤发生的分子机制基因组学与系统生物学基因组学与系统生物学基因表达的调控机制B C D A E F 原核生物基因表达的启动开关原核生物基因表达
3、的启动开关真核生物多转录因子的协同作用真核生物多转录因子的协同作用原核生物的原核生物的RNARNA结构调控结构调控真核生物的真核生物的RNARNA剪切调控剪切调控原核生物反义原核生物反义RNARNA的调控的调控真核生物真核生物sRNAsRNA介导的介导的RNARNA干扰干扰G 真核生物应答元件的转录调控真核生物应答元件的转录调控1 1A A 原核生物基因表达的启动开关原核生物基因表达的启动开关 通过对通过对100100多个大肠杆菌启动子的序列分析，结果表明：大多数多个大肠杆菌启动子的序列分析，结果表明：大多数具有普通生理生化功能的基因所属的启动子，具有统一的特征序列。具有普通生理生化功能的基因
4、所属的启动子，具有统一的特征序列。a 大肠杆菌启动子的多样性TTGACATTGACAAACTGTAACTGTTATAATTATAATATATTAATATTA16 - 10 16 - 10 bpbp5 - 9 5 - 9 bpbp结构基因结构基因转录起始位点转录起始位点-35-35区区 T T8282T T8484GG7878AA6565CC5454AA4545-10-10区区 T T8080AA9595T T4545AA6060AA5050T T9696启动子启动子一个典型的大肠杆菌启动子通常包括下列四个结构要素：一个典型的大肠杆菌启动子通常包括下列四个结构要素： 1 1A A 原核生物基因表
5、达的启动开关原核生物基因表达的启动开关 绝大多数原核生物的绝大多数原核生物的RNARNA聚合酶均由五个亚基组成：聚合酶均由五个亚基组成：a a a a2 22 2b bb bb bb bs s s s（全全酶酶），其中），其中a a a a2 22 2b bb bb bb b称为（称为（核心酶核心酶）。各种原核细菌的）。各种原核细菌的a a a a、b b b b、b b b b亚基呈高亚基呈高度的同源性，唯独度的同源性，唯独s s s s因子因子差别较大。差别较大。RNARNA聚合酶核心酶对聚合酶核心酶对DNADNA链具有链具有非特异性的亲和力（碱性蛋白与酸性非特异性的亲和力（碱性蛋白与酸性
6、DNADNA之间的静电引力），但之间的静电引力），但s s s s因因子增强了子增强了RNARNA聚合酶与启动子区域的聚合酶与启动子区域的特异性特异性结合。结合。s s s s因子帮助因子帮助RNARNAa 大肠杆菌启动子的多样性聚合酶识别启动子，同时启动转录。聚合酶识别启动子，同时启动转录。大肠杆菌启动子与大肠杆菌启动子与s s s s因子的对应关系因子的对应关系 （Lewins Lewins GENESGENES X 2010 X 2010）氨基酸氨基酸-35-35区序列区序列识别数识别数间隔间隔区区-10-10区序列区序列因子因子/基因基因TTGACATTGACATATAATTATAAT
7、1000100016-18 bp16-18 bp613613ss 70 70（rpoDrpoD）CTGGNACTGGNATTGCATTGCA556 bp6 bp477477ss 54 54（rpoNrpoN）CCCTTGAACCCTTGAACCCGATNTCCCGATNT303013-15 bp13-15 bp284284ss 32 32（rpoHrpoH）TTGACATTGACATATAATTATAAT10010016-18 bp16-18 bp330330ss S S（rpoSrpoS）CTAAACTAAAGCCGATAAGCCGATAA404015 bp15 bp239239ss F F
8、（rpoFrpoF）GAAGAAYCTGAYCTGA202016 bp16 bp202202ss E E（rpoErpoE）22173173ss FecI FecI（fecIfecI）TGNCTGTGNCTGCGTCTTCGTCTT15 bp15 bp1 1A A 原核生物基因表达的启动开关原核生物基因表达的启动开关 枯草杆菌中存在着大约二十类不同的启动子，其枯草杆菌中存在着大约二十类不同的启动子，其中有些隶属于正常的生理代谢基因，有些则隶属于噬中有些隶属于正常的生理代谢基因，有些则隶属于噬菌体感染、孢子生成、次级代谢过程中的相关基因。菌体感染、孢子生成、次级代谢过程中的相关基因。 b 枯草杆
9、菌启动子的多样性在在SPO1SPO1噬菌体感染过程中的噬菌体感染过程中的RNARNA聚合酶及其聚合酶及其s s因子因子 SPO1 SPO1噬菌体感染枯草杆菌后，噬菌体感染枯草杆菌后，早期基因早期基因表达；表达；4-54-5分钟后，分钟后，中期中期基因表达基因表达，早期基因关闭；，早期基因关闭；8-128-12分钟后，分钟后，晚期基因晚期基因表达，中期基因关表达，中期基因关闭。早期基因的启动子由闭。早期基因的启动子由s s s s4343（即（即s s s sAA）识别启动，这是枯草杆菌细胞识别启动，这是枯草杆菌细胞内具有广泛生理生化功能的内具有广泛生理生化功能的s s s s因子，与大肠杆菌中
10、的因子，与大肠杆菌中的s s s s7070同源，组成同源，组成a a a a22b bb bb bb bs s s s4343型型RNARNA聚合酶聚合酶，转录中期基因表达所需的转录中期基因表达所需的s s s s因子编码基因因子编码基因gpgp2828。中期基因的启动子由中期基因的启动子由s s s sgp28gp28识别启动，它与枯草杆菌的核心酶构识别启动，它与枯草杆菌的核心酶构成成a a a a22b bb bb bb bs s s sgp28gp28型型RNARNA聚合酶全酶聚合酶全酶，负责转录晚期基因表达所需的负责转录晚期基因表达所需的s s s s因子因子编码基因编码基因gpgp
11、3333和和gpgp3434。晚期基因的启动子由晚期基因的启动子由s s s sgp33gp33和和s s s sgp34gp34识别启动，识别启动，分别构成分别构成RNARNA聚合酶全酶聚合酶全酶a a a a22bbbbbbbbs s s sgp33gp33和和a a a a22bbbbbbbbs s s sgp34gp34。SPO1SPO1噬菌体基因表噬菌体基因表达的级联调控模式达的级联调控模式通过更换不同的通过更换不同的s s s s因子，因子，识别并作用于不同基因识别并作用于不同基因的启动子，最终导致这的启动子，最终导致这些基因有次序地级联表些基因有次序地级联表达。前一基因编码后一达
12、。前一基因编码后一基因表达所需的基因表达所需的s s s s因子。因子。s s4343s s2828s s2828s s33 / 34 33 / 34 早期基因早期基因中期基因中期基因晚期基因晚期基因（Lewins Lewins GENESGENES X 2010 X 2010）枯草杆菌的孢子生成过程枯草杆菌的孢子生成过程 枯草杆菌在对数生长阶枯草杆菌在对数生长阶段结束后，培养基中营养物段结束后，培养基中营养物质耗尽，这时便启动孢子生质耗尽，这时便启动孢子生成过程：先是成过程：先是DNADNA复制，隔复制，隔膜形成，孢衣合成，母体裂膜形成，孢衣合成，母体裂解，孢子释放。最后在细胞解，孢子释放。
13、最后在细胞内约内约40%40%的的mRNAmRNA是孢子生是孢子生专一性的。专一性的。对数生长期细菌对数生长期细菌基因组复制基因组复制隔膜形成隔膜形成DNADNA转位至前孢转位至前孢孢衣形成孢衣形成母细胞裂解，孢子释放母细胞裂解，孢子释放（Lewins Lewins GENESGENES X 2010 X 2010）枯草杆菌孢子形成过程中的枯草杆菌孢子形成过程中的RNARNA聚合酶及其聚合酶及其s s因子因子 当环境压力（例如营养成份枯竭）时，枯草杆菌细胞内发生一连当环境压力（例如营养成份枯竭）时，枯草杆菌细胞内发生一连串的磷酸基团传递反应，最终导致转录调控因子串的磷酸基团传递反应，最终导致转
14、录调控因子Spo0ASpo0A的的磷酸化。磷磷酸化。磷酸化了的酸化了的Spo0ASpo0A同时启动两种不同操纵子的转录，分别表达出同时启动两种不同操纵子的转录，分别表达出s s s sproEproE和和s s s sFF。s s s sFF一方面启动一方面启动s s s sGG的表达，另一方面又表达的表达，另一方面又表达SpoIIRSpoIIR，后者再激活隔后者再激活隔膜结合型蛋白膜结合型蛋白SpoIIGASpoIIGA，活化了的活化了的SpoIIGASpoIIGA将母体细胞中表达的将母体细胞中表达的s s s sproEproE裂解为有活性的裂解为有活性的s s s sEE；而在前孢区域内
15、产生的而在前孢区域内产生的s s s sEE均被前孢特有的蛋白酶均被前孢特有的蛋白酶摧毁殆尽。母体细胞中摧毁殆尽。母体细胞中s s s sEE的活性是激活前孢区域的活性是激活前孢区域s s s sGG所必需的（通过所必需的（通过SpoIIASpoIIA和一种未知蛋白因子）；而和一种未知蛋白因子）；而s s s sGG的活性又能产生一种信号，跨隔的活性又能产生一种信号，跨隔膜激活母体细胞中的膜激活母体细胞中的s s s sKK。即：即：s s s sFF s s s sEE s s s sGG s s s sKK 。枯草杆菌孢子枯草杆菌孢子子交叉激活子交叉激活形成过程中两形成过程中两条途径的条途
16、径的 s s因因s s s sFFs s s sEEs s s sGGs s s sKK激活激活表达表达前孢区前孢区母细胞母细胞Spo0ASpo0ASpo0ASpo0As s4343s s4343s sFFs sproEproEs sEEs sGGs sproKproK隔膜隔膜SpoIIRSpoIIRSpoIIGASpoIIGASpoIIASpoIIAs sKK5 h5 h5 h5 h打开打开262262个基因个基因打开打开7575个基因个基因打开打开4848个基因个基因打开打开8181个基因个基因SpoIVBSpoIVB枯草杆菌各类枯草杆菌各类s s因子识别启动子的序列偏好性因子识别启动子的
17、序列偏好性 Science Science 335 335 20122012 19 bp19 bps sAAssBB18 bp18 bps sDD15 bp15 bp15 bp15 bpssHHs sLL13 bp13 bpssWWssFF17 bp17 bp17 bp17 bps sGGs sEE14 bp14 bp13 bp13 bps sKK1 1A A 原核生物基因表达的启动开关原核生物基因表达的启动开关 链霉菌启动子的结构具有很大的离散性，通过对链霉菌启动子的结构具有很大的离散性，通过对100100多个启动子多个启动子序列的比较，可将链霉菌启动子分成三大类：序列的比较，可将链霉菌启动
18、子分成三大类： c 链霉菌启动子的多样性 具有典型原核生物启动子具有典型原核生物启动子-10-10区区和和-35-35区区特征的启动子，仅占特征的启动子，仅占21%21% 具有典型原核生物启动子具有典型原核生物启动子-10-10区区而无保守的而无保守的-35-35区区的启动子的启动子 既无典型原核生物启动子既无典型原核生物启动子-10-10区区又无保守的又无保守的-35-35区区的启动子的启动子1 1A A 原核生物基因表达的启动开关原核生物基因表达的启动开关 天蓝色链霉菌（天蓝色链霉菌（Streptomyces Streptomyces coelicolorcoelicolor）的全基因组中
19、存在多达）的全基因组中存在多达6565种不同的种不同的s s s s因因c 链霉菌启动子的多样性s ss s6666（hrdBhrdB） 链霉菌最重要的链霉菌最重要的s ss s因子，因子，hrdhrdBB-突变是致死性的。突变是致死性的。hrdhrdBB基因全程基因全程表达，称为表达，称为看家基因看家基因。s ss sWhiGWhiG（whiGwhiG） 链霉菌次级代谢基因转录所需的链霉菌次级代谢基因转录所需的s s s s因子。因子。s ss sFF链霉菌孢子生成基因转录所需的链霉菌孢子生成基因转录所需的s s s s因子。因子。s ss sBldNBldN（bldNbldN）链霉菌气生菌
20、丝发育基因转录所需的链霉菌气生菌丝发育基因转录所需的s ss s因子。因子。s ss sRR（sigRsigR）链霉菌响应氧化压力基因转录所需的链霉菌响应氧化压力基因转录所需的s ss s因子。因子。s ss sEE（sigEsigE）链霉菌感应细胞膜完整性功能所需的链霉菌感应细胞膜完整性功能所需的s s s s因子。因子。子，其中已被鉴定的有：子，其中已被鉴定的有：1 1B B 真核生物多转录因子的协同作用真核生物多转录因子的协同作用 真核生物尤其是高等真核生物（哺乳动物）由于真核生物尤其是高等真核生物（哺乳动物）由于其其细胞的高度分化，决定了基因转录调控机制的复杂性。细胞的高度分化，决定了
21、基因转录调控机制的复杂性。 与原核生物不同，与原核生物不同，哺乳动物细胞内共有三大类哺乳动物细胞内共有三大类RNARNA聚合聚合酶酶系统，它们均由多系统，它们均由多转录因子转录因子构成，识别三大类真核生构成，识别三大类真核生物的启动子，分别承担物的启动子，分别承担rRNArRNA、mRNAmRNA、tRNAtRNA的转录。的转录。所有三种所有三种RNARNA聚合酶均由聚合酶均由8-148-14个亚基组成，个亚基组成，500500kDkD，但但它们并不能单独启动基因的转录。它们并不能单独启动基因的转录。1 1B B 真核生物多转录因子的协同作用真核生物多转录因子的协同作用启动子由两部分元件构成。
22、启动子由两部分元件构成。a RNA聚合酶 I 启动转录的程序 RNARNA聚合酶聚合酶 I I 定位于定位于核仁核仁，负责转录，负责转录rRNArRNA编码基编码基因。因。RNARNA聚合酶聚合酶 I I 只作用于一种类型的启动子，这类只作用于一种类型的启动子，这类高等真核生物高等真核生物 I I 型启动子的结构型启动子的结构结构基因结构基因I I 型启动子型启动子转录起始位点转录起始位点上游启动子元件（上游启动子元件（UPEUPE）核心启动子核心启动子GCGC丰富区丰富区GCGC丰富区丰富区增强启动效果增强启动效果启动基因转录启动基因转录CCT TCCGCCGA AGTCGGTCGNNNNN
23、NNNTNNNNNNTGGGCCGCCGGGGGCCGCCGG 人类的这两个重复序列具有人类的这两个重复序列具有85%85%的同原性的同原性I I 型启动子介导型启动子介导rRNArRNA基因转录的启动过程基因转录的启动过程RNARNA聚合酶聚合酶 I I 在在 I I 型启动子型启动子处的定位需要两种转录因子处的定位需要两种转录因子并经历三个阶段：并经历三个阶段：UBF1UBF1（UPEUPE结合因子）结合因子）装配因子装配因子SL1SL1（四聚体核心结合因子）四聚体核心结合因子）定位因子定位因子其中之一为其中之一为 TBPTBPUBF1SL1起始位点起始位点核心启动子核心启动子上游启动子元
24、件（上游启动子元件（UPEUPE）Pol IUBF1UBF1结合在启动子的结合在启动子的UPEUPE处处SL1SL1结合在结合在核心启动子核心启动子处处Pol IPol I 加入加入TBP1 1B B 真核生物多转录因子的协同作用真核生物多转录因子的协同作用 RNARNA聚合酶聚合酶 II II 定位于核内定位于核内，负责转录，负责转录mRNAmRNA的前体的前体分子分子hnRNAhnRNA。 RNARNA聚合酶聚合酶 II II 及其作用的及其作用的 II II 型启动子是型启动子是真核生物细胞中最广泛最典型最重要的转录启动元件。真核生物细胞中最广泛最典型最重要的转录启动元件。b RNA聚合
25、酶 II 启动转录的程序高等真核生物高等真核生物 II II 型启动子的结构型启动子的结构结构基因结构基因II II 型启动子型启动子转录起始位点转录起始位点启动子附加区启动子附加区TATA BOXTATA BOX转录的启动效率转录的启动效率转录因子和转录因子和RNA pol II RNA pol II 识别位点识别位点转录的时空特异性转录的时空特异性启动基因转录启动基因转录转录起始子转录起始子 InrInr核心启动子核心启动子高等真核生物高等真核生物 II II 型启动子的结构型启动子的结构结构基因结构基因II II 型启动子型启动子转录起始位点转录起始位点启动子附加区启动子附加区TATA
26、BOXTATA BOXInrInrOCT BOXOCT BOXATTTGCATATTTGCAT单向性单向性Oct Oct 因子激活因子激活GC BOXGC BOXGGGCGGGGGCGG双向性双向性SP1 SP1 因子激活因子激活CAAT BOXCAAT BOXGGCCAATCTGGCCAATCT双向性双向性CTF/NF1 CTF/NF1 因子激活因子激活上述附加区元件并不一定同时存在，而且在间隔、排列顺序、拷贝上述附加区元件并不一定同时存在，而且在间隔、排列顺序、拷贝数上均有很大的可变性。数上均有很大的可变性。高等真核生物高等真核生物 II II 型启动子的结构型启动子的结构结构基因结构基因
27、II II 型启动子型启动子转录起始位点转录起始位点启动子附加区启动子附加区TATA BOXTATA BOXInrInr TATA BOX TATA BOX 位于位于 -25 -25区，普遍存在于所有的真核生物细胞中，由区，普遍存在于所有的真核生物细胞中，由八对碱基组成，两侧为八对碱基组成，两侧为GCGC碱基对。少数不含碱基对。少数不含TATA BOXTATA BOX 特征结构的特征结构的启动子成为启动子成为 TATA-less TATA-less 启动子。启动子。RNARNA聚合酶聚合酶 II II 与转录因子复合物与转录因子复合物装配因子装配因子TF II A B E F H JTF II
28、 A B E F H J RNA RNA聚合酶聚合酶 II II 本身由本身由10-1210-12个亚基组成个亚基组成 ，这些亚基具有类似这些亚基具有类似于于原核细菌原核细菌RNARNA聚合酶中聚合酶中a a a a、b b b b、b b b b 亚基的功能，但同样不能识亚基的功能，但同样不能识别启别启动子。对动子。对启动子的专一性识别由若干的启动子的专一性识别由若干的一般转录因子一般转录因子负责。这负责。这些一些一般转录因子分为两大类：般转录因子分为两大类：装配因子装配因子和和定位因子定位因子。 定位因子定位因子聚合酶聚合酶 II IITBP TAFTBP TAFa a a a22bbbb
29、bbbb s s s s 因子因子真核生物：真核生物： 原核生物：原核生物： II II 型启动子介导的基因型启动子介导的基因转录启动过程转录启动过程各种一般转录因子和各种一般转录因子和RNARNA聚合酶聚合酶 II II 严格按照既定的顺序严格按照既定的顺序依 次依 次结合在结合在DNADNA及其蛋白复合物上，每种一般及其蛋白复合物上，每种一般转录因子的加入均使转录因子的加入均使DNA-DNA-蛋白质复蛋白质复合物的空间构象发生一次改变，而合物的空间构象发生一次改变，而这种构象变化又是下一轮的转录因这种构象变化又是下一轮的转录因TATAStartpointTFII DTAFsTBPTFII
30、ATFII BTFII FPol IITFII JTFII HTFII E子加入所必需的。子加入所必需的。启动子校对转录启动流产转录加固II II 型启动子介导的基因转录启动过程型启动子介导的基因转录启动过程TFTFIIIIH H是唯一一种具有是唯一一种具有多重独立酶活性的一般多重独立酶活性的一般转录因子，其酶活性包转录因子，其酶活性包括括ATPATP酶、双向解旋酶酶、双向解旋酶以及使以及使RNARNA聚合酶聚合酶II II尾尾部部CTDCTD结构域磷酸化的结构域磷酸化的磷酸激酶磷酸激酶。RNARNA聚 合聚 合酶酶II II一旦被磷酸化，所一旦被磷酸化，所有的一般转录因子便从有的一般转录因子
31、便从转录起始复合物上剥落转录起始复合物上剥落下来，转录由起始阶下来，转录由起始阶TFII JTFII HPPPP段转换到延伸阶段。段转换到延伸阶段。TFII F / Pol IIRNARNA聚合酶聚合酶 II II 在近启动子处暂停介导的转录延伸调控机制在近启动子处暂停介导的转录延伸调控机制 以以RNARNA聚合酶聚合酶 II II 为核心的转为核心的转录因子复合物在录因子复合物在 II II 型启动子处装型启动子处装配完毕后，转录启动。但随后的配完毕后，转录启动。但随后的转录进程并非像人们想象的那么转录进程并非像人们想象的那么一帆风顺。事实上在很多果蝇和一帆风顺。事实上在很多果蝇和哺乳动物的
32、基因中，刚刚启动转哺乳动物的基因中，刚刚启动转录的录的RNARNA聚合酶聚合酶 II II 会在转录起始会在转录起始位点下游位点下游25-5025-50个碱基处个碱基处停顿停顿下下来。一些蛋白因子促进来。一些蛋白因子促进RNARNA聚合酶聚合酶 II II 快速进入停顿位点，而快速进入停顿位点，而NELFNELF（负（负延伸因子）和延伸因子）和DSIFDSIF因子因子则起到稳定处于停顿状态的聚合酶则起到稳定处于停顿状态的聚合酶 II II 的作用。的作用。快速进入停顿位点快速进入停顿位点慢速逃离停顿位点慢速逃离停顿位点RNARNA聚合酶聚合酶 II II 在近启动子处暂停介导的转录延伸调控机制
33、在近启动子处暂停介导的转录延伸调控机制RNARNA聚合酶聚合酶 II II 从停顿位点逃离的先决从停顿位点逃离的先决条件是一些能促进其逃离的蛋白因子的条件是一些能促进其逃离的蛋白因子的出现。这些因子将出现。这些因子将正转录延伸因子正转录延伸因子b b（P-TEFbP-TEFb）招募至）招募至RNARNA聚合酶聚合酶 II II 处，处，并使并使NELFNELF磷酸化。被磷酸化的磷酸化。被磷酸化的NELFNELF从从RNARNA聚合酶聚合酶II II上解离，后者得以逃离，上解离，后者得以逃离，新近的果蝇全基因扫描研究表明，新近的果蝇全基因扫描研究表明，三分三分之一以上的基因在转录起始后能产生短之
34、一以上的基因在转录起始后能产生短小的小的RNARNA序列，表明这种启动子邻近区序列，表明这种启动子邻近区的的RNARNA聚合酶聚合酶IIII停顿是控制转录输出的停顿是控制转录输出的普遍战略。（普遍战略。（Science Science 327327，20102010）转录加速；反之转录将缓慢进行。转录加速；反之转录将缓慢进行。1 1B B 真核生物多转录因子的协同作用真核生物多转录因子的协同作用 RNARNA聚合酶聚合酶 IIIIII 定位于核内定位于核内，负责转录，负责转录tRNAtRNA和和小分子小分子 核内核内RNARNA（snRNAsnRNA）。）。相应的相应的 III III 型启动
35、子有两种类型：型启动子有两种类型： tRNA tRNA编码基因所属的启动子称为编码基因所属的启动子称为内源型启动子内源型启动子； snRNA snRNA编码基因所属的启动子称为编码基因所属的启动子称为外源型启动子外源型启动子；c RNA聚合酶 III 转录启动的程序高等真核生物高等真核生物 III III 型启动子的结构型启动子的结构结构基因结构基因IIIIII 型内源型启动子型内源型启动子转录起始位点转录起始位点BOX ABOX ABOX CBOX CBOX ABOX ABOX BBOX BPSEPSEOCTOCTPol III Pol III 结合区结合区结合区结合区IIIIII 型外源型
36、启动子型外源型启动子转录起始位点转录起始位点结构基因结构基因III III 型启动子介导的型启动子介导的tRNA/snRNAtRNA/snRNA基因基因转录启动过程TFIIIB由TBP和另外两种蛋白因子组成，其功能相当于定位因子；TFIIIA和TFIIIC属于装配因子。boxAboxAboxCboxCboxAboxAboxBboxB（1 1型）型） 转录起始位点转录起始位点TFIIIATFIIIATFIIICTFIIICTFIIIATFIIIATFIIICTFIIICTFIIICTFIIICTFIIIATFIIIATFIIICTFIIICTFIIICTFIIICTFIIIBTFIIIBTFII
37、IBTFIIIBRNA Pol IIIRNA Pol IIIRNA Pol IIIRNA Pol IIITFIIIBTFIIIBTFIIIBTFIIIB（22型）型） 转录起始位点转录起始位点1 1B B 真核生物多转录因子的协同作用真核生物多转录因子的协同作用 由此可见，由此可见，TBPTBP是所有三种类型的是所有三种类型的RNARNA聚合酶转录聚合酶转录系统所必需的。在含有系统所必需的。在含有TATA BOXTATA BOX的启动子中，的启动子中，TBPTBP特特异性地结合在异性地结合在DNADNA的相应区域；在的相应区域；在TATA lessTATA less 型型启动子启动子中，中，T
38、BPTBP与其它蛋白因子协同作用，结合在与其它蛋白因子协同作用，结合在DNADNA的特定的特定区域内。区域内。 1 1C C 原核生物的原核生物的RNARNA结构调控结构调控 RNA RNA的结构调控是一种转录启动后的基因表达调控方的结构调控是一种转录启动后的基因表达调控方式，其主要形式表现为转录的式，其主要形式表现为转录的终止终止与与抗终止抗终止作用。作用。 a RNA转录的终止作用 原核细菌拥有两种机制终止原核细菌拥有两种机制终止RNARNA聚合酶的转录，它们聚合酶的转录，它们分别称为分别称为顺式终止顺式终止和和反式终止反式终止。 介导转录顺式终止的内源性终止子介导转录顺式终止的内源性终止
39、子 内源性终止子结构的组内源性终止子结构的组成为富含成为富含GCGC碱基的发夹结构碱基的发夹结构以及下游的寡聚以及下游的寡聚U U链链（通常通常是是6 6个个U U）。它们由）。它们由DNADNA上的上的终止子序列终止子序列编码，出现在转编码，出现在转55 A U C G CA U C G CA UA UA UA UU AU AC GC GC GC GC GC GG CG CA UA UA UA UA UA UC GC GA GA GG CG CU AU AU AU AC UC UC GC GG CG CG CG CGGAAGGUUAAG UG URNARNA聚合酶聚合酶U U U U U U
40、U U U U U U 33 录中的录中的RNARNA结构中。结构中。 真核生物的转录终止机真核生物的转录终止机制也与顺式终止相似。制也与顺式终止相似。 AAGGUUA A UU介导转录反式终止的介导转录反式终止的RhoRho因子依赖性终止子因子依赖性终止子 基因转录的反式终止多见于噬菌体中。终止位点为基因转录的反式终止多见于噬菌体中。终止位点为CUUCUU中的某个中的某个碱基，其上游碱基，其上游 50-90 50-90 bp bp 的的序列中无茎环发夹结构，但碱基组成特殊：序列中无茎环发夹结构，但碱基组成特殊：C C 41%41%，G 14%G 14%，A 25%A 25%，U 20%U 2
41、0%。在这种。在这种RhoRho（r r）因子专一性识别因子专一性识别的终止子结构内，若缺失若干个的终止子结构内，若缺失若干个C C，甚至一个甚至一个C C，便会导致不能终止的便会导致不能终止的RNARNA聚合酶聚合酶RhoRho因子识别结合区因子识别结合区55 AUAUCCGGCCUAUACCCCUUCCAUAUAUAUCCCCGGCCAACCCCUUCCCCUUCCAAAAAACCGGCCUAUACCCCUUCCGAGACCCCAGAAAGGAGAAAGGCCGUGUCCUUCUUCUU 33 现象发生。现象发生。反式终止的机制反式终止的机制 RhoRho因子呈六聚体，具有因子呈六聚体，具
42、有ATPaseATPase活性。活性。当当RNARNA聚合酶转录出富含聚合酶转录出富含CC的的RhoRho因子识别位点时，因子识别位点时，RhoRho因子便与转因子便与转录出的录出的RNARNA链链结合；结合； Rho Rho因子沿因子沿RNARNA链向链向RNARNA聚合酶聚合酶方向移动，由于其移动速度快于方向移动，由于其移动速度快于RNARNA聚合酶，因此当聚合酶，因此当RNARNA聚合酶转录出终聚合酶转录出终止位点止位点CUUCUU时，时，RhoRho因子正好赶上；因子正好赶上； Rho Rho因子水解因子水解ATPATP释放能量，拆释放能量，拆开开DNA-RNADNA-RNA杂合链，转
43、录遂终止。但杂合链，转录遂终止。但若在若在RhoRho因子与因子与RNARNA聚合酶之间存在聚合酶之间存在着核糖体，则着核糖体，则RhoRho因子不能终止转录因子不能终止转录CUUCUURhoRho因子因子1 1C C 原核生物的原核生物的RNARNA结构调控结构调控b RNA转录的抗终止作用 在某些特殊条件下，由在某些特殊条件下，由RNARNA聚合酶引导的转录并不能聚合酶引导的转录并不能在终止子处顺利终止，这种现象称为在终止子处顺利终止，这种现象称为“转录过头转录过头”，其发，其发生生 RNA RNA的结构调控是一种转录启动后的基因表达调控方的结构调控是一种转录启动后的基因表达调控方式，其主
44、要形式表现为转录的式，其主要形式表现为转录的终止终止与与抗终止抗终止作用。作用。 机制是细胞内的转录机制是细胞内的转录抗终止抗终止作用。作用。细菌衰减子依赖性的转录抗终止作用细菌衰减子依赖性的转录抗终止作用UUGGGGUUGGGGCCGGCCAACCUUUUCCCCUUGGAAAACCCC55 AACCUUAAUUGGUUGGAACCGGGGGGUUCCAAAAUUGGCCGGUUAAAAAAGGCCAAAAUUCCAAGGAAUUAACCCCCCAAGGCCCCCCGGCCCCUUCCGGGGGGCCGGGGAAUUUUAAAAUUUUUUUUUUUUUU 33 UUGGGGUUGGGGCC
45、GGCCAACCUUUUCCCC55 UUGGAAAAAACCAAUUGGUUGGAACCGGGGUUGGGGAAUUAACCCCCCAAGGCCCCCCGGCCCCUUUUAACCGGAAAAAAGGCCAAAAUUCCAAUUCCCCAAGGCCUUAAAAUUGGAAGGUUCCGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUCC 33 另一个则位于正另一个则位于正常的基因编码区常的基因编码区下游。细胞内条下游。细胞内条件的变化，可使件的变化，可使基因的转录在两基因的转录在两个顺式终止子结个顺式终止子结构的某一个处终构的某一个处终止。这种结构称止。这种结构称某些细菌的结某些细菌的结构基因含有构基
46、因含有两两个顺式终止子个顺式终止子，其中其中一个一个位于位于基因上游的编基因上游的编码 区 内 ，码 区 内 ，为为衰减子衰减子。相互转换相互转换细菌衰减子的转录抗终止机制细菌衰减子的转录抗终止机制大肠杆菌的色氨酸操纵子中含有大肠杆菌的色氨酸操纵子中含有一个一个衰减子衰减子结构结构。在基因的。在基因的5 5端端编码区有两个连续排列的编码区有两个连续排列的色氨酸色氨酸密密码子码子。当细胞内。当细胞内色氨酸匮乏时色氨酸匮乏时核糖体在核糖体在色氨酸密码子处暂停翻色氨酸密码子处暂停翻译，衰减子的译，衰减子的2 2链链和和3 3链链形成双链形成双链结构，第一个终止子结构不能形结构，第一个终止子结构不能形
47、成，转录继续进行；成，转录继续进行；当细胞内当细胞内色色氨酸充足时，翻译不在氨酸充足时，翻译不在色氨酸密色氨酸密码子处停止，结果产生终止子结码子处停止，结果产生终止子结构，转录遂终止。构，转录遂终止。噬菌体抗终止因子依赖性的转录抗终止作用噬菌体抗终止因子依赖性的转录抗终止作用 大肠杆菌大肠杆菌 l l 噬菌体噬菌体早早期基因和早期基因的表达产物往往是晚期早早期基因和早期基因的表达产物往往是晚期基因表达的调控因子基因表达的调控因子。早早期基因表达产物的调控机制有两种：早早期基因表达产物的调控机制有两种： 一是作为一是作为 s s 因子因子识别早期基因和晚期基因启动子，启动表达这两识别早期基因和晚
48、期基因启动子，启动表达这两组基因；二是作为转录组基因；二是作为转录抗终止因子抗终止因子，使宿主细胞的，使宿主细胞的RNARNA聚合酶转聚合酶转录过头，导致早期基因和晚期基因的表达。这两种方式均为正调录过头，导致早期基因和晚期基因的表达。这两种方式均为正调控作用。控作用。噬菌体抗终止因子的作用噬菌体抗终止因子的作用 大肠杆菌大肠杆菌l l噬菌体感染大噬菌体感染大肠杆菌后，在肠杆菌后，在P PLL启动子的介启动子的介导导下表达出抗终止因子下表达出抗终止因子N N蛋蛋白，它以一种独特的方式使白，它以一种独特的方式使阻止阻止RhoRho因子的转录终止作因子的转录终止作用，使早早期基因转录过头用，使早早
49、期基因转录过头并转录出早期基因的并转录出早期基因的mRNAmRNA N N蛋白的半衰期只有五蛋白的半衰期只有五分钟，它决定了早期基因表分钟，它决定了早期基因表达周期的长短。达周期的长短。ttL1L1ttR1R1PPLLPPRRNNcrocro左向转录单位左向转录单位右向转录单位右向转录单位抗终止因子抗终止因子 NNttL1L1ttR1R1抗终止因子的工作原理抗终止因子的工作原理 大肠杆菌大肠杆菌 l l 噬菌体的抗噬菌体的抗终止因子终止因子N N特异性识别早早特异性识别早早期基期基因内部的因内部的nutnut位点，并且位点，并且在在RNARNA聚合酶到达这里时与聚合酶到达这里时与之结合，形成复
50、合物。这种之结合，形成复合物。这种复合物能有效抑制复合物能有效抑制RhoRho因子因子的结合作用，从而干扰的结合作用，从而干扰RhoRho因因子介导的转录终止效应，子介导的转录终止效应，导导致早早期基因的转录过头致早早期基因的转录过头 Q Q因子以类似的机制使因子以类似的机制使得早期基因转录过头。得早期基因转录过头。启动子启动子终止子终止子RNARNA聚合酶聚合酶nut nut 位点位点r r 因子因子NusB NusB / / NusENusENusA NusA NusGNusGNNCGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCACGCTCTTANNNNNNNNNAGC
51、CCTGAAPuAAGGGCAGCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyTTCCCGTGCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyTTCCCGT1 1D D 真核生物的真核生物的RNARNA剪切调控剪切调控 真核生物大多数的真核生物大多数的分裂基因分裂基因（即含有内含子的基因）在（即含有内含子的基因）在转录后必须切除内含子序列。正常剪切时，外显子的序列和转录后必须切除内含子序列。正常剪切时，外显子的序列和个数是恒定不变的；但有些基因的转录产物会出现个数是恒定不变的；但有些基因的转录产物会出现剪切多样剪切多样性性（另类剪切模式另类剪切模式），即一种基因转录物产生多种不同
52、的），即一种基因转录物产生多种不同的mRNAmRNA，其中包括外显子的缺失或内含子的保留。甚至在某，其中包括外显子的缺失或内含子的保留。甚至在某些细胞内，这些由于剪切多样性而产生的不同蛋白质会同时些细胞内，这些由于剪切多样性而产生的不同蛋白质会同时出现，并且均为细胞正常生物功能所必需。据统计，哺乳动出现，并且均为细胞正常生物功能所必需。据统计，哺乳动物体内表达的基因物体内表达的基因90%90%以上是被另类剪切的。以上是被另类剪切的。1 1D D 真核生物的真核生物的RNARNA剪切调控剪切调控a RNA前体的正常剪切与另类剪切内含子保留内含子保留55另类剪切另类剪切33另类剪切另类剪切外显子跳
53、越外显子跳越外显子相互排除外显子相互排除外显子组合选择外显子组合选择启动子另类剪切启动子另类剪切多聚尾另类剪切多聚尾另类剪切pApApApA1 1D D 真核生物的真核生物的RNARNA剪切调控剪切调控b RNA前体的另类剪切导致蛋白质功能的多样化CaMKIICaMKIIdd 基因基因E13E13E14E14E15E15E16E16E17E17ddA A 蛋白蛋白ddB B 蛋白蛋白ddC C 蛋白蛋白1 1D D 真核生物的真核生物的RNARNA剪切调控剪切调控c 黑腹果蝇性别决定与剪切多样性的关系 黑腹果蝇的性别决定过程由三个性别特异性的黑腹果蝇的性别决定过程由三个性别特异性的RNARNA
54、剪剪切程序支配，涉及到三个与性别决定有关的基因：切程序支配，涉及到三个与性别决定有关的基因：SxlSxltratradsxdsx果蝇胚胎性别决定的最初机制果蝇胚胎性别决定的最初机制 （PRINCIPLES OF GENETICSPRINCIPLES OF GENETICS，20102010）Sxl-RNASxl-RNAXXXXX X 染色体基因染色体基因常染色体基因常染色体基因XXYYX X 染色体基因染色体基因常染色体基因常染色体基因XXXX型胚胎型胚胎XYXY型胚胎型胚胎Sex-lethal gene Sxl X-linkedSex-lethal gene Sxl X-linked拮抗作用
55、拮抗作用Sxl Sxl 基因转录产物的另类剪切导致雌性细胞产生基因转录产物的另类剪切导致雌性细胞产生SXLSXL蛋白蛋白XXXX型胚胎型胚胎XYXY型胚胎型胚胎Sxl geneSxl genePPMMPPEEE2E2E3E3E4 - E8E4 - E8PPMMPPEEE2E2E3E3E4 - E8E4 - E8含终止密码子含终止密码子含终止密码子含终止密码子Pre-mRNAPre-mRNASxl-mRNASxl-mRNASXL proteinSXL proteinPre-mRNAPre-mRNASxl-mRNASxl-mRNASXL proteinSXL proteinNo functionN
56、o function由最初机制控制另类剪切由最初机制控制另类剪切随后由自身控制另类剪切随后由自身控制另类剪切tra tra 基因转录产物的另类剪切导致雌性细胞产生基因转录产物的另类剪切导致雌性细胞产生TraTra蛋白蛋白tra tra 基因基因雄性细胞雄性细胞 正常剪切正常剪切雌性细胞雌性细胞 另类剪切另类剪切E1E1E2E2E4E4E3E3TRATRA 200 aa 200 aaSXL蛋白在XX型胚胎（即未来的雌性个体）中的特异性产生，巩固了果蝇胚胎发育性别决定的基础。最新的体外实验结果（2011）也证实：SXL过量表达导致原始生殖细胞分化为卵细胞；而SXL表达抑制则使原始生殖细胞分化为精细
57、胞。Sxl蛋白含有高比例的Arg和Ser残基，类似于其它的RNA结合蛋白，是tra基因转录产物另类剪切的调控因子：No functionNo functionSXLSXL终止密码子终止密码子dsx dsx 基因转录产物的多样性剪切导致细胞产生基因转录产物的多样性剪切导致细胞产生DsxDsx两性蛋白两性蛋白与tra不同，另一个tra基因（tra2）的转录物只有一种剪切模式，因而在XX和XY两种类型的胚胎中，TRA2蛋白均存在。TRA和TRA2蛋白均含有剪切所必需的Arg-Ser型RNA结合结构域，它们共同调控位于常色体上的两性基因dsx（doublesex）转录物的剪切模式：dsx dsx 基因
58、基因雌性特异性蛋白雌性特异性蛋白雄性特异性蛋白雄性特异性蛋白E1E1E5E5E4E4E2E2E3E3E6E6TRA2TRA2TRA + TRA2TRA + TRA2终止密码子终止密码子dsx dsx 基因转录产物的多样性剪切导致细胞产生基因转录产物的多样性剪切导致细胞产生DsxDsx两性蛋白两性蛋白SxlSxltratratra2tra2dsxdsxSxl RNASxl RNAtra RNAtra RNAtra2 RNAtra2 RNAdsx RNAdsx RNASxl mRNASxl mRNAtra mRNAtra mRNAtra2 mRNAtra2 mRNAdsx mRNAdsx mRNA
59、转录转录剪切剪切翻译翻译XXXXXYXYSXLSXLDSXDSXTRATRATRA2TRA2雌性雌性蛋白蛋白雄性雄性蛋白蛋白雌性蛋白雌性蛋白阻遏雄性发育基因表达；阻遏雄性发育基因表达；雄性蛋白雄性蛋白阻遏雌性发育基因表达阻遏雌性发育基因表达1 1E E 原核生物反义原核生物反义RNARNA的调控的调控 反义反义RNARNA是指能与是指能与mRNAmRNA、DNADNA片段、片段、RNARNA引物互补的引物互补的RNARNA分子。通过与分子。通过与RNARNA引物、基因引物、基因DNADNA片段、片段、mRNAmRNA链的互补配对，链的互补配对，分别抑制基因的复制、转录、翻译过程。原核生物的反义
60、分别抑制基因的复制、转录、翻译过程。原核生物的反义RNARNA由由反义基因编码，其本身的转录可为蛋白因子启动转录而正调控；反义基因编码，其本身的转录可为蛋白因子启动转录而正调控；亦可由蛋白因子降解反义RNA而负调控。 反义反义RNARNA在原核生物中广泛存在，是一种较为普遍的基因表在原核生物中广泛存在，是一种较为普遍的基因表达调控方式。目前，根据反义达调控方式。目前，根据反义RNARNA原理设计的各类反义核酸，在原理设计的各类反义核酸，在实验生物学领域已被广泛用于基因表达的特异性阻遏剂；在医学实验生物学领域已被广泛用于基因表达的特异性阻遏剂；在医学药学领域也被用来治疗恶性肿瘤及病毒感染等疾病，
61、即反义技术。1 1E E 原核生物反义原核生物反义RNARNA的调控的调控a 反义RNA抑制DNA复制 直接抑制机理：直接抑制机理：反义反义RNARNA直接与直接与DNADNA的复制起始位点结合，阻的复制起始位点结合，阻 间接抑制机理：间接抑制机理：反义反义RNARNA与与RNARNA引物结合，使之不能与引物结合，使之不能与DNADNA复复制模板互补，从而间接影响制模板互补，从而间接影响DNADNA的复制。如大肠杆菌的复制。如大肠杆菌ColE1ColE1质粒的复质粒的复碍复制起始蛋白的识别与结合，导致碍复制起始蛋白的识别与结合，导致DNADNA复制不能启动。复制不能启动。制制、金黄色葡萄球、金
62、黄色葡萄球pT181pT181质粒的复制均采用这种机制。质粒的复制均采用这种机制。控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合orioriE.coli E.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制方向复制方向roprop（+ +）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533反义反义RNARNA间接间接抑制抑制ColEIColEI质粒的复制启动质粒的复制启动引物型引物型RNARNA调控型调控型RNARNA1 1E E 原核生物反义原核生物反义RNARNA的调控的调控b 反义RNA抑制基因转录P P 11P P 22反义反义RNARNA能以两
63、种不同的方式能以两种不同的方式改变编码在相反链上的基因的改变编码在相反链上的基因的转录；即转录；即转录干扰转录干扰和和转录衰减转录衰减转录干扰发生在从一个启动子转录干扰发生在从一个启动子反义反义RNARNA介导的转录干扰效应介导的转录干扰效应处起始的转录阻遏第二个启动子处起始的转录阻遏第二个启动子启动转录。例如，丙酮丁醇梭菌从启动转录。例如，丙酮丁醇梭菌从S-S-boxbox反义反义RNARNA的启动子处转录出的反义的启动子处转录出的反义RNARNA能阻断相反能阻断相反DNADNA链上编码的链上编码的操纵子操纵子ubiG-mccBAubiG-mccBA的转录启动。的转录启动。转录干扰转录干扰1
64、 1E E 原核生物反义原核生物反义RNARNA的调控的调控b 反义RNA抑制基因转录P P 11P P 22反义反义RNARNA也也可与可与靶靶mRNAmRNA的的55- -端端序列序列互补从而阻止互补从而阻止靶靶mRNAmRNA的的继续继续转录转录，使之产生非成熟，使之产生非成熟性的转录物（性的转录物（即即转 录 衰 减转 录 衰 减效效反义反义RNARNA介导的转录衰减效应介导的转录衰减效应应）。例如：大肠杆菌中的应）。例如：大肠杆菌中的tictic- -RNARNA（转录抑制互补性（转录抑制互补性RNARNA）可与）可与cAMPcAMP受体蛋白的受体蛋白的5 5端端mRNAmRNA区域
65、互补结合，形成特区域互补结合，形成特殊的空间结构迫使其转录殊的空间结构迫使其转录停止。停止。转录衰减转录衰减1 1E E 原核生物反义原核生物反义RNARNA的调控的调控c 反义RNA抑制mRNA翻译 反反义义RNARNA主主要要的的调调控控功功能能表表现现在在翻翻译译水水平平上上。原原核核生生物物的的研研究究已已经确定，反义经确定，反义RNARNA抑制翻译有下列三种作用方式：抑制翻译有下列三种作用方式：与与mRNAmRNA的的5 5 端端非非编编码码区区（5 5 -UTR-UTR）结结合合，阻阻碍碍其其在在核核糖体上的准确定位；糖体上的准确定位；与与mRNAmRNA的的5 5 端端编编码码区
66、区（主主要要是是起起始始密密码码子子AUGAUG）结结合合，抑制翻译的起始；抑制翻译的起始；与与mRNAmRNA全编码区全编码区结合，抑制其翻译模板的功能。结合，抑制其翻译模板的功能。大肠杆菌利用反义大肠杆菌利用反义基基大大肠肠杆杆菌菌的的ompompCC和和ompompF F基基因因编编码码外外膜膜蛋蛋白白，OmpCOmpC使使胞胞内内渗渗透透压压提提高高；OmpFOmpF使使胞胞内内渗渗透透压压降降低低。当当环环境境渗渗透透压压增增加加时时，膜膜蛋蛋白白EnvEEnvE激激活活胞胞内内的的OmpROmpR蛋蛋白白，后后者者诱诱导导ompompCC和和micmicF F两两个个基基因因转转录
67、录。micmicF F转转录录物物是是ompompF-F-mRNAmRNA的的反反义义RNARNA，它它能能灭灭活活 ompompF-mRNAF-mRNA， 从从 而而 降降 低低胞内胞内OmpFOmpF的浓度。的浓度。因调节细胞的渗透压因调节细胞的渗透压UUUUUU CUUUAUCCC-CAUUUGUCUGUAAGUCUUUACUUACUGCAUUAUUUAUUACUUUUUUU CUUUAUCCC-CAUUUGUCUGUAAGUCUUUACUUACUGCAUUAUUUAUUACUGACGGGCAGUGG-CAGGUG-UCAUAAA AUGACGGGCAGUGG-CAGGUG-UCAUAA
68、A AUGAGGGAGGUAAUAAAUAUAAUAAAUAAUGAUGAAUUUUGACAGAACUUAGACAGAACUUAAACCAACCAAAAAAUUUUAAAAGGCCGGCCCCGGUUGGUUAAAAUUCCGGGGCCGGCCUUUUUUUUCCAAGAGGGAGG：SDSD序列序列AAAUGAUG：起始密码子：起始密码子EnvEEnvEOmpROmpRmicFmicFompFompFompF ompF mRNAmRNAmicF micF RNARNA大肠杆菌利用反义大肠杆菌利用反义基基大肠杆菌的大肠杆菌的R1R1质粒上含有质粒上含有hokhok和和soksok基因。基因。h
69、okhok编码由编码由5252个氨基酸组成的个氨基酸组成的稳定的毒稳定的毒素蛋白，素蛋白，能能使细胞膜去极化使细胞膜去极化而杀死细胞。而杀死细胞。SokSok编码编码hokhok的的反义反义RNARNA。当细胞分裂时，。当细胞分裂时，如果子细胞没有分配到如果子细胞没有分配到R1R1质质粒，粒，HoKHoK蛋白就会杀死子细蛋白就会杀死子细因维持质粒的稳定性因维持质粒的稳定性细胞，因为亲本细胞中细胞，因为亲本细胞中SokSok转录出来的转录出来的反义反义RNARNA不稳定而被降解；如果子细胞分配到不稳定而被降解；如果子细胞分配到R1R1质粒，则质粒，则SokSok基因就能源源不断地为子细胞提供基因
70、就能源源不断地为子细胞提供反义反义RNARNA，以阻断半衰期较长的，以阻断半衰期较长的hok hok mRNAmRNA翻译出翻译出HoKHoK毒素蛋白，细胞得以存活。该毒素蛋白，细胞得以存活。该hokhok/ /soksok系统保证了系统保证了细菌品系的稳定性细菌品系的稳定性1 1E E 原核生物反义原核生物反义RNARNA的调控的调控d 反义技术在实验生物学和医学中的应用策略 受受反反义义RNARNA特特异异性性阻阻断断基基因因表表达达的的原原理理启启发发，人人们们利利用用生生物物合合成成甚甚至至化化学学合合成成的的方方法法，制制备备了了一一系系列列针针对对特特定定病病变变基基因因（如如癌癌
71、基基因因）或或病病原原体体基基因因的的反反义义试试剂剂或或反反义义药药物物，一一方方面面期期望望通通过过这这些些特特异异性性的的基基因因表表达达阻阻断断试试剂剂，体体内内探探查查特特定定基基因因的的功功能能（即即所所谓谓的的loss-of-loss-of-functionfunction战战略略）；另另一一方方面面也也希希望望能能利利用用这这些些反反义义药药物物对对付付日日趋趋严严重重的基因分子疾病和病毒感染疾病。的基因分子疾病和病毒感染疾病。由靶基因的反向表达体内生成相应的反义由靶基因的反向表达体内生成相应的反义RNARNA将靶基因的编码将靶基因的编码序列反向接在转序列反向接在转录起始位点的
72、下录起始位点的下游，转录出来的游，转录出来的RNARNA即为靶基因即为靶基因5533553355335533启动子启动子终止子终止子target GENEtarget GENEtarget GENEtarget GENEmRNAmRNAantisense RNAantisense RNA会降解会降解RNARNA。这种战略缺点在这种战略缺点在于：反义于：反义RNARNA分分子量大，容易引子量大，容易引起体内免疫攻击起体内免疫攻击另外，核酸酶也另外，核酸酶也的反义的反义RNARNA。人工设计合成修饰型的小分子反义人工设计合成修饰型的小分子反义RNARNA锁核酸锁核酸 LNALNA肽核酸肽核酸 PN
73、APNA核糖核酸核糖核酸 RNARNA人工设计合成修饰型的小分子反义人工设计合成修饰型的小分子反义RNARNARNARNASNASNA反义吗啉寡聚核苷酸反义吗啉寡聚核苷酸 anti-MO oligoanti-MO oligoRNARNA靶分子靶分子人工设计合成修饰型的小分子反义人工设计合成修饰型的小分子反义RNARNA1 1F F 真核生物真核生物sRNAsRNA介导的介导的RNARNA干扰干扰 RNA RNA分子在遗传信息从分子在遗传信息从DNADNA到蛋白质的传递过程中扮演着重到蛋白质的传递过程中扮演着重要的角色，但几十年来有关要的角色，但几十年来有关RNARNA的的消息只能听到微弱的声音
74、。近十消息只能听到微弱的声音。近十几年来接连不断的发现表明，一类被称为几年来接连不断的发现表明，一类被称为小小RNARNA（smallsmall RNAsRNAs）的物质操纵着很多生命过程。它们能改变基因的表达水平甚至关闭的物质操纵着很多生命过程。它们能改变基因的表达水平甚至关闭基因、编辑基因组、哄骗细胞形成特定的组织。因此该领域的研究基因、编辑基因组、哄骗细胞形成特定的组织。因此该领域的研究成果被成果被ScienceScience杂志连续两年（杂志连续两年（2001-20022001-2002）评为年度十大科）评为年度十大科成就之一。成就之一。1 1F F 真核生物真核生物sRNAsRNA介
75、导的介导的RNARNA干扰干扰a RNA干扰作用的发现 199 1993 3年，康奈尔大学的年，康奈尔大学的Su GuoSu Guo在用人工合成的反义在用人工合成的反义RNARNA阻断线虫阻断线虫基因表达的实验中偶然发现，反义基因表达的实验中偶然发现，反义RNARNA和正义和正义RNARNA都能阻断靶基因的表都能阻断靶基因的表达，他对这个结果百思不得其解。直到达，他对这个结果百思不得其解。直到19981998年，美国卡内基研究所的年，美国卡内基研究所的Andrew FireAndrew Fire用用确凿的实验结果证明，在正义确凿的实验结果证明，在正义RNARNA阻断基因表达的实验阻断基因表达的
76、实验中，真正起作用的是小分子的双链中，真正起作用的是小分子的双链RNARNA，它们是体外转录正义它们是体外转录正义RNARNA时生时生成的。上述双链成的。上述双链RNARNA对基因表达的阻断作用称为对基因表达的阻断作用称为RNARNA干扰干扰（RNAiRNAi）。）。随后大量的研究发现，随后大量的研究发现，RNAi RNAi 现象广泛存在于线虫、果蝇、斑马鱼、真现象广泛存在于线虫、果蝇、斑马鱼、真菌、植物、哺乳动物乃至人体内，它们借助于菌、植物、哺乳动物乃至人体内，它们借助于RNAi RNAi 抵御病毒的感染，抵御病毒的感染，阻断转座子的转座作用，以维持其基因组的相对稳定性。阻断转座子的转座作
77、用，以维持其基因组的相对稳定性。1 1F F 真核生物真核生物sRNAsRNA介导的介导的RNARNA干扰干扰a RNA干扰作用的发现RNARNA干扰干扰与先前所说的与先前所说的转录后转录后基因沉默基因沉默、转基因沉默转基因沉默等术语等术语都是一回事，但常与基因表达都是一回事，但常与基因表达的的反义抑制反义抑制相混淆。反义抑制相混淆。反义抑制过程并不涉及过程并不涉及mRNAmRNA的催化降的催化降解，只是单链反义解，只是单链反义RNARNA物理上物理上与与mRNAmRNA结合并阻断其翻译。结合并阻断其翻译。Andrew Fire Andrew Fire 和和 Craig MelloCraig
78、Mello因因他们关于线虫他们关于线虫RNARNA干扰的研究干扰的研究（19981998）而分享）而分享20062006年的诺年的诺贝尔生理学或医学奖。贝尔生理学或医学奖。b RNA干扰的作用机理 外源性的外源性的双链双链RNARNA，不管来自，不管来自病毒病毒RNARNA基因组的感染还是人工的基因组的感染还是人工的导入，均在细胞质中被导入，均在细胞质中被DicerDicer酶酶裁剪裁剪成成2 22 2-2-24 4bpbp的的短小双链片段短小双链片段，即即 small interfering RNAsmall interfering RNA（siRNAsiRNA），其其33端含有两个凸出的碱
79、基，负责端含有两个凸出的碱基，负责siRNAsiRNA的迁移和对靶序列的识别。的迁移和对靶序列的识别。在在RISCRISC复合物的协助下，双链复合物的协助下，双链siRNAsiRNA拆成单链，然后再与具有互拆成单链，然后再与具有互补序列的靶补序列的靶mRNAmRNA分子结合，形成分子结合，形成局部双链。后者或遭局部双链。后者或遭RNaseRNase的 降的 降解，或直接阻断靶解，或直接阻断靶mRNAmRNA的翻译。的翻译。AAGGOO 复合物复合物AAGGOO 复合物复合物1 1F F 真核生物真核生物sRNAsRNA介导的介导的RNARNA干扰干扰c 细胞内固有的miRNA 前已述及，前已述
80、及，siRNAsiRNA是由是由体外来源体外来源的双链的双链RNARNA经细胞内的经细胞内的DicerDicer酶加工酶加工的的sRNAsRNA被命名为：被命名为：microRNAmicroRNA（miRNAmiRNA）。）。 进一步的探索发现：进一步的探索发现：在动物、植物、真菌的细胞核内，从结构致密在动物、植物、真菌的细胞核内，从结构致密的的异染色质异染色质中心粒区域的中心粒区域的DNADNA重复序列上会转录出一些特殊的重复序列上会转录出一些特殊的RNARNA前体前体大分子，它们同样在类似蛋白因子的作用下，形成长度为大分子，它们同样在类似蛋白因子的作用下，形成长度为21-2321-23个碱
81、基个碱基的单链的单链s sRNARNA分子分子，并发挥特殊的生物学功能。这种细胞内编码的固有，并发挥特殊的生物学功能。这种细胞内编码的固有而成的。那么细胞内是否也存在着固有的而成的。那么细胞内是否也存在着固有的RNARNA类似物呢？类似物呢？miRNAmiRNA的形成的形成首先从异染色质中心粒区首先从异染色质中心粒区域的域的DNADNA重复序列上转录重复序列上转录出大分子的非编码型出大分子的非编码型RNARNA前体（前体（pri-miRNApri-miRNA），后），后者在核内被者在核内被微加工器复合微加工器复合物物（由（由RNaseIIIRNaseIII组成）先组成）先切成大约切成大约707
82、0个核苷酸的茎个核苷酸的茎环结构（环结构（pre-miRNApre-miRNA），），然后再被运输到细胞质中然后再被运输到细胞质中由由DicerDicer进一步裁剪，形成进一步裁剪，形成成熟的成熟的miRNAmiRNA分子，最后分子，最后再由几种因子装配而成。再由几种因子装配而成。ScienceScience 319, 1787, 2008 319, 1787, 2008miRNAmiRNA的生物功能的生物功能异染色质装配异染色质装配外成性修饰外成性修饰转录调控转录调控转录物剪切调控转录物剪切调控转录物稳定调控转录物稳定调控翻译抑制翻译抑制结构域构成结构域构成（Lewins Lewins GE
83、NES XGENES X 2010 2010）miRNAmiRNA介导的翻译抑制模式介导的翻译抑制模式AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGOAGORISCRISC：AGO AGO + + GW182GW182核糖体核糖体抑制翻译延伸抑制翻译延伸AAAAAAAAAAAAAAAGOAGOAAAA降解翻译产物降解翻译产物竞争帽子结构竞争帽子结构CapCap抑制核糖体装配抑制核糖体装配抑制抑制mRNAmRNA环化环化AGOAGOGW182GW182mRNAmRNA触发剪尾脱帽触发剪尾脱帽DCP2DCP2miRNAmiRNA1 1F F 真核生物真核生物sRNAsRNA介导的
84、介导的RNARNA干扰干扰d RNA干扰原理的应用 如果将外源的双链如果将外源的双链RNARNA导入细胞中，则双链导入细胞中，则双链RNARNA分子一方面在分子一方面在DicerDicer的作用下裂解的作用下裂解成成siRNAsiRNA；另一方面在以另一方面在以RNARNA为模板的为模板的RNARNA聚合酶聚合酶RdRPRdRP的作用下自身扩增，其扩增的作用下自身扩增，其扩增产物再被产物再被DicerDicer裂解成裂解成siRNAsiRNA。后者后者解链并与解链并与RISCRISC复合物一起作用于靶复合物一起作用于靶mRNAmRNA上，一方上，一方面使其降解，另一方面又以面使其降解，另一方面
85、又以siRNAsiRNA作为引物，作为引物，mRNAmRNA为模板，在为模板，在RdRPRdRP催化下合成出催化下合成出mRNAmRNA的互补链，结果的互补链，结果mRNAmRNA也变成了双链也变成了双链RNARNA。它在它在DicerDicer的作用下也同样被裂解成的作用下也同样被裂解成siRNAsiRNA。通过这种体内的通过这种体内的RNARNA聚合酶链式反应，细胞内的聚合酶链式反应，细胞内的siRNAsiRNA大大增加，显著增加大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。相关研究结果表明，从了对基因表达的抑制。相关研究结果表明，从21-2321-23个碱基的个碱基的siRNAsiRNA到几百碱
86、基对的双到几百碱基对的双链链RNARNA都能诱发都能诱发RNARNA干扰作用干扰作用，但长的双链，但长的双链RNARNA阻断基因表达的效果明显优于短的双阻断基因表达的效果明显优于短的双链链RNARNA。需要指出的是，人类和果蝇体内不存在需要指出的是，人类和果蝇体内不存在RdRPRdRP，故无法进行上述，故无法进行上述siRNAsiRNA扩增。扩增。1 1F F 真核生物真核生物sRNAsRNA介导的介导的RNARNA干扰干扰d RNA干预原理的应用上述上述RNARNA干扰原理在分子生物学研究领域中的用途包括：干扰原理在分子生物学研究领域中的用途包括：通过基因表达的特异性阻断作用，确定基因的功能
87、通过基因表达的特异性阻断作用，确定基因的功能通过基因表达的特异性阻断作用，实施基因治疗通过基因表达的特异性阻断作用，实施基因治疗然而，如何将特定的双链然而，如何将特定的双链RNARNA分子高效导入活细胞、活组织、活生分子高效导入活细胞、活组织、活生物个体中，并维持其稳定性，目前还是一个技术难题。物个体中，并维持其稳定性，目前还是一个技术难题。1 1F F 真核生物真核生物sRNAsRNA介导的介导的RNARNA干扰干扰e 生物体内的RNA世界RNARNA蛋白质编码型蛋白质编码型RNARNA非蛋白质编码型非蛋白质编码型RNARNArRNArRNAtRNAtRNAantisenseRNAantis
88、enseRNAsRNAsRNAmRNAmRNA结构型结构型sRNAsRNA调控型调控型sRNAsRNAsiRNA siRNA （外源型）（外源型）miRNAmiRNA（内源型）（内源型）piRNA piRNA （内源型）（内源型）（内源型）（内源型）ccatalyticatalytic RNA RNA（指导（指导RNARNA的剪切、编辑、修饰）的剪切、编辑、修饰）1 1GG 真核真核生物应答元件的转录调控生物应答元件的转录调控 a 真核生物转录的应答调控模型 结构基因结构基因应答元件应答元件转录起始子转录起始子核心启动子核心启动子转录启动转录启动信号分子信号分子转录调控因子转录调控因子转录因子
89、复合物转录因子复合物 / RNAPII/ RNAPII真核生物应答调控模型真核生物应答调控模型金属硫蛋白基因调控区的单基因多应答元件模型：金属硫蛋白基因调控区的单基因多应答元件模型：热休克蛋白基因调控区的多基因单应答元件模型：热休克蛋白基因调控区的多基因单应答元件模型：EEHSEHSEPPGENE AGENE AEEHSEHSEPPGENE BGENE B-20-20-40-40-60-60-80-80-100-100-120-120-140-140-160-160-180-180-200-200-220-220-240-240GREGREBLEBLEMREMREMREMREBLEBLETRE
90、TREBLEBLEMREMREGCGCMREMRETATATATASRSRAP2AP2AP2AP2AP1AP1SP1SP1MTF1MTF1RNA PolRNA Pol1 1GG 真核真核生物应答元件的转录调控生物应答元件的转录调控 b 真核生物应答元件的基本特征 DNADNA序列（顺式元件）序列（顺式元件） 含有较短的保守序列含有较短的保守序列位于启动子或增强子的上游或在其内部位于启动子或增强子的上游或在其内部与转录起始位点距离不固定，一般在与转录起始位点距离不固定，一般在200200bpbp内内 对相应的转录调控因子产生应答反应对相应的转录调控因子产生应答反应真核生物细胞中常见的应答元件真核
91、生物细胞中常见的应答元件热休克应答元件热休克应答元件HSEHSECNNGAANNTCCNNGCNNGAANNTCCNNGHSTFHSTF肾上腺皮质激素应答元件肾上腺皮质激素应答元件GREGRETGGTACAAATGTTCTTGGTACAAATGTTCTGRGR佛波醇应答元件佛波醇应答元件TRETRETGACTCATGACTCAAP1AP1血清应答元件血清应答元件SRESRECCATATTAGGCCATATTAGGSRFSRF应答元件应答元件元件简称元件简称保守序列保守序列作用因子作用因子金属应答元件金属应答元件MREMRETGCPuCNCTGCPuCNCMTF1MTF1WntWnt应答元件应答
92、元件WREWRECCTTTGWWCCTTTGWW（W=A/TW=A/T）TCFTCF1 1GG 真核真核生物应答元件的转录调控生物应答元件的转录调控 c 转录调控因子的作用机制 与与DNADNA应答元件结合应答元件结合 激活启动子和激活启动子和RNARNA聚合酶复合物聚合酶复合物DNADNA转录激活结构域转录激活结构域 ADADDNADNA结合结构域结合结构域 BDBDRNA Pol RNA Pol 复合物复合物转录起始位点转录起始位点TATA BOXTATA BOX与基因转录物结合与基因转录物结合 促进转录速度加快促进转录速度加快DNADNA转录激活结构域转录激活结构域 ADADRNARNA
93、结合结构域结合结构域 BDBD转录起始复合物转录起始复合物转录起始位点转录起始位点RNARNA正在转录的正在转录的RNARNA聚合酶聚合酶1 1GG 真核真核生物应答元件的转录调控生物应答元件的转录调控 d 转录调控因子的激活方式 无蛋白无蛋白蛋白表达蛋白表达异位同型蛋白异位同型蛋白 HBHB脱磷酸化脱磷酸化磷酸化磷酸化热休克转录调控因子热休克转录调控因子 HSTFHSTF磷酸化磷酸化脱磷酸化脱磷酸化转录调控因子转录调控因子 AP1 AP1 JunJun/FosFos无配体无配体配体结合配体结合甾体激素受体甾体激素受体 GRGR类别类别无活条件无活条件激活条件激活条件转录调控因子转录调控因子抑
94、制剂抑制剂去抑制剂去抑制剂NF-NF-kkB B 抑制剂抑制剂 I-I-kkBB构象构象AA构象构象BBMyoDMyoD/ID ID 更换亚基更换亚基1122334455661 1GG 真核真核生物应答元件的转录调控生物应答元件的转录调控 e 转录调控因子与miRNA的相互关系 转录转录调控调控因子（因子（TFsTFs）和微）和微RNARNA（miRNAsmiRNAs）是多细胞生物基因）是多细胞生物基因调控调控因子因子中最大中最大且最重要且最重要的两个反式作用家族，的两个反式作用家族，它们享它们享有共同的调控有共同的调控逻辑逻辑语言。语言。成套表达的成套表达的TFsTFs及及miRNAsmiR
95、NAs分别构成分别构成TFTF调控调控密码密码（TFTF codecode）及及miRNAmiRNA调控调控密码密码（miRNAmiRNA codecode），共同，共同精确精确决定决定了单个细了单个细胞的类型。胞的类型。迄今为止，共鉴定出迄今为止，共鉴定出转录转录调控调控因子因子大约大约15001500种，种，微微RNARNAMegha Ghildiyal Megha Ghildiyal & Phillip D. Zamore& Phillip D. Zamore，NatNat. . RevRev. . GenetGenet. . 1010，9494，20092009大约大约85008500种。种。Oliver Hobert Oliver Hobert et alet al. . ScienceScience 319319，17851785，20082008转录调控因子转录调控因子微微RNARNA特特 性性多效性多效性组合性组合性易感性易感性可控性可控性网络性网络性PP结构基因结构基因应答元件应答元件转录起始子转录起始子核心启动子核心启动子转录启动转录启动信号分子信号分子转录调控因子转录调控因子转录因子复合物转录因子复合物 / RNAPII/ RNAPII核膜核膜质膜质膜？ 细胞通讯
