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1、李智伟第一页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读PNH(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria) 是一种罕是一种罕见的的获得性克隆造血干得性克隆造血干细胞疾胞疾病。但近年来有增多病。但近年来有增多趋势。我国北方多于南。我国北方多于南方。半数以上方。半数以上发生在生在20-40岁青壮年。男性青壮年。男性多于女性，与多于女性，与遗传及种族无关。本病起病及种族无关。本病起病隐袭缓慢，呈慢性慢，呈慢性(mnxng)(mnxng)过程，以程，以贫血、出血血、出血为首首发症状者症状者较多，以血多，以血红蛋白尿起病者蛋白尿起病者较少。少。第二页，共三十
2、七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读第三页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读血红蛋白(xuhngdnbi)尿睡眠有关(yugun)，早晨较重，下午较轻尿液外观为酱油或红葡萄酒样;伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、发热等第四页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读原因(yunyn)因为补体作用最适宜的pH是6.87.O，而睡眠时呼吸中枢敏感性降低，酸性(sunxn)代谢产物积聚第五页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读第六页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读研究(ynji
3、)历史Strubing第一次报道(bodo)PNHHam和Dingle证明了PNH患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的Ham实验1983年证实PNH患者GPI合成异常1993年pig-a基因突变第七页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读流式细胞术原理：X染色体上PIG-A（造血干细胞经获得性体细胞基因）突变导致(dozh)糖化肌醇磷脂(GPI)锚合成障碍导致由GPI锚接在细胞膜上的一组膜蛋白丢失，包括CD16、CD55、CD59等第八页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读第九页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血
4、红蛋白尿的流式细胞术检测解读GPI锚连接蛋白补体调接蛋白(dnbi)衰变加速因子(DAF或CD55)、膜攻击复合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、补体C8结合蛋白(HRF或C8bp)、膜辅助蛋白(MCP)。粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3或CD58)、Blast-1/CD48、CD67、CD66。第十页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读GPI锚连接蛋白酶类红细胞乙酰胆碱脂酶(AchE)、中性粒细胞碱性磷酶酸酶(NAP)、5外核酸酶(CD73)。受体类中性粒细胞III型Fc受体(FcRIIIb或CD16)、单核细胞分化抗原(CD14)、尿激酶
5、型纤溶酶原激活物受体(u-PAR)。血型抗原(kngyun)CD55携带的Comer抗原、AchE携带的Yt抗原。第十一页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读1型细胞CD59完全(wnqun)阳性第十二页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读补体激活(jhu)途径 C1 C1C2,C4 C4b2b (C3转化酶） C3 C3b P （备解素） PC3bBb C3bB (C5转化酶）C4b2b3b或PC3bBb C8 C9 C6C7C5 C5b C5b678 C5b-9 (MAC)CD59替代(tdi)途径经典(jngdin)途径CD55Ag
6、-Ab第十三页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读分析(fnx)1.红系及粒系FSC/SSC设门报告(bogo)标本中CD55、CD59阴性比例第十四页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读做2030份正常人血样划定(hudn)阳性区（区）范围同型阴性对照界定区范围，中间的区域即为区。第十五页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读第十六页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读根据CD59可以将PNH细胞分为3型1型细胞CD59完全阳性(yngxng)正常细胞2型细胞CD59部分阳性补体中度
7、敏感细胞3型细胞CD59完全阴性补体敏感细胞第十七页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读第十八页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读第十九页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读第二十页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读CD55和CD59同时部分或完全缺失(qush)是PNH的典型表现，单GPI缺失不能确诊。CD59重要性大于CD55单CD55缺乏时并不因此改变红细胞对补体的敏感性而造成溶血CD59的缺失会增加补体的敏感性临床上以CD59缺失作为诊断标准是一个趋势。解决了一切以补体溶
8、血为基础的实验诊断方法在诊断PNH的不确定性意义意义(yy)第二十一页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读其它(qt)细胞的PNH检测PNH患者的红细胞、粒细胞、单核细胞及淋巴细胞上GPI锚连膜蛋白部分或全部丧失(sngsh)。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞骨髓PNH克隆出现比外周血早，网织红细胞略早于红细胞第二十二页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读其它细胞(xbo)的PNH检测应用FSC/SSC设门分析时会有许多脱颗粒的中性粒细胞，这时只使用物理特征无法准确设定粒细胞门了，这时必须使用系列标志/SSC设门:CD15，CD33。CD64
9、设门，分析单核CD14,CD55,CD59，PNH病人检测GPI缺乏(quf)的血小板不容易分辨不能只根据淋巴细胞上GPI相关蛋白的表达来诊断。第二十三页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读与其他实验(shyn)比较1.酸溶血(rnxu)试验(Ham试验)患者红细胞与含5%盐酸的正常同型血清混合，pH6.4，37孵育2小时，溶血明显。本试验特异性高，敏感性差。2.蛇毒因子溶血试验蛇毒因子能通过补体交替途径，使补体敏感的红细胞发生溶血。本试验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。3.热溶血试验和蔗糖溶血试验因特异性差，常作为筛选方法。第二十四页，共三十七页。PNH-阵发性睡
10、眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读具有(jyu)PNH克隆的血液病检测(jinc)粒细胞GPI锚连蛋白表达病种检测例数缺失例数(%)AA11525(22%)MDS399(23%)并发现MDS有PNH表达者ATG（人人胸胸腺腺细胞胞免免疫疫球球蛋白）蛋白）治疗有效(AnInternMed1999，131:401)第二十五页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读PNH和AA关系(gunx)相当密切，可以相互转化(zhunhu)且并存AAPNH较多(15%)，PNHAA少20%30%PNH可伴骨髓再障AA(ATG治疗后)PNH1031%AA-PNH综合征16.5%(我国)5
11、0%AA外周血或骨髓可检出PNH克隆AAPNH生存率要高于PNHAAMDS-RA如捡出PNH克隆者预后好，且ATG(人胸腺人胸腺细胞免疫球蛋白胞免疫球蛋白) )治疗有效。PNH对AA和MDS的“自然治疗”，而“AA救了PNH”。第二十六页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读PNH克隆见于(jiny)淋巴增殖性疾病检测(jinc)病种例数NHL87HD55红细胞CD55/CD59CLL49缺失检出率9.2%ALL22HCL4(HematolJ2001，2:33)第二十七页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读PNH克隆(kln)见于浆细胞病检
12、测红细胞CD55/CD59缺失(qush)病种检测例数缺失例数(%)MM626WM72MGUS61HCD21合计7710(12.9%)(IntJHematol2002,75:40)第二十八页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读FLAER嗜水气单胞菌溶素变异体(FLAER)。1998年Diep等报道嗜水气单胞菌(HEC)毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，随后立即聚合成多具体，插入细胞膜脂质双层，在膜上形成孔洞致溶破。PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗(dkng)毒素保持细胞完好。第二十九页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读FLAERF
13、LAER在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞上都有特异性表达，所以正常人及非PNH贫血FLAER成100%阳性。是目前诊断PNH最敏感、特异的方法。FLAER对PNH克隆检出的敏感性为0.1%，其它(qt)靶向标记检出率的敏感性为1%；第三十页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读结果(jigu)分析1.设门CD45/SSC2.标记CD15，CD14，CD45，FLAER检测(jinc)PNH粒、单核及淋巴细胞，报告标本中各系细胞FLAER阴性比例第三十一页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读第三十二页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白
14、尿的流式细胞术检测解读第三十三页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读FLAER目前FLAER一般用于有核细胞的检测，不能评价红细胞的PNH克隆。由于红细胞表面没有气单胞菌溶素前体产生所需要的蛋白(dnbi)水解酶类，尽管表达在红细胞表面的血型糖蛋白(dnbi)不是锚连蛋白(dnbi)，但是由于血型糖蛋白(dnbi)与气单胞菌溶素前体结合力较弱，因此限制了FLAER在红细胞中的应用。第三十四页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读与与CD55、CD59比比较，Flaer对PNH患者患者(hunzh)(hunzh)对中性粒中性粒细胞的胞的测定最
15、定最为清晰、准确清晰、准确临床上高度床上高度怀疑，而疑，而CD55、CD59不能确不能确诊的病例，可以的病例，可以结合合F1aer检查，获得明得明确确诊断断第三十五页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读第三十六页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读内容(nirng)总结阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测。做2030份正常人血样划定阳性区（区）范围。CD55和CD59同时部分(bfen)或完全缺失是PNH的典型表现，单GPI缺失不能确诊。本试验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。3.热溶血试验和蔗糖溶血试验因特异性差，常作为筛选方法。PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细胞完好。谢谢第三十七页，共三十七页。PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读
