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1、科内讲课要点科内讲课要点PPTPPT课课件件一、基因体外扩增n是指体外无细胞的分子克隆或酶促扩增。 以 DNA 或RNA 分子为模板，在引物诱导下，根据碱基配对原则， 利用反应体系中的 dNTPs 为原料，酶促合成新的DNA序列，使基因拷贝数得以增多的技术。2024/8/122基因体外扩增方法n聚合酶链式反应（PCR）n以PCR技术为基础的相关技术（逆转录PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR、原位PCR、单细胞PCR等）n实时PCRnPCR产物分析n2024/8/123（一）（一）PCR技术技术2024/8/124PCR（polymerase chain reaction）n聚合酶链式反
2、应： 指利用模板 DNA、RNA 为指导，在引物引导下， DNA 聚合酶促化合成、扩增 DNA 序列的技术。又称体外分子克隆。2024/8/125PCR反应原理uPCR 技术的原理类似于 DNA 天然复制过程，其特异性依赖于靶细胞序列两端互补的寡核苷酸引物。uPCR有变性退火延伸三个基本反应步骤构成。2024/8/126PCR反应反应原理原理n(1)n(2)n(3)n(1)n模板模板DNA变性变性n模板与引物的退火（复性）模板与引物的退火（复性）n引物的延伸引物的延伸n模板模板DNA变性变性nTaqDNAndNTPs2024/8/127PCR反应体系的组成反应体系的组成: 引物引物 酶酶 dN
3、TPdNTP 模板模板 MgMg2+2+ 探探针针2024/8/128引物：引物：n引引物物是是 P PC CR R 特特异异性性反反应应 的的关关键键， P PC CR R 产产物物的的特特异异性性取取决决引引物物与与模模板板 D DN NA A 互互 补补 的的 程程 度度 。nPCRPCR引物的要求：引物的要求： 片段特异、长度、片段特异、长度、 C CG%G%、浓度等。、浓度等。2024/8/129酶及其浓度：酶及其浓度：n两种Taq DNA聚合酶（Thermus Aquaticus）n从栖热水生杆菌中提纯的天然酶 n大肠菌合成的基因工程酶。n浓度：浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低
4、则合成产物量减少2024/8/1210dNTPsdNTPs：(A(A、C C、G G、T)T)ndNTPsdNTPs四种四种脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸是是DNADNA合成的基本原料合成的基本原料ndNTPdNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCRPCR扩增效率有密切关系。扩增效率有密切关系。n在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为5050200200 mol/L mol/L，浓度过低又，浓度过低又会降低会降低PCRPCR产物的产量太少，出现产物的产量太少，出现假阴性假阴性。2024/8/1211模板核酸：模板核酸：n模板核酸提取质量是模板核酸提取质量是PCRPCR成败与否的
5、关键成败与否的关键环节之一环节之一n提取效率提取效率n扩增效率扩增效率 n传统的传统的DNADNA纯化方法：纯化方法：n热裂解法热裂解法n蛋白酶消化法蛋白酶消化法2024/8/1212RNARNA模板：模板：nRNA模板提取一般采用： 异硫氰酸胍-氯仿-酚抽提法 蛋白酶K法-氯仿-酚抽提法n要防止RNase降解RNA： 干烤或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理2024/8/1213MgMg2+2+浓度：浓度：nMg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，其浓度高低直接影响着酶的活性与忠实性nMg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜，Mg 2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响nMg 2+浓度过
6、高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少2024/8/1214PCRPCR反应条件的选择反应条件的选择n缓冲液缓冲液: : pH pH 8.38.8 ，Tris-HClTris-HCl缓冲液缓冲液 1050mMol/LnPCR反应温度与时间反应温度与时间n循环次数循环次数2024/8/1215n三温度法：三温度法：n90 95（94 10S）变性变性 30sn40 60 （55 30S）退火，退火，30s1minn70 75 （72 40S ）延伸，延伸，12minn二温度点法二温度点法 n94变性（变性（ 94 5S ）n60左右退火与延
7、伸（左右退火与延伸（60 40S）温度与时间温度与时间2024/8/1216循环次数：循环次数：n循环次数决定循环次数决定PCRPCR扩增量。在其他参数都优化的条扩增量。在其他参数都优化的条件下，最适循环次数取决于件下，最适循环次数取决于靶序列的初始浓度靶序列的初始浓度。初。初始浓度较低时，要增加循环次数。始浓度较低时，要增加循环次数。酶的活性不好酶的活性不好或或量不足量不足时，也要增加循环次数，已达到有效扩增量。时，也要增加循环次数，已达到有效扩增量。n一般的循环次数选在一般的循环次数选在30304040次之间。次之间。n循环次数越多，循环次数越多，非特异性产物非特异性产物的量亦随之增多。的
8、量亦随之增多。2024/8/1217PCRPCR产物检测产物检测n n终点检测法（定性）终点检测法（定性） 凝胶电泳分析法凝胶电泳分析法 点杂交法点杂交法 微孔板夹心杂交法微孔板夹心杂交法 PCR-ELISAPCR-ELISAn n实时检测法实时检测法（定量定量） 2024/8/1218PCR扩增产物的电泳分析nPCR电泳法是科研不可缺少的手段电泳法是科研不可缺少的手段n琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳2024/8/1219琼脂糖凝胶电泳 1. 凝胶与电泳缓冲液凝胶与电泳缓冲液配制配制2.核酸电泳的指示剂与染色剂核酸电泳的指示剂与染色剂 溴酚兰溴酚兰 溴化乙锭染色法溴化乙锭染色法 3. 电泳：电
9、泳：4. 结果观察：结果观察： 紫外仪上观察电泳带及其位置，并与紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小核酸分子量标准比较被扩增产物的大小 2024/8/1220琼脂糖凝胶电泳条带2024/8/1221聚丙烯酰胺凝胶电泳 n聚丙烯酰胺凝胶的制备n电泳：电压为1-8V/cmn观察：浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，1530min后取出水洗紫外仪下观察结果2024/8/1222 PCR电泳法检测的局限性电泳法检测的局限性 n产物非杂交检测，产物非杂交检测，特异性差特异性差n开放操作，扩增产物（百万倍）气溶胶开放操作，扩增产物（百万倍）气溶胶的的污染问题突出污染问题突
10、出n非定量检测，无法观察疗效非定量检测，无法观察疗效n肉眼判读，人为误差（扫描）肉眼判读，人为误差（扫描）n溴化乙锭的致癌作用溴化乙锭的致癌作用2024/8/1223（二）实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR原理 n实时荧光定量PCR技术: 在PCR反应体系中加入荧光探针基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 2024/8/12252024/8/1226荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold = 10
11、 SDcycle 6-15 Ct 值的定义 n在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。nC代表Cycle，循环次数。t代表threshold，阈或界限之意。nCt值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。2024/8/12272024/8/1228Ct值与起始模板的关系 n每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。n利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。2024/8/1229 因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。2024/8/1
12、2302024/8/1231TaqMan荧光探针 nPCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。2024/8/1232n探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。n PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，荧光基团和淬灭荧光基团分离。n实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2024/8/1233注：探针完整时，报告基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收2024/8/1235PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解2024/8/1236荧光基团和淬灭荧光基团分离2024/8/1
13、237n每扩增一条DNA链， 就有一个荧光分子形成，2024/8/12382024/8/1239nPCR.swf原理原理flash 实时荧光定量PCR的特点n1.特异性强 FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。n2.灵敏度高 灵敏度可达到102拷贝，线性范围可到达102 108拷贝。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝。 2024/8/1240n3.重复性 FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的CT值相同，但其产物的荧光量却相差甚大。因为域值设置在指数扩增期，在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。 荧光
14、定量PCR的特点2024/8/1241n4.污染率小 全封闭的体系，有效地减小污染的机率。n5.方便、快速、准确 FQ-PCR周期短，自动化程度高，有非常严密的数学理论支持。 荧光定量PCR的特点2024/8/1242二、临二、临 床床 诊诊 断断 应应 用用治疗前治疗前选择治疗的人群选择治疗的人群选择治疗的时机选择治疗的时机选择治疗的方案选择治疗的方案治疗中治疗中 评价疗效、更换治疗方案、（评价疗效、更换治疗方案、（治疗终点的确定治疗终点的确定 ? ? ) )治疗后治疗后 疗效持久性评估、监测复发疗效持久性评估、监测复发临床病原体nHBVnHCVnHIVn结核病（TB）n巨细胞病毒（CMV）
15、n单纯疱疹病毒（HSV）性传播疾病1.沙眼衣原体（CT）2.淋球菌（NG）3.人乳头瘤病毒（HPV）4.解脲支原体（UU）性病PCR检测意义：常规的检测方法特异性不强，误诊率较高，而FQ-PCR具有快速、特异性强、敏感度高、无交叉反应等优点 ，有效地避免了假阴性假阳性的出现，结果真实可靠，具有指导意义。血液标本抗凝剂的选择n检测RNA病毒，由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果，应使用EDTA抗凝，严禁使用肝素。n检测DNA病毒一般用EDTA-K2/Na2或枸橼酸钠抗凝，不可使用肝素。标本为血清时，应及时分离出血清，提取病毒DNA进行检测。n应避免溶血，脂类可干扰PCR反
16、应 。采血管2024/8/1247 乙肝病毒（HBV）荧光定量 检测 FQ - PCR 可以对乙肝病毒DNA 进行准确定量，在乙肝的预防、诊断、治疗上都具有显著的优越性。2024/8/1248HBV DNA监测在长征之路中的作用慢性乙型肝炎核苷类似物应用路线图的中国临床应用慢性乙型肝炎核苷类似物应用路线图的中国临床应用n开始核苷类似物治疗开始核苷类似物治疗 n 2424周周周周HBV DNA: HBV DNA: 更合理的疗效预测点更合理的疗效预测点更合理的疗效预测点更合理的疗效预测点n n1212周周周周HBV DNA: HBV DNA: 评估治疗应答评估治疗应答评估治疗应答评估治疗应答nHB
17、V-DNA较基线下降较基线下降n n高度应答高度应答高度应答高度应答 n n2.0E2 IU/mL2.0E2 IU/mLn中度应答中度应答 n2.0E+2 IU/mL 2.0E+3IU/mLn n低度应答低度应答低度应答低度应答n n 2000IU/mL)建议加用其他有建议加用其他有效药物效药物继续治疗继续治疗继续治疗继续治疗每每每每3 3月监测一次月监测一次月监测一次月监测一次继续治疗继续治疗每每3月监测一次月监测一次52周时周时,如如果果200IU/mL继续单药治继续单药治疗疗52周时周时,如如200IU/mL建议建议加用其加用其他有效药物他有效药物52周时周时,如果如果103 copie
18、s/mL(200IU/mL)建议加用其建议加用其他有效药物他有效药物n乙肝病毒（HBV）荧光定量 检测丙肝病毒（HCV）荧光定量 检测慢性丙型肝炎的RGT治疗策略内标法在抗病毒治疗中的意义内标法在抗病毒治疗中的意义评价疗效更准确评价疗效更准确决定治疗方案决定治疗方案( (药物的剂量？单药还是联合？药物的剂量？单药还是联合？疗程？）疗程？）改变改变策略（停药？再联合？策略（停药？再联合？) )治疗终点的选择治疗终点的选择预测复发预测复发 53超敏感（超敏感（Hypersensitivity）nHBV最低检测限最低检测限10-15 IU/ml宽线性范围（宽线性范围（ wider dynamic r
19、ange ）n涵盖涵盖101109 IU/ml高特异性（高特异性（ High specificity）可重复性好（可重复性好（ Repeatability）n（操作简单，或可自动化）（操作简单，或可自动化）n国际乙肝治疗指南对国际乙肝治疗指南对HBV DNA定量定量PCR要要求求n治疗时间（周）pEVR误判为cEVR可能导致所谓的“复发率”升高0周周 12周周 24周周 48周周 (EOT) nHCV RNA (IU/mL)误判为误判为cEVR nHCV RNA下下降降值值2 log10 (IU/mL)72周周 (SVR) 终止治疗终止治疗 复发复发 n由于由于pEVR患者被误判为患者被误判为
20、cEVR，未延长疗程，导致出现所谓的未延长疗程，导致出现所谓的“复复发发”n国际标化检测限国际标化检测限 (50 IU/mL)n国内通用检测限国内通用检测限 (1000 cps/mL)n npEVR = pEVR = 部分应答部分应答部分应答部分应答 cEVR = cEVR = 完全应答完全应答完全应答完全应答n例如：例如：HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作载量检测在治疗优化路线图中的作用用n例如：例如：HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作载量检测在治疗优化路线图中的作用用HBV优化抗病毒治疗路线图2024/8/1258三、耐药突变检测n根据药物分子结构，目前应用的可分为n型核苷类（和）n型环戊烷（烯）类（）n无环磷酸盐类（和）2024/8/1261HBV耐药突变检测报告2024/8/1262谢谢大家！谢谢大家！结束结束
