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1、实验报告 实验题目：细胞 RNA 的提取及鉴定、RT-PCR 检测 p53 基因的表达 报告人：张铨 合作者：殷悦涵 实验日期：一、实验原理 1. 细胞 RNA 的提取及鉴定 细胞内 RNA 通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。分离、制备RNA 时首先须破碎细胞，使 RNP 释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将 RNA 同其他的细胞成分分离开并保证 RNA 的完整性。Trizol 法分离提取的 RNA 产率高、纯度好且不易降解，它是一种总 RNA 抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。由于 RNase 能迅速降解 RNA，所以需创造一个无 RNase 的环境，在各个环节避免它
2、的污染。评价 RNA 质量的标准是 RNA 的均一性和完整性，采用紫外分光光度法测定 RNA 的浓度和纯度， 纯 RNA 的 A260/280=， 实验室条件下一般在之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。 2. RT-PCR 检测 p53 基因的表达 PCR 是一种体外大量扩增特异 DNA 片段的分子生物学技术，利用已知序列作为引物，将两引物之间的特定 DNA 片段进行复制，经过多次循环是模板上特定DNA 拷贝数呈指数级增长。 基本过程为变性、 退火、 延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后特定的 DNA 片段的分子数增加一倍。 RT-PCR将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大
3、量扩增， 实质上是对mRNA的扩增， 常利用此技术克隆 cDNA 或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。本实验先以 Oligo 引物来反转录合成细胞 cDNA 模板，然后采用 p53 特异性引物进行 PCR 扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析 p53 在两种肺癌细胞（A549 和H1299）中的表达水平。 二、实验材料及设备 材料：肺癌细胞 A549（野生型）和 H1299（p53 缺失型） 、p53 引物、GAPDH引物 试剂：Trizol 试剂、氯仿、异丙醇、无 RNase 水、乙醇、 、Promega RT-PCR试剂盒、2*TaqPCR mix 、DNA 染料：GoldView、5*
4、TBE、6*上样缓冲液、DNA 分子量标准、琼脂糖 耗材：Ep 管、吸头、一次性手套、口罩 设备： 5415R 型冷冻离心机、 NanoDrop2000 超微量分光光度计、 高压消毒锅、恒温干燥箱、制冰机、可调式取液器、PCR 仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、凝胶成像系统、冰箱 三、实验步骤 1. 细胞 RNA 的提取及鉴定 （一）RNA 提取 取 1*106个细胞与管加氯仿摇匀4，12000rpm 离心 15min 分层取上层水相入新的 Ep 管中加入等体积异丙醇， 摇匀， 室温静置 10min4， 12000rpm离心 10min，RNA 沉淀弃上清，加 1ml75%乙醇洗涤沉淀4，120
5、00rpm 离心5min弃上清，晾干，用 30l 无 RNase 水溶解沉淀 （二）RNA 浓度和纯度测定 取 2ulRNA 溶液，用 NanoDrop2000 超微量分光光度计测定 260nm 和 280nm波长的 OD 值，并记录 Abs260/Abs280 比值及 RNA 浓度 2. RT-PCR 检测 p53 基因的表达 （一）反转录合成 cDNA 预变性： 取一支管加入样品RNA2g， 以无水RNase水补足体积至9l， 70，10min，立即置于冰上。 2.设置反转录反应体系，向管内加入 MgCl2 4l 10*RT 缓冲液 2l dNTP 2l RNase 1l Oligo（dT
6、） 1l AMV 反转录酶 1l 混匀。42，15min 反转录；95，5min 终止反应。置于冰上。 （二）PCR 扩增目的产物 每组做两份模板不同的 PCR 反应 1.取两只管，分别按下表加入试剂（20l 体系，单位：l） ： 试剂 H1299 组 A549 组 2*TaqPCR mix 10 10 p53 上游引物 1 1 P53 下游引物 1 1 无菌蒸馏水 7 7 H1299 细胞 cDNA 模板 1 - A549 细胞 cDNA 模板 - 1 2.设置 PCR 反应参数为： 94预变性 5min 94变性 30s 58退火 30s 72延伸 30s 共 30 个循环 72延伸 5m
7、in （三）RT-PCR 产物鉴定： 1.配 2%琼脂糖凝胶： 琼脂糖 2g *TBE 100ml 微波加热融化；冷却至 60左右，加入 GoldView(DNA 染料) 5l 混匀，灌胶 2.电泳： 向水平电泳槽中加入*TBE 至恰好浸没凝胶约 1mm 左右 取 15lRT-PCR 产物上样，100V 电泳 2030min 结果观察： 用凝胶成像仪观察并拍摄电泳结果， 以 DNA 分子量标准 （marker）为参照，分析 PCR 产物大小及 p53 在两种细胞中的表达情况。理论上，A549 是p53 野生型的细胞，正常表达 p53，该样品的 PCR 产物经电泳后，应在 390bp 的位置出现
8、扩增条带；而 H1299 是 p53 缺失型的细胞，不表达 p53，在相应位置没有扩增条带。管家基因 GAPDH 作为实验的内部参照，在两种细胞中均有表达，电泳后在 320bp 处出现扩增条带。 四、实验结果 1. 细胞 RNA 的提取及鉴定 提取到细胞 RNA，用 NanoDrop2000 超微量分光光度计检测其 Abs260/Abs280 为，浓度为g/l。 2. RT-PCR 检测 p53 基因的表达 五、实验讨论 1. 细胞 RNA 的提取及鉴定 由于在 RNA 提取实验中，RNA 浓度较高，为g/l，导致在取 2g 的 RNA时，只需取l 的 RNA 溶液，移液器的精度不高，容易造成
9、误差，因此应将溶液稀释至 1g/l 左右再取 2g 的 RNA 溶液。 Abs260/Abs280 为，说明我们组提取的 RNA 较为纯净，提取步骤操作良好，几乎没有蛋白质的污染，该溶液可以使用到 RT-PCR 的实验中。 2. RT-PCR 检测 p53 基因的表达 可以看到我们组 A549 细胞中在 390bp 的位置出现扩增条带， H1299 在 390bp处没有出现扩增条带， 可说明 A549 细胞中正常表达 p53 基因， 经过 RT-PCR 扩增后在电泳凝胶成像仪中表现出 390bp 有扩增条带，H1299 细胞则不表达 p53，不出现扩增条带。 由于我组实验结果为阴性， 所以不能看出在实验步骤中混入 RNase 降解 RNA，但还需在实验步骤中注意佩戴口罩和手套。
