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1、实验一实验一 蛋白质和氨基酸的蛋白质和氨基酸的呈色反应呈色反应 蛋白质和氨基酸的呈色反应一、实验目的一、实验目的1 1、了解蛋白质和氨基酸的呈色反应原理、了解蛋白质和氨基酸的呈色反应原理2 2、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方 法。法。3 3、了解呈色反应在定性和定量分析中的应用。、了解呈色反应在定性和定量分析中的应用。蛋白质和氨基酸的呈色反应（一）双缩脲反应一）双缩脲反应1 1、原理、原理一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。脲反应的物质不一定都是蛋白质
2、或多肽。蛋白质和氨基酸的呈色反应2 2、试剂、试剂（1 1）尿素）尿素（2 2）10%10%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液（3 3）1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液（4 4）2%2%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液3 3、操作、操作（1 1） 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化，尿素放出氨热使尿素熔化，尿素放出氨 。熔化的尿素开始硬化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，形成双缩脲。冷后，加时，停止加热，形成双缩脲。冷后，加10%10%氢氧化钠氢氧化钠溶液约溶液约1ml1ml，振荡混匀，再加，振荡混匀，再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液1 1滴，再滴，再振荡。
3、观察出现的粉红颜色。添加要避免过量硫酸铜，振荡。观察出现的粉红颜色。添加要避免过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 （2 2）向另一试管加卵清蛋白溶液约）向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml1ml和和10%10%氢氧化氢氧化钠溶液约钠溶液约2ml2ml，摇匀，再加，摇匀，再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液2 2滴，随加滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。随摇。观察紫玫瑰色的出现。蛋白质和氨基酸的呈色反应剂i（二）茚三酮反应（二）茚三酮反应 蛋白质和氨基酸的呈色反应2 2、试剂、试剂（1 1）蛋白质溶液）蛋白质溶液 （新鲜蛋清：水（新鲜蛋清：水=1:9
4、)=1:9) 100ml100ml （2 2）0.5%0.5%甘氨酸溶液甘氨酸溶液（3 3）0.1%0.1%茚三酮水溶液茚三酮水溶液（4 4）0.1%0.1%茚三酮茚三酮- -乙醇溶液乙醇溶液3 3、操作、操作（1 1）取）取2 2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液液1ml1ml，再各加，再各加0.5ml 0.1%0.5ml 0.1%茚三酮水溶液，混匀，茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热在沸水浴中加热1212分钟，观察颜色由粉色变紫分钟，观察颜色由粉色变紫色再变蓝。色再变蓝。（2 2）在一小块滤纸上滴一滴）在一小块滤纸上滴一滴0.5%0.5%甘氨酸溶液，甘氨
5、酸溶液，风干后，再在原处滴一滴风干后，再在原处滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液，茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。剂i蛋白质和氨基酸的呈色反应剂i（三）黄色反应（三）黄色反应1、原理、原理蛋白质和氨基酸的呈色反应2 2、试剂、试剂（1 1）鸡蛋清溶液）鸡蛋清溶液（2 2）头发）头发 （3 3）指甲）指甲 （4 4）0.5%0.5%苯酚溶液苯酚溶液 （5 5）浓硝酸）浓硝酸 （6 6）0.3%0.3%色氨酸溶液色氨酸溶液（7 7）0.3%0.3%酪氨酸溶液酪氨酸溶液（8 8）10%10%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 3 3、操作、操作
6、 向向6 6个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。蛋白质和氨基酸的呈色反应剂i管管 号号1 12 23 34 45 56 6材材 料料（滴）（滴）蛋白蛋白质质溶液溶液4 4指甲指甲 少许少许头发头发 少许少许0.5%0.5%苯酚苯酚4 40.3%0.3%色氨色氨酸酸4 40.3%0.3%酪氨酪氨酸酸4 4浓硝酸浓硝酸（滴
7、）（滴）2 2404040404 44 44 4现现 象象 蛋白质和氨基酸的呈色反应剂i（四）乙醛酸反应（四）乙醛酸反应 1、原理、原理紫红色紫红色蛋白质和氨基酸的呈色反应剂i2 2、试剂：、试剂：(1) (1) 蛋白质溶液蛋白质溶液 鸡蛋清：水鸡蛋清：水1 1：2020(2 (2）冰醋酸）冰醋酸(3) (3) 浓硫酸浓硫酸( (分析纯分析纯) ) 3 3、操作、操作 向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸约向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸约1ml,1ml,倾斜倾斜试管，谨慎地沿着管壁加浓硫酸试管，谨慎地沿着管壁加浓硫酸(A(AR R) )约约1ml1ml，使，使其重叠，勿使两者混合。静置后
8、，观察在两液界面上其重叠，勿使两者混合。静置后，观察在两液界面上出现的红紫色环，于水浴中微热，可帮助颜色形成。出现的红紫色环，于水浴中微热，可帮助颜色形成。 用用20%20%白明胶作乙醛酸反应。白明胶分子中无色氨酸，白明胶作乙醛酸反应。白明胶分子中无色氨酸，所以不呈此反应。所以不呈此反应。蛋白质和氨基酸的呈色反应剂i( (五五) )考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应1 1、原理、原理考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用
9、结合后变为蓝色。它染色灵敏度高，比氨基黑高它染色灵敏度高，比氨基黑高3 3倍。反应速度快，约在倍。反应速度快，约在2 2分钟左右分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在0.011.0mg0.011.0mg蛋白质范围蛋白质范围内，蛋白质浓度与内，蛋白质浓度与A595nmA595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。量。2 2、试剂、试剂 （1 1）蛋白质溶液（鸡蛋清：水）蛋白质溶液（鸡蛋清：水=1=1：2020） 5 ml5 ml （2 2）考马斯亮蓝染液）考马斯亮蓝染液300 ml300 ml考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250
10、 100mgG250 100mg溶于溶于50 ml 95%50 ml 95%乙醇中，加乙醇中，加100 ml 85%100 ml 85%磷酸磷酸混匀，配成原液。临用前取原液混匀，配成原液。临用前取原液15 ml15 ml，加蒸馏水至，加蒸馏水至100 ml100 ml，用粗，用粗滤纸过滤后，最终浓度为滤纸过滤后，最终浓度为0.01%0.01%。蛋白质和氨基酸的呈色反应剂i3 3、操作、操作 取取2 2支试管，按下表操作支试管，按下表操作 试试 剂剂管管 号号蛋白质溶液蛋白质溶液（mlml）蒸馏水蒸馏水（mlml） 考马斯亮蓝考马斯亮蓝液（液（mlml） 1 10 01 13 32 20.10.10.90.93 3蛋白质和氨基酸的呈色反应
