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1、实验二实验二 三三. . 抗酸染色抗酸染色 一一. . 消毒灭菌消毒灭菌 二二. . 肠道致病菌的分离培养肠道致病菌的分离培养 -消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色一、消毒灭菌一、消毒灭菌1.1.物理因素对细菌的影响物理因素对细菌的影响2. 2. 化学因素对细菌的影响化学因素对细菌的影响-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色（一）（一） 物理因素对细菌的影响物理因素对细菌的影响高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法紫外线对细菌的影响紫外线对细菌的影响-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色高压蒸气灭菌法高压蒸气灭菌法 原理：原理：蒸汽被限制在密闭容器内，随着热力蒸汽被限制在密闭容器内，随着热力 的作用压
2、力不断升高，蒸汽的温度也的作用压力不断升高，蒸汽的温度也 相应升高，在相应升高，在103.4kPa103.4kPa蒸汽压力下蒸汽压力下 时，温度可达时，温度可达121.3121.3。维持。维持15-2015-20分分 钟后可杀死细菌包括芽孢在内的所有钟后可杀死细菌包括芽孢在内的所有 微生物。微生物。-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色高压蒸气灭菌器高压蒸气灭菌器 1) 构造构造 高压蒸气灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水，高压蒸气灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水，外层坚厚，其上或前方有金属厚盖。盖旁附有螺栓，借以紧外层坚厚，其上或前方有金属厚盖。盖旁附有螺栓，借以紧闭盖门，使蒸
3、气不能外溢。闭盖门，使蒸气不能外溢。 高压蒸气灭菌器上装有排气阀、安全阀，以调节器内压高压蒸气灭菌器上装有排气阀、安全阀，以调节器内压力，装有的温度计及压力表以示内部温度和压力。力，装有的温度计及压力表以示内部温度和压力。 器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌对象。器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌对象。-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法压力压力：1.05kg/ 或103.425KPa温度温度: : 121.3时间：时间：15-20min完全杀灭细菌的繁殖体和芽孢完全杀灭细菌的繁殖体和芽孢用途：适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，用途：适用于耐高温、高压，
4、不怕潮湿的物品， 如敷料、如敷料、 手术器械、药品、细菌培养基等。手术器械、药品、细菌培养基等。-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色2)2)使用方法使用方法 加水至锅内达规定的水平面，放入欲灭菌物品，把锅盖按对称的螺旋先后对称用力（切勿单个依次）扭紧，使锅盖确实均匀密闭。 用电炉加热，同时打开排气阀门，使器内冷空气逸出，待空气全部排出后，关闭排气阀。 继续加热并观察压力表，器内压力又逐渐升高，直到压力表指在所需数字（例如15磅）即调节热源，维持2030min可完全杀死细菌的繁殖体和芽胞。 灭菌时间到达后，停止加热，待压力自行下降至零时方可徐徐开放排气阀，排尽余气，打开锅盖，取出灭菌物品。-消
5、毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色全全自自动动高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌锅锅 -消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色台式蒸汽灭菌器台式蒸汽灭菌器台式蒸汽灭菌器台式蒸汽灭菌器 BA-30BA-30BA-30BA-30-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色Systec D-200 2D Systec D-200 2D Systec D-200 2D Systec D-200 2D 双门高压灭菌器双门高压灭菌器双门高压灭菌器双门高压灭菌器电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器( ( ( (型号型号型号型号YXQ-WY21-600)YXQ
6、-WY21-600)YXQ-WY21-600)YXQ-WY21-600)-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色 电电电电脑脑脑脑全全全全自自自自动动动动水水水水浴浴浴浴式式式式串串串串联联联联杀杀杀杀菌菌菌菌锅锅锅锅-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色紫外线对细菌的影响紫外线对细菌的影响原理：原理：紫外线主要作用于紫外线主要作用于紫外线主要作用于紫外线主要作用于DNADNADNADNA，使一条，使一条，使一条，使一条DNADNADNAD
7、NA链上的链上的链上的链上的两个相邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而两个相邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而两个相邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而两个相邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰干扰干扰干扰DNADNADNADNA的复制与转录导致细菌变异或死亡。的复制与转录导致细菌变异或死亡。的复制与转录导致细菌变异或死亡。的复制与转录导致细菌变异或死亡。对对病毒也有破坏作用。病毒也有破坏作用。特点：特点：紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。普通紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。普通紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。普通紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。普通 玻璃、纸张、水蒸气、尘埃等均能阻挡。玻
8、璃、纸张、水蒸气、尘埃等均能阻挡。玻璃、纸张、水蒸气、尘埃等均能阻挡。玻璃、纸张、水蒸气、尘埃等均能阻挡。 紫外线中波长为紫外线中波长为紫外线中波长为紫外线中波长为240-300nm240-300nm者具有杀菌能者具有杀菌能者具有杀菌能者具有杀菌能 力，其中力，其中力，其中力，其中265-266nm265-266nm的杀菌作用最强的杀菌作用最强的杀菌作用最强的杀菌作用最强。用途：用途：常用于消毒物体表面，手术室无菌实验常用于消毒物体表面，手术室无菌实验常用于消毒物体表面，手术室无菌实验常用于消毒物体表面，手术室无菌实验 室，传染病房的空气消毒及不耐热物品消毒。室，传染病房的空气消毒及不耐热物品
9、消毒。室，传染病房的空气消毒及不耐热物品消毒。室，传染病房的空气消毒及不耐热物品消毒。-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色紫外线对细菌的影响紫外线对细菌的影响 方法：方法：取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，然后按图所示揭开平皿盖，置于紫外线下照射然后按图所示揭开平皿盖，置于紫外线下照射3030分钟，分钟，然后盖好盖子，置然后盖好盖子，置37培养培养24h后取出观察结果。后取出观察结果。纸片纸片平皿盖平皿盖滤纸片用后需要用火烧掉滤纸片用后需要用火烧掉每个实验室每个实验室4个平板个平板-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色密涂接种密涂接种 分三次
10、接种，分三次接种，每次取一环。第每次取一环。第一次密涂接种后一次密涂接种后旋转旋转6060度二次密度二次密涂接种，然后同涂接种，然后同方向旋转方向旋转6060度后度后再次密涂接种。再次密涂接种。-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色 1. 1. 促进菌体蛋白质变性或凝固促进菌体蛋白质变性或凝固; ; 2. 2. 干扰细菌酶系统和代谢干扰细菌酶系统和代谢; ; 3. 3. 损伤细菌的细胞膜，影响细菌的化学组成，损伤细菌的细胞膜，影响细菌的化学组成， 物理结构和生理活动。物理结构和生理活动。 有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，称为化学消毒剂化学消毒剂；浓度低时能抑制细菌生长，称为防防腐剂腐剂。
11、（只能外用，对细菌的敏感性不同）（二）（二） 化学因素对细菌的影响化学因素对细菌的影响 -消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色化学消毒剂分类 高效消毒剂：高效消毒剂：杀灭细菌芽孢在内的所有微生物，适用于杀灭细菌芽孢在内的所有微生物，适用于 不耐热力灭菌但要进入人体内部的物品，如内窥镜等。不耐热力灭菌但要进入人体内部的物品，如内窥镜等。 如：次氯酸钠如：次氯酸钠、过氧化氢过氧化氢、甲醛甲醛、环氧乙烷等环氧乙烷等 中效消毒剂：中效消毒剂：不能杀灭芽孢，但能杀灭繁殖体（包括结不能杀灭芽孢，但能杀灭繁殖体（包括结 核杆菌），真菌和大多病毒，适用于喉镜，麻醉器材等。核杆菌），真菌和大多病毒，适用于喉镜，
12、麻醉器材等。 如：碘酊如：碘酊、乙醇等乙醇等 低效消毒剂：低效消毒剂：能杀灭大多细菌繁殖体，但不能杀灭芽能杀灭大多细菌繁殖体，但不能杀灭芽 孢，结核杆菌及某些抵抗力强的真菌和病毒。孢，结核杆菌及某些抵抗力强的真菌和病毒。 如：新洁尔灭如：新洁尔灭、洗必泰洗必泰、高锰酸钾等高锰酸钾等-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色化学消毒剂对细菌的影响化学消毒剂对细菌的影响方法方法：取一普通平皿取一普通平皿培养基，一部分写上培养基，一部分写上“前前”，另一部分写，另一部分写上上“后后”，然后将手，然后将手指在写有指在写有“前前”的部的部分沾一下，再将手指分沾一下，再将手指用酒精、碘酒或新洁用酒精、碘酒或新
13、洁尔灭进行消毒，在写尔灭进行消毒，在写有有“后后”的部分沾一的部分沾一下。放入下。放入3737温箱培温箱培养养2424小时小时后观察。后观察。 （每个实验室每个实验室4 4个平皿个平皿）-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色二、肠道致病菌的分离培养二、肠道致病菌的分离培养1. 肠道致病菌的生物学性状2. SS培养基的特性及用途3. 分离培养方法-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色肠道杆菌的生物学性状肠道杆菌的生物学性状埃希菌属：大肠埃希菌埃希菌属：大肠埃希菌沙门菌属：伤寒沙门菌沙门菌属：伤寒沙门菌 甲型、乙型副伤寒沙门菌甲型、乙型副伤寒沙门菌志贺菌属：痢疾志贺菌志贺菌属：痢疾志贺菌肠杆菌科重
14、要菌属及代表菌种肠杆菌科重要菌属及代表菌种-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色1 1、相似的形态染色、相似的形态染色从形态上无法区别从形态上无法区别从形态上无法区别从形态上无法区别 中等大小的中等大小的中等大小的中等大小的G G G G- -杆菌杆菌杆菌杆菌 多多多多有有有有鞭鞭鞭鞭毛毛毛毛、菌菌菌菌毛毛毛毛肠道杆菌的生物学性状肠道杆菌的生物学性状-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色2 2、活泼的生化反应、活泼的生化反应肠道杆菌的生物学性状肠道杆菌的生物学性状乳糖发酵试验乳糖发酵试验初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌肠道致病菌肠道致病菌肠道非致病菌肠道非致病菌
15、多数不发酵乳糖多数不发酵乳糖 多数发酵乳糖多数发酵乳糖-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色肠道杆菌的生物学性状肠道杆菌的生物学性状 -/+ - +伤寒杆菌 - - +痢疾杆菌 - 大肠杆菌硫化氢乳糖葡萄糖菌名2 2、活泼的生化反应、活泼的生化反应-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色SSSS培养基的特性培养基的特性（Salmonella -Shigella Medium）胆盐抑制胆盐抑制G+,+,枸橼酸钠和煌绿能部分抑制大枸橼酸钠和煌绿能部分抑制大肠杆菌肠杆菌, ,致病的沙门菌和志贺菌能大量生长。致病的沙门菌和志贺菌能大量生长。中性红指示剂和乳糖中性红指示剂和乳糖, ,中性红遇酸变粉红。中性
16、红遇酸变粉红。常用于培养肠道致病菌。常用于培养肠道致病菌。牛肉浸粉牛肉浸粉 蛋白胨蛋白胨 乳糖乳糖 硫代硫酸钠硫代硫酸钠 枸橼酸钠枸橼酸钠 煌绿煌绿 胆盐胆盐 中性红中性红 琼脂琼脂-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色Salmonella -Shigella Medium主要成分主要成分 基础营养基础营养 乳糖乳糖 指示剂指示剂 抑制剂抑制剂分解乳糖分解乳糖不分解乳糖不分解乳糖产酸产酸PH下降下降指示剂变红色指示剂变红色红色大菌落红色大菌落大肠杆菌等大肠杆菌等无明显变化无明显变化无色半透明小菌落无色半透明小菌落志贺菌、沙门菌志贺菌、沙门菌-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色大肠杆菌大肠杆菌
17、痢疾杆菌痢疾杆菌-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色 SSSS平板平板大肠杆菌大肠杆菌 粉红色大菌落粉红色大菌落痢疾杆菌痢疾杆菌 无色细小无色细小 半透明菌落半透明菌落伤寒杆菌伤寒杆菌 无色细小无色细小 半透明菌落半透明菌落SSSS培养基的特性及用途培养基的特性及用途-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色将粪便标本以分区划线法接种到将粪便标本以分区划线法接种到SSSS培养基。培养基。 ( (每个实验室每个实验室8 8个平板，接种好后，做好标记，用胶个平板，接种好后，做好标记，用胶布按班绑好）布按班绑好） 注：每个平板只可操作一次，不可重复操作注：每个平板只可操作一次，不可重复操作放入放入37
18、温箱中培养温箱中培养24小时。取出放小时。取出放4冰箱冰箱中保中保存备用。存备用。肠道致病菌的分离培养方法肠道致病菌的分离培养方法-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色【实验目的实验目的】1. 1. 掌握分枝杆菌抗酸染色的操作方法和意义。掌握分枝杆菌抗酸染色的操作方法和意义。2. 2. 熟悉抗酸染色的原理。熟悉抗酸染色的原理。三、三、抗酸染色（抗酸染色（Acid fast stain）-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色分枝杆菌的细胞壁内含有大量的分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要它包围在肽聚糖的外面，所以
19、分枝杆菌一般不易着色，要经过经过加热和延长染色时间加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色抗酸染色。齐齐- -尼氏抗酸染色法是在加热条件下使尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物红牢固结合成复合物，用，用3%3%盐酸酒精处理也不脱色。当再盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色红色，而其他细菌及，而其他细菌及背景中的物质为背景中的物质为蓝色蓝色。【实验原理
20、实验原理】-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色 细菌细菌：卡介苗：卡介苗 （Bacillus Calmette-Guerin， BCG） 染液染液：石炭酸复红液、：石炭酸复红液、3%3%盐酸酒精、碱性美兰溶液盐酸酒精、碱性美兰溶液 其它其它：接种环、酒精灯、载玻片、玻片夹等：接种环、酒精灯、载玻片、玻片夹等【实验材料实验材料】-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色1.1.细菌涂片的制备细菌涂片的制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 2.2.染色染色1 1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3 2-3 滴，在滴，在火焰高处（火焰高处（2-1
21、0cm2-10cm）徐徐加热，）徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，加热离开，加热3 35min5min，若染液蒸发减少，应再加染液，以免，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，待标本干涸，待标本冷却后冷却后用水冲洗。用水冲洗。2 2）脱色：）脱色： 3%3%盐酸酒精盐酸酒精脱色脱色30s30s1min1min；用水冲洗。；用水冲洗。3 3）复染：用碱性美兰溶液）复染：用碱性美兰溶液复染复染1min1min；用水冲洗后用吸水纸吸干。；用水冲洗后用吸水纸吸干。3. 3. 用油镜观察用油镜观察【方法与步骤方法与步骤】（与革兰染色的差别）（与革兰染色的差别）-消毒灭菌肠道
22、致病菌分离培养和抗酸染色【实验结果实验结果】未染色未染色 初染后初染后 脱色后脱色后 复染后复染后初染初染脱色脱色复染复染石石炭炭酸酸复复红红盐盐酸酸酒酒精精碱碱性性美美兰兰-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色 结核杆菌呈结核杆菌呈红色红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈状生长。背景及非抗酸性细菌呈蓝色蓝色。-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色【注意事项注意事项】1. 1. 无菌操作无菌操作2. 2. 染色时间要充分染色时间要充分3. 3. 初染时掌握好加热的温度，勿沸腾、干涸初染时掌握好加热的温度，勿沸腾、干涸4. 4. 初染结
23、束后需冷却后再用水冲洗初染结束后需冷却后再用水冲洗-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色实验报告实验报告内容：抗酸染色内容：抗酸染色一、目的一、目的二、原理二、原理三、材料三、材料四、方法四、方法五、五、结果（图）结果（图）六、注意事项六、注意事项-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色预习下周实验内容：预习下周实验内容： 肠道致病菌的鉴定；肠道致病菌的鉴定； 药敏试验；药敏试验； 内毒素的检测。内毒素的检测。1.1.请将实验后的玻片放入前面的消毒缸中。请将实验后的玻片放入前面的消毒缸中。2.2.显微镜油镜头用擦镜液擦干净。显微镜油镜头用擦镜液擦干净。2.2.离开实验室之前请用肥皂洗手。离开实验室之前请用肥皂洗手。3.3.请值日的同学认真打扫。请值日的同学认真打扫。-消毒灭菌肠道致病菌分离培养和抗酸染色
