线粒体疾病的分子生物学检验

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1、线粒体疾病的分子生物学检验Moleculardiagnosisformitochondrialrelateddisorders线粒体（Mitochondrion）21. 1. 真核细胞真核细胞中的细胞器，中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命，平均寿命1010天天2. 2. 多数细胞多数细胞含含几个到几个到几千个线粒体几千个线粒体3. 3. 每个线粒体含每个线粒体含2-10 2-10 线粒体线粒体DNADNA（mtDNAmtDNA）3线粒体功能Mitochondrial Disease.Chest 2001; 120:634648 ATP能量代谢能量代谢其他功能其他

2、功能 储存钙离子储存钙离子 调节膜电位并控制细胞程序性死亡调节膜电位并控制细胞程序性死亡 细胞增殖与细胞代谢的调控细胞增殖与细胞代谢的调控 合成胆固醇及某些合成胆固醇及某些血红素血红素 产热产热 Wikipedia线粒体病线粒体病 Mitochondrial disordersMitochondrial disorders发发现现- 1962 年， Lufe 等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢率，同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。直到1988年， Wallace 等报道了首例由线粒体 DNA突变引起的人类疾病，明确了mtDNA 突变可引起人类疾病。 定定义义- - 是

3、遗传缺陷引起线粒体异常，致使ATP合成障碍、能量来源不足等导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病。发病率发病率- - 约为1:5000（约每5000人中1人发病）Smeitink 2006线粒体病线粒体病 mitochondrial disordersmitochondrial disorders 是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病线粒体蛋白16,569 bp circular double stranded (mtDNA) 20%1,500 nuclear genes 80% structural protein of the OXPHOS complexes protein requ

4、ired for assembly of OXPHOS complexes proteins involved in mtDNA translation proteins involved in mtDNA maintenance proteins involved in mitochondrial fusion and fissionDouglas C. Wallace, 18171819Shoubridge, 2001; Schapira，2000进一步导致线粒体功能异常：底物的运输缺陷；底物的利用缺陷；柠檬酸循环异常；氧化磷酸化脱偶联；呼吸链异常。发病特点发病特点v 核基因突变常染色体隐

5、性、显性遗传或X-连锁遗传 v 线粒体基因突变母系遗传 （突变的mtDNA在母血增加，受累及的后代发病频率增加）mtDNA突变与临床表型之间关系复杂，主要表现为同一种mtDNA突变可以引发多种不同的疾病表型，而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导。遗传异质性婴幼儿起病较常见 编码线粒体结构蛋白的核基因突变编码线粒体结构蛋白的核基因突变进行性外眼肌麻痹（PEO）、线粒体神经肠胃脑肌病、Leigh氏综合征 线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白亚单位16(MRPS16)纯合突变，导致先天畸形伴张力衰

6、竭、四肢水肿、肝转氨酶活性升高并乳酸亚基中毒症， 该女婴在出生后3天死亡。核基因突变线粒体基因突变 突变的影响： 引起呼吸链功能缺陷 氧化磷酸化酶异常 阈值效应：组织特异性 突变的 mtDNA 在复制分离时可能不均等分配 母系遗传：不同突变后代发病风险不同。 相比A8344G突变，携带 A3243G 突变的母系后代更容易发病。 突变分布：同质性各器官组织分布相同 异质性不同组织、细胞分布不同 一般特点母系遗传 （Maternal Inheritance）11同质性突变与异质性突变12线粒体基因线粒体基因q同质性（同质性（Homoplasmy）q0或或100%q异质性（异质性（Heteropla

7、smy）q0-100%核基因核基因q纯合子（纯合子（Homozygous）q0或或100%q杂合子（杂合子（Heterozygous）q50%mtDNA同质性/异质性突变与阈值13线粒体基因突变点突变点突变 目前已报道的mtDNA 点突变将近330种，涉及mtDNA编码的各个基因，其中结构基因突变177种、tRNA基因突变137种、rRNA基因突变12种、D-Loop区突变2种 LHON、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征、肌阵挛癫痫、破碎红纤维病、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等重排重排 重排突变逾数百 遗传性痉挛性截瘫等 (http：/www.mitomap.org)线粒体疾病是复杂性疾

8、病遗传方式复杂遗传方式复杂q常染色体隐性遗传（常染色体隐性遗传（Autosomal RecessiveAutosomal Recessive）q常染色体显性遗传（常染色体显性遗传（Autosomal DominantAutosomal Dominant）q性连锁遗传（性连锁遗传（Sex linkedSex linked）q母系遗传（母系遗传（Maternally inheritedMaternally inherited）临床表型复杂临床表型复杂q累及多系统（累及多系统（Multisystemic involvementMultisystemic involvement）q影响几乎所有组织器官

9、（影响几乎所有组织器官（Any organ or Any organ or tissue can be affectedtissue can be affected） 15线粒体功能涉及众多的组织器官16线粒体病的共同临床特点l 婴儿期发病： 常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。l 儿童发病： 见于MELAS、MERRF、Leigh病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。l 中枢神经系统损害： 共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等l 周围神经损害： 交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征l 视听神经损害： 视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型 听力丧失

10、出现在KSSl 肌肉病 见于线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹见于KSS和PEO（高度临床变异性）Chinnery et al. Lancet 2000线粒体疾病的生化诊断线粒体疾病的生化诊断当患者基因当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。代谢产物分析代谢产物分析（血液、尿液、脑脊液等）（血液、尿液、脑脊液等）血液可以正常，但脑脊液多异常血液可以正常，但脑脊液多异常，（动脉比静脉好）；，（动脉比静脉好）；乳酸乳酸/丙酮酸比高丙酮酸比高(50:1)提示呼吸链受到阻断。提示呼吸链受到阻断。正常不除外线粒正常不除外线粒体疾病体疾

11、病。酶测定酶测定氧化磷酸化（氧化磷酸化（OXPHOS）系统的酶活性测定）系统的酶活性测定。（western、比色法等）、比色法等）方法不稳定方法不稳定一般情况下，一般情况下，血清血清CK（肌酸激酶）（肌酸激酶）正常或轻度升高正常或轻度升高；升高升高占占30%见于慢性进行性眼外肌麻痹；见于慢性进行性眼外肌麻痹；mtDNA丢失丢失时时非常高。非常高。J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-29219线粒体疾病的生化诊断线粒体疾病的生化诊断当患者基因当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。肌肉活检

12、肌肉活检线粒体病的肌肉病理改变特点：线粒体病的肌肉病理改变特点：（1）出现线粒体结构异常、）出现线粒体结构异常、细胞色素阴性肌纤维或细胞色素阴性肌纤维或破碎红破碎红纤维（纤维（RRF）为主要病理改变为主要病理改变。（2）上述病理改变出现的频率高。上述病理改变出现的频率高。（3）缺乏其他的肌肉病理改变。）缺乏其他的肌肉病理改变。J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292儿童及成人线粒体疾病的诊断标准儿童及成人线粒体疾病的诊断标准A A 符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现 如KSS、CPEO、MELAS、MERRF 等

13、； 多系统不明原因发病多系统不明原因发病 必须至少三个系统出现临床症状必须至少三个系统出现临床症状 除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能 排除其它代谢和非代谢疾病排除其它代谢和非代谢疾病B B 肌活检肌活检在骨骼肌中存在在骨骼肌中存在2%2%破碎样破碎样红肌纤维红肌纤维主要诊断标准(Bernier et al, 2002)(3, 5)21C C 有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现：5050岁以下肌活检岁以下肌活检COXCOX阴性肌纤维阴性肌纤维2%2%； 50 50岁以上肌活检岁以上肌活检COXC

14、OX阴性肌纤维阴性肌纤维55% %； 任一任一组织中呼吸链组织中呼吸链酶活性酶活性20%20%； 任一细胞系中呼吸链酶活性任一细胞系中呼吸链酶活性30%30%； 多于两组织内相同呼吸链酶活性多于两组织内相同呼吸链酶活性30%30%；主要诊断标准次要诊断标准：A症状符合线粒体脑肌病的临床表现；症状符合线粒体脑肌病的临床表现；至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现：至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现：30503050岁肌活检岁肌活检RRFRRF在在1%2%1%2%；30 30 岁以下肌活检出现岁以下肌活检出现RRFRRF；电镜下见广泛线粒体异常电镜下见广泛线粒体异常；B 至少一种呼吸链功能受抑

15、制的表现：至少一种呼吸链功能受抑制的表现：生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20%30%20%30%；用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少；(Bernier et al, 2002)(3, 5)次要诊断标准：C发现可能相关的发现可能相关的mtDNA异常异常；D 一种或多种氧化磷酸化受损的表现：一种或多种氧化磷酸化受损的表现：脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和( (或或) )丙氨酸增高；丙氨酸增高；若疑为若疑为KSSKSS，脑脊液蛋白质增高；，脑脊液蛋白质增高；PETPET或或31P-MRS31P-MRS证实肌肉

16、或脑代谢降低；证实肌肉或脑代谢降低；最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。(Bernier et al, 2002)(3, 5)u 符合以上符合以上2 2个主要诊断指标或个主要诊断指标或1 1个主要诊断指标及个主要诊断指标及2 2个次要个次要诊断指标的即为确诊线粒体病；诊断指标的即为确诊线粒体病；u 符合符合1 1个主要诊断指标及个主要诊断指标及1 1个次要诊断指标或至少个次要诊断指标或至少3 3个次要个次要诊断指标的为拟诊线粒体病；诊断指标的为拟诊线粒体病；u 符合符合1 1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备个主要诊断指标或在符合临床表现的基础

17、上还具备1 1个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292线粒体病诊断时应注意线粒体病诊断时应注意 基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活性等相结合活性等相结合 要区分病理性突变和正常衰老所致的线粒体基因突变要区分病理性突变和正常衰老所致的线粒体基因突变 线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系 散发与遗传的相关性散发与遗传的相关性 ，诊断是否遗传需排除环境、药物和

18、，诊断是否遗传需排除环境、药物和衰老等因素衰老等因素第一节 线粒体基因组与疾病q线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组及其表达系统qhttp:/www.mitomap.orghttp:/www.mitomap.orgq线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系q线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异与疾病2627q 人类线粒体基因组人类线粒体基因组Lightstrand:8tRNAand1mRNA(ND6)Heavystrand:14tRNA,2rRNA,and12mRNAPolycistronicwithposttranscriptionalprocessing

19、基因组小基因组小,仅仅16569bp双链环状双链环状DNA13结构基因结构基因/mRNA22tRNA基因基因2rRNA基因基因12SrRNA基因基因16SrRNA基因基因 非编码区非编码区D-loop（约约1120bp）L链链复制起始区复制起始区（约约3050bp，tRNAAsn-tRNACys）高突变率高突变率线粒体基因组及其表达系统ThetwostrandsofmtDNAaredifferentiatedbytheirnucleotidecontentwiththeguaninerichstrandreferredtoastheheavystrand,andthecytosinerichs

20、trandreferredtoasthelightstrand.Theheavystrandencodes28genes,andthelightstrandencodes9genesforatotalof37genes.Ofthe37genes,13areforproteins(polypeptides),22arefortransferRNA(tRNA)andtwoareforthesmallandlargesubunitsofribosomalRNA(rRNA).CategoryGenesNADH dehydrogenase(complex I)MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3

21、, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6Coenzyme Q - cytochrome c reductase/Cytochrome b(complex III)MT-CYBcytochrome c oxidase(complex IV)MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3ATP synthaseMT-ATP6, MT-ATP8Transportchain(13peptides)Manyofthegenesencodethetransportchain:2rRNAsMitochondrialrRNAisencodedbyMT-RNR1(12SrRNA)MT-R

22、NR2(16SrRNA).22tRNAsThefollowinggenesencodetRNA:AminoAcid3-Letter1-LetterMTDNAAlanineAlaAMT-TAArginineArgRMT-TRAsparagineAsnNMT-TNAsparticacidAspDMT-TDCysteineCysCMT-TCGlutamicacidGluEMT-TEGlutamineGlnQMT-TQGlycineGlyGMT-TGHistidineHisHMT-THIsoleucineIleIMT-TILeucineLeuLMT-TL1,MT-TL2LysineLysKMT-TKM

23、ethionineMetMMT-TMPhenylalaninePheFMT-TFProlineProPMT-TPSerineSerSMT-TS1,MT-TS2ThreonineThrTMT-TTTryptophanTrpWMT-TWTyrosineTyrYMT-TYValineValVMT-TVHV2HV1340731636516024ControlregionD-loop576ReplicationHuman mitochondrial DNA (mtDNA) has threepromoters,H1,H2,andL(heavystrand1,heavystrand2,andlightst

24、randpromoters).TheH1promotertranscribestheentireheavystrandandTheLpromotertranscribestheentirelightstrand.The H2 promoter causes the transcription of the twomitochondrialrRNAmolecules.Transcription The process of transcription initiation in mitochondria involves three types of proteins: 1.the mitoch

25、ondrial RNA polymerase (POLRMT), 2. mitochondrial transcription factor A (TFAM), 3. mitochondrial transcription factors B1 and B2 (TFB1M, TFB2M). condonAnti-condonNuclear tRNAMt-tRNAGCUGCCGCAGCGGGCUGCUGC第一节 线粒体基因组与疾病q线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组及其表达系统q线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系q线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异与疾

26、病43核基因组与线粒体基因组的相互作用44核基因组编码了核基因组编码了1500多个线多个线粒体蛋白粒体蛋白线粒体基因组只编码了线粒体基因组只编码了13条条多肽链多肽链“交叉对话（交叉对话（cross-talk）”机制机制第一节 线粒体基因组与疾病q线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组及其表达系统q线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系q线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异与疾病q线粒体基因组变异线粒体基因组变异q碱基突变碱基突变：点突变。其中结构基因的点突变，与核基点突变。其中结构基因的点突变，与核基因组一样，包括同义突变和错义突变因组一样，包括同义突变和错

27、义突变q缺失与插入缺失与插入：qmtDNAmtDNA拷贝数目突变拷贝数目突变：q线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异与疾病q耳聋耳聋，LeberLeber遗传性视神经病变遗传性视神经病变，糖尿病糖尿病，高血压，高血压，肿瘤肿瘤4546在线粒体相关疾病中常见的DNA点突变qMELASMELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：qA3243G (80%), T3271CA3243G (80%), T3271C（在（在tRNA tRNA Leu(UUR)Leu(UUR)基因）基因）qMERRFMERRF（肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维）：（肌阵挛

28、性癫痫伴破碎红纤维）： qA8344G (80%), T8356CA8344G (80%), T8356C（在（在tRNAtRNALysLys基因）基因）qLeberLeber视神经病（视神经病（LHONLHON）：）： qG11778AG11778A（在（在ND4ND4基因），基因），G3460AG3460A（在（在ND1ND1基因）基因）q耳聋（耳聋（DeafnessDeafness）: : qA1555G, T1494CA1555G, T1494C（在（在12S rRNA12S rRNA基因）基因）qA3243GA3243G（在（在tRNAtRNALeu(UUR)Leu(UUR)基因）基

29、因）q2 2型糖尿病（型糖尿病（Type 2 DiabetesType 2 Diabetes）: : qA3243GA3243G（在（在tRNAtRNALeu(UUR)Leu(UUR)基因）基因） qNARPNARP（共济失调伴色素性视网膜炎神经病）：（共济失调伴色素性视网膜炎神经病）：qT8993G, T8993CT8993G, T8993C（在（在ATPase 6 ATPase 6 基因）基因）线粒体病的分子诊断线粒体病的分子诊断标本选择：标本选择： 外周血白细胞外周血白细胞最常用最常用 毛发毛发 唾液唾液 尿液尿液 骨骼肌骨骼肌检测检测 mtDNAmtDNA分子诊断的最好标本分子诊断的最

30、好标本 检测检测已知已知DNADNA突变的方法：突变的方法： 等位基因特异性寡核苷酸杂交（等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASOASO） 等位基因特异性扩增（等位基因特异性扩增（ASAASA） 限制性片段长度多态性分析（限制性片段长度多态性分析（PCR-RLFPPCR-RLFP） 连接酶链反应（连接酶链反应（LCRLCR） 基因芯片技术基因芯片技术 检测检测未知未知DNADNA突变的方法：突变的方法： 单链构象多态性（单链构象多态性（PCR-SSCPPCR-SSCP） 变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DEEGDEEG） 异源双链分析（异源双链分析（HAHA） DNA DNA序列测序序列测序 变

31、性高效液相色谱（变性高效液相色谱（DHPLCDHPLC）分子诊断方法线粒体疾病中常见的突变q核基因突变（核基因突变（nuclear gene mutationsnuclear gene mutations）q氧化磷酸化系统由核基因编码的蛋白质氧化磷酸化系统由核基因编码的蛋白质, , 例如例如: Surf1, : Surf1, SCO2, NDUFV1, NDUFS1,etc.SCO2, NDUFV1, NDUFS1,etc.q呼吸链缺陷呼吸链缺陷: : 重复、缺失重复、缺失q线粒体线粒体DNADNA点突变（点突变（mtDNA point mutationsmtDNA point mutatio

32、ns）qLHON, MELAS, MERRF, NARP, etc.LHON, MELAS, MERRF, NARP, etc.qmtDNAmtDNA缺失缺失/ /重复（重复（mtDNA mtDNA Deletions/duplicationsDeletions/duplications） qeg. KSS, Pearson synd, diabetes & deafnesseg. KSS, Pearson synd, diabetes & deafnessq未知遗传（未知遗传（unknown inheritanceunknown inheritance）SchoolofLaboratoryM

33、edicine,WenzhouMedicalCollege49第二节 线粒体基因组与耳聋q与耳聋相关的与耳聋相关的mtDNAmtDNA突变突变q耳聋相关的耳聋相关的mtDNAmtDNA突变的检测突变的检测50q“千手观音千手观音” ” 2121位聋哑演员中位聋哑演员中 18 18人有药物史人有药物史q部分患者使用正常部分患者使用正常剂量也会致聋剂量也会致聋q“一针致聋一针致聋”现象现象突变位点突变位点基基因因同质性同质性/异质性异质性疾疾病病首次报道首次报道aT961delT+C(n)ins961insC12SrRNA同质性同质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Bacinoe

34、t al.(1995)Tanget al.(2002)T1095C12SrRNA同质性同质性/异质性异质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Thyagarajan et al. (2000)C1494T12SrRNA同质性同质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Zhao et al.(2004)A1555G12SrRNA同质性同质性/异质性异质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Prezant et al.(1993)G1606AtRNAVal异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Tiranti et al.(1998)A3243GtRNALeu(

35、UUR)异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋van den Ouweland,et al.(1992)G7444ACO1/tRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Pandya et al.(1999)A7445GCO1/tRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性非综合征型耳聋非综合征型耳聋Reid et al.(1994)7472insCtRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Tiranti et al.(1995)T7511CtRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性非综合征型耳聋非

36、综合征型耳聋Sue et al.(1999)T7512CtRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Nakamura et al.(1995)A8344GtRNALys异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Shoffner et al.(1990)G8363AtRNALys异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Santorelli et al.(1996)T14709CtRNAGlu同质性同质性综合征型耳聋综合征型耳聋Rigoli et al.(2001)G15927AtRNAThr同质性同质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Wang et al.(

37、2008)第二节 线粒体基因组与耳聋q与耳聋相关的与耳聋相关的mtDNAmtDNA突变突变q耳聋相关的耳聋相关的mtDNAmtDNA突变的检测突变的检测qPCR-RFLPPCR-RFLP技术技术qDHPLCDHPLC技术技术qDNADNA测序技术测序技术q基因芯片技术基因芯片技术53检测位点检测位点引物序列引物序列(53)退火温度退火温度() 产物长度产物长度(bp)A1555GC1494TCGATCAACCTCACCACCTCT58802TGGACAACCAGCTATCACCAA7445GACGCCAAAATCCATTTCACT58987CGGGAATTGCATCTGTTTTT54对对164

38、2例氨基糖苷类诱发的非功能性耳聋例氨基糖苷类诱发的非功能性耳聋汉族聋儿进行线粒体汉族聋儿进行线粒体12SrRNA变异检测变异检测J. Lu et al. / Mitochondrion.2010,10(4):38039055q12SrRNA基因中有基因中有68个核个核苷酸变异苷酸变异q所有的核苷酸变异均为同质性所有的核苷酸变异均为同质性q68个核苷酸变异中，有个核苷酸变异中，有3个个C1494Tq其余其余65个变异为个变异为A1555G565758第三节 线粒体与Leber遗传性视神经病变q与与 Leber Leber 遗传性视神经病变相关的遗传性视神经病变相关的 mtDNA mtDNA 突变

39、突变qLeber Leber 遗传性视神经病变相关的遗传性视神经病变相关的 mtDNA mtDNA 突变常用检突变常用检测技术测技术59LebersHereditaryOpticNeuropathy(LHON)LebersHereditary inherited from mitochondrial DNAOptic affects the eyeNeuropathy disease/abnormality of nervous systemqDegeneration of retinal ganglion cells and their axonsqInherited from matern

40、al mitochondrial DNAqOccurs during young adulthoodAcute Phase:qPainless, acute onset of central vision lossqLoss of visual acuity/colourqonce symptoms appear in one eye, other eye affected weeks laterSub acute Phase atrophy of optic disc legally blindAsymptomatic until visual blurring developsSignsa

41、ndSymptomsqMaternal inheritanceqMutation occurs in mitochondrial DNA (mtDNA)qOnly the egg contributes mtDNA to the embryoGenetics of LHONGenetics of LHON(1)G11778A:50-60%LHONpopulation(2)G3460A:8-25%LHONpopulation(3)T14484C:10%LHONpopulationSinglePointMutations3majorpathogenicmutations:G14459AT14484

42、CMalesvs.FemalesqLHON is predominant in malesqStudies looking at x-linkage have not been confirmed nor statistically significantEpidemiologyracedependent1177834601448470%Europeans90%Asians86%QuebecCanadiansDuetoFounderEffect（奠基者效应）（奠基者效应）Koreansqpresence of mixture of more than one type of organella

43、r genome ie mtDNAqNumerous cell divisions and thus lots of time is required for mutant alleles to be expressed in mitochondriaqSymptoms dont appear until adulthoodqAlso implicated as the reason for variability in severity of vision lossHeteroplasmyqPhotoreceptorsqInterneuronsqRGC(retinalganglialcell

44、s)qNeurons qAxons make up optic nerve RetinaqFire action potentialsqHuge ATP demandqVery sensitive to energy supply and mitochondria defectsqEspecially RGCs for central visual fieldqLimited regeneration abilitiesRGC:neuronsqOtherneuronsinthebodycanbeaffectedtoo(CNS+PNS)ThisresultsinLebersPlusMovemen

45、tdisordersTremorsCardiacconductiondefectsMS-like（多发性硬化样）多发性硬化样）featuresAllNeuronsareVulnerableATPDemandLeberOxidativePhosphorylatione-TransportChainROSReactiveO2SpeciesOxidativestressRGCComplex1e-prematurelyleaktoO2aka.NADHDehydrogenaseMitochondrialMatrixIntermembraneSpace3pointmutations4e-+4H+O22H2

46、Oe-+O2O2-LessATPLeberATPDemandOxidativePhosphorylatione-transportchainROSReactiveO2SpeciesOxidativestressMoreSuperoxideO2-RGCqLeber: oxidative stress + ATP deprivation qAtrophy: wearing away of tissue qChronic oxidative stress: Apoptosis (cell death)ThingsgowrongThelinkisimportant!qGenetic Testing f

47、or the maternally inherited mitochondrial DNA. qAvoid potential environmental precipitants such as tobacco and excessive alcohol.qAvoid medications which have been shown to induce the disease (Ethambutol乙胺丁醇乙胺丁醇, Chloramphenicol氯霉素氯霉素) qVision damage from degeneration of optic nerveqMaternally inher

48、ited through mtDNAq3 point mutationsqComplex I ROS (reactive oxygen species)qTreatmentqAntioxidantsqInhibit mitochondrial-dependent apoptosis突变位点突变位点基因基因同质性同质性/异质性异质性首次报道首次报道*G3316AND1同质性同质性Saillard et al.(2000)T3394CND1同质性同质性Hofmannet al.(1997)G3460A*ND1同质性同质性/异质性异质性Huoponenetal.(1991)C3497TND1同质性同

49、质性Kong et al.(2003）G3733AND1同质性同质性/异质性异质性Valentinoet al.(2004)C4171AND1同质性同质性/异质性异质性Kimet al.(2002)T4216CND1同质性同质性Torroniet al.(1994）A4435GtRNAMet同质性同质性Herrnstadtet al.（2002）G7444ACO同质性同质性Huoponenet al.（1993）T10663CND同质性同质性Brownet al.(1995)G11696AND4同质性同质性/异质性异质性Zhouet al.（2006）G11778A*ND4同质性同质性/异质性

50、异质性Wallaceet al.(1988)T12338CND4同质性同质性Wong et al.（2002）G14459AND6同质性同质性/异质性异质性Junet al.(1994)C14482G/AND6同质性同质性/异质性异质性Howellet al.(1998)T14484C*ND6同质性同质性/异质性异质性Johnset al.(1992)A14495GND6异质性异质性Chinnery et al.(2001)T14502CND6同质性同质性Ozawaet al.（1991）C14568TND6同质性同质性Wissingeret al.(1997)A14693GtRNAGlu同质

51、性同质性/异质性异质性Tzen et al.（2003）A15951GtRNAThr同质性同质性Liet al.（2006）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege79q原发性突变：原发性突变：G3460A，G11778A，T14484C的突变，占的突变，占全部全部LHON的的80-90q继发性突变：继发性突变：T3394C，T4216C，C4019T，G5244A，C4777T，G9438A，G13708A，G15257Aq新新突变：突变：A4435Gq位于位于tRNAMet基基因因q可以可以调节调节ND4G11778A突变突变的的外显

52、率外显率与与LeberLeber遗传性视神经病变相关的遗传性视神经病变相关的mtDNAmtDNA突变突变80A4435G可以调节可以调节ND4G11778A突变突变的外显率的外显率tRNAMetSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege第三节 线粒体与Leber遗传性视神经病变q与与LeberLeber遗传性视神经病变相关的遗传性视神经病变相关的mtDNAmtDNA突变突变qLeberLeber病变相关的病变相关的mtDNAmtDNA突变常用检测技术突变常用检测技术qPCR-RFLPPCR-RFLP技术技术qPCR-SSCPPCR-SSCP

53、技术技术qDHPLCDHPLC技术技术qDNADNA测序技术测序技术SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege81G3460A，G11778A，T11484C原发性突变测序图原发性突变测序图第四节 线粒体与糖尿病q线粒体糖尿病线粒体糖尿病q美国糖尿病协会美国糖尿病协会(1997)/(1997)/世界卫生组织世界卫生组织(1999)(1999)制定了新制定了新的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于殊类型糖尿病，属于细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约细胞功能遗传缺陷型糖尿病，

54、约占糖尿病总数的占糖尿病总数的1 13 3q据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患病率为病率为2.96%2.96%q线粒体线粒体DNADNA突变与糖尿病突变与糖尿病q线粒体糖尿病的检验诊断线粒体糖尿病的检验诊断SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege82第四节 线粒体与糖尿病q线粒体糖尿病线粒体糖尿病q线粒体线粒体DNA突变与糖尿病突变与糖尿病q线粒体糖尿病的检验诊断线粒体糖尿病的检验诊断SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalColleg

55、e83线粒体线粒体DNADNA突变与糖尿病突变与糖尿病突变位点突变位点累及基因累及基因同质性同质性/ /异质性异质性疾病疾病首次报道首次报道C1310T12SrRNA同质性同质性糖尿病临床表型糖尿病临床表型Guanetal.(2010)A1438G12SrRNA同质性同质性糖尿病临床表型糖尿病临床表型Vawteretal.(2009)A3243G*tRNALeu(UUR)异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Vandenetal.(1992)C3254AtRNALeu(UUR)异质性异质性妊娠糖尿病妊娠糖尿病Ngetal.(2000)T3264CtRNALeu(UUR)异质性异质性糖尿病糖尿

56、病Matsuokaetal.(1997)T3271CtRNALeu(UUR)异质性异质性糖尿病糖尿病Jakschetal.(1995)G3316AMT-ND1同质性同质性非胰岛素依赖性糖尿病非胰岛素依赖性糖尿病Ogiharaetal.(1995)T3394CMT-ND1同质性同质性非胰岛素依赖性糖尿病非胰岛素依赖性糖尿病Wallaceetal.(1995)T3398CMT-ND1同质性同质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Jakschetal.(1995)A3399TMT-ND1同质性同质性妊娠糖尿病妊娠糖尿病Ngetal.(2000)T4291CtRNAIle同质性同质性糖尿病临床表型糖尿病临床

57、表型Liftonetal.(2004)A4833GMT-ND2同质性同质性非胰岛素依赖性糖尿病非胰岛素依赖性糖尿病Onayaetal.(2000)A7472CtRNASer(UCN)同质性同质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Hannaetal.(2005)A8296GtRNALys同质性同质性/异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Ohsawaetal.(1998)A10398GMT-ND3同质性同质性2型糖尿病型糖尿病Katoetal.(2003)A12026GMT-ND4同质性同质性糖尿病糖尿病Onayaetal.(1998)C12258AtRNASer(AGY)异质性异质性糖尿病合并耳聋

58、糖尿病合并耳聋Turnbulletal.(1998)T14709C*tRNAGlu同质性同质性/异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Moraesetal.(1995)T16189CMT-DLOOP同质性同质性2型糖尿病型糖尿病Poultonetal.(1998)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege8485携带tRNA Leu(UUR) A3243G突变的糖尿病家系SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege86399bp307bp92bpMUn-cut143B43B12A3243

59、G为异质性突变为异质性突变RFLPDNASequencingDHPLCControlA3243GA3242GWTSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege87携带tRNAGly T10003C突变的糖尿病家系 SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege88tRNAGlyT10003C为同质性突变为同质性突变SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege89AtRNAGly/tRNAstRNAThr/tRNAsSchoolofLaborat

60、oryMedicine,WenzhouMedicalCollege90SecondarystructureoftRNASecondarystructureoftRNAGlyGlySecondarystructureoftRNASecondarystructureoftRNALeu(UUR)Leu(UUR)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege91SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege第四节 线粒体与糖尿病q线粒体糖尿病线粒体糖尿病q线粒体线粒体DNADNA突变与糖尿病突变与糖尿病

61、q线粒体糖尿病的检验诊断线粒体糖尿病的检验诊断qPCRPCR技术技术q正向引物（正向引物（F F）：）：5-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-35-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3q反向引物（反向引物（R R）：）：5-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-35-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3 q扩增片段扩增片段398 bp398 bp（315331533551bp3551bp）qDHPLCDHPLC技术技术qPCR-RFLPPCR-RFLP技术技术qDNADNA测序技术测序技术SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMed

62、icalCollege92分子诊断研究分子诊断研究 （A3243GA3243G异质性分析）异质性分析）收收集集病病人人外外周周血血抽提抽提DNADNAPCR扩增目的片段扩增目的片段 PCR-RFLP测序验证测序验证RT-ARMs-qPCR（amplificationrefractorymutationsystem）Pyrosequencing（焦磷酸测序）（焦磷酸测序） TargetedNext-GenerationSequencing二代测序二代测序High-throughputsequencing实例母系遗传糖尿病家系母系遗传糖尿病家系注：母系成员共注：母系成员共2424人，其中糖尿病患者

63、为人，其中糖尿病患者为1010人。人。相应相应PCRPCR产物经普通测序验证：产物经普通测序验证：MIDD 母系遗传母系遗传性糖尿病伴性糖尿病伴耳聋耳聋(maternallyinheriteddiabetesanddeafness):PCR-RFLP图图 含含mtDNA 3243 PCRmtDNA 3243 PCR产物的限制性内切酶（产物的限制性内切酶（ApaIApaI）酶切结果图）酶切结果图mtDNA 3243 mtDNA 3243 异质性突变检测结果异质性突变检测结果M：DNAmarker；Lane1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17：mtDNA3243异质性突变

64、；异质性突变；Lane4、5、14、15：mtDNA3243未突变；未突变；限制酶限制酶Apa的酶切位点的酶切位点(GGGCCC),由于由于该突变为该突变为异质性突变异质性突变,故应该会故应该会出现出现553、423、130bp共共3条条条条带带;而野生型而野生型没有没有Apa的酶的酶切位点切位点,故故电泳只能电泳只能看到长度看到长度为为553bp的的1条片段条片段引物引物可以覆盖整个线粒体DNA基因组（3组）PCRPCR产物产物 富集过程基因组基因组DNADNA文库文库高通量捕获测序 TargetedNext-GenerationSequencing探针应用技术平台应用技术平台Illumin

65、a GAllX 作为新一代分子生物学综合 技 术 平 台 ， Genome Analyzer测序技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等工作，具有高准确性，高通量，高灵敏度，低运行成本等突出优势，是目前市场占有率最高的第二代高通量基因测序仪。Next Generation Sequencing (NGS)测序深度测序深度（deepdeep）：是是指指测测序序得得到到的的总总碱碱基基数数与与待待测测基基因因组组大大小小的的比比值值。假假设设一一个个基基因因大大小小为为2M2M，测测序序深深度度为为10X10X，那那么么获获得得的的总总数数据据量量为为20M20

66、M。Next Generation Sequencing (NGS)覆盖覆盖度（度（coveragecoverage）：指指测测序序获获得得的的序序列列占占整整个个基基因因组组的的比比例例。由由于于基基因因组组中中的的高高GCGC、重重复复序序列列等等复复杂杂结结构构的的存存在在，测测序序最最终终拼拼接接组组装装获获得得的的序序列列往往往往无无法法覆覆盖盖有有所所的的区区域域，这这部部分分没没有有获获得得的的区区域域就就称称为为GapGap。例例如如一一个个细细菌菌基基因因组组测测序序，覆覆盖盖度度是是98%98%，那么还有那么还有2%2%的序列区域是没有通过测序获得的。的序列区域是没有通过测

67、序获得的。Read Read ：高通量测序平台产生的序列标签高通量测序平台产生的序列标签线粒体DNA序列：16.6kb 3243位点捕获到两种碱基A/Gsupport=6758（A）/903（G）结果分析heteroplasmy mutant=11%高通量捕获测序检测结果：高通量捕获测序检测结果：表 MIDD家系A3243G突变异质性水平检测结果Step1 and Step2:Step3 and Step4；Step5：PyrosequencingDNA聚合酶荧光素酶双磷酸酶硫酸化酶PyrosequencingTM焦磷酸测序技术是一种基于四种酶（DNA聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶）的级

68、联反应来进行定量序列分析的技术。在整个反应体系中，以PCR产物的一条单链为模板，与测序引物退火结合后，按照事先计算好的顺序将四种dNTP依次加到样品中。双峰焦磷酸测序焦磷酸测序Qiagen PyroMark Q24 QIAGEN公司最新的PyroMark Q24焦磷酸测序仪，采用成熟的焦磷酸测序技术，是集测序、样品制备、试剂和对照以及完整和灵活的软件于一体的系统。 不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素。不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素。 10 10分钟可分析分钟可分析9696个样品的个样品的SNPSNP，可满足高通量分析的要求；，可满足高通量分析的要求； 每个样

69、品孔都可进行独立的测序或每个样品孔都可进行独立的测序或SNPSNP分析，实验设计灵活。分析，实验设计灵活。 序列分析简单，结果准确可靠。序列分析简单，结果准确可靠。特点特点MIDD家系家系A3243G突变异质性水平检测值突变异质性水平检测值（%）焦磷酸测序II6II8II10II11III1III10III12III13III15III16III17III19III20IV1IV2IV614.215.216.2- -11.224.920.520.530.632.938.928.3-54.7焦磷酸测序结果：焦磷酸测序结果：表 MIDD家系A3243G突变异质性水平检测结果RT-ARMs-qPCR

70、编号 mtDNA A3243G异质突变水平（%）野生型突变型II62.13E+063.60E+0514.46II82.24E+062.87E+0511.36II102.04E+064.67E+0518.63II119.27E+052.44E+020.00III11.40E+053.08E+010.00III101.44E+061.64E+0510.22III121.83E+064.91E+0521.15III131.57E+063.51E+0518.27III151.66E+063.94E+0519.18III161.76E+068.98E+0533.45III191.34E+067.11E+0534.67III201.60E+061.06E+0639.8512.66E+046.62E+000.0025.59E+052.33E+020.0066.16E+051.29E+0667.6871.58E+062.05E+0656.47精确定量精确定量A3243G异质异质水平水平同时计同时计算拷贝数。算拷贝数。A3243G突变携带者线粒体拷贝与正常人拷贝数相比较是减少的，且其差异有统计学意义。突变负荷=突变型拷贝数/（突变型拷贝数+野生型拷贝数）