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1、分析方法的验证内容：内容： 一、介绍一、介绍 二、分析方法验证二、分析方法验证 三、常见问题三、常见问题2二、分析方法验证二、分析方法验证3 3、分析方法验证范围、分析方法验证范围1.1.采用新的检验方法；采用新的检验方法；2.2.检验方法需变更的；检验方法需变更的；3.3.采用采用中华人民共和国药典中华人民共和国药典及其他法定标准未收载的及其他法定标准未收载的检验方法；检验方法；4.4.法规规定的其他需要验证的检验方法法规规定的其他需要验证的检验方法二、分析方法验证二、分析方法验证4 4、需验证的检验项目、需验证的检验项目1 1）鉴别试验）鉴别试验2 2）杂质的限度检查）杂质的限度检查3 3
2、）杂质杂质的的定量定量测定测定4 4）含量测定，包括原料药或制剂中有效成分的含量，制剂）含量测定，包括原料药或制剂中有效成分的含量，制剂中其他成分（如防腐剂等）的含量，溶出度与释放度等检中其他成分（如防腐剂等）的含量，溶出度与释放度等检查中的溶出量，以及含量均匀度。查中的溶出量，以及含量均匀度。化学药品化学药品/ /中药制剂中其他需控制成分中药制剂中其他需控制成分( (如残留物、添加剂如残留物、添加剂等）的测定等）的测定1 1）专属性）专属性2 2）线性）线性3 3）范围）范围4 4）准确性）准确性5 5）精密度）精密度6 6）检测限）检测限7 7）定量限）定量限8 8）耐用性）耐用性9 9）
3、系统适用性）系统适用性 5 5、分析方法验证的具体内容、分析方法验证的具体内容根据根据检测的类型检测的类型采用的技术采用的技术检测方法检测方法确定具体方法拟订验证的内容确定具体方法拟订验证的内容二、分析方法验证二、分析方法验证1 1）专属性专属性l定义：定义：是指在其他成份（如是指在其他成份（如：杂质、降解产物、辅料等）杂质、降解产物、辅料等）可能存在的情况下，采用的方法能可能存在的情况下，采用的方法能正确正确测定出被测物的特测定出被测物的特性；能反映该分析方法在有共存物时对供试物准确而不受性；能反映该分析方法在有共存物时对供试物准确而不受干扰的测定能力。干扰的测定能力。通常，鉴别试验、杂质检
4、查、含量测定均应考察其专属性。通常，鉴别试验、杂质检查、含量测定均应考察其专属性。一种分析方法不太可能对某一特定的被分析物具有专属性一种分析方法不太可能对某一特定的被分析物具有专属性( (完全辨别完全辨别) )，在此情况下，建议采用两种或两种以上的分，在此情况下，建议采用两种或两种以上的分析方法以达到所需的辨别水平。析方法以达到所需的辨别水平。9 1 1）专属性专属性含量测定目的是得到样品中被分析物的含量或效价的准确含量测定目的是得到样品中被分析物的含量或效价的准确结果。结果。对于色谱法和其他分离方法来说，应当用具有代表性的色对于色谱法和其他分离方法来说，应当用具有代表性的色谱图来证明专属性，
5、并在图上适当地标出每一种成分。色谱谱图来证明专属性，并在图上适当地标出每一种成分。色谱法的分离度应符合要求。法的分离度应符合要求。 1 1）专属性专属性已知杂质：对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质已知杂质：对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的试样比较测定结果。试样比较测定结果。未知杂质：可以通过测定含有杂质或降解产物的试样，未知杂质：可以通过测定含有杂质或降解产物的试样，与另一已验证的方法或药典方法比较结果。或进行与另一已验证的方法或药典方法比较结果。或进行破坏性试破坏性试验证明验证明
6、，在相对激烈的条件下：光热、酸碱、氧化、还原等，在相对激烈的条件下：光热、酸碱、氧化、还原等，比较破坏前后的结果的差异。比较破坏前后的结果的差异。112 2）线性）线性 线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。直接呈正比关系的程度。线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量测定和含量定量测定均需验证线性。测定和含量定量测定均需验证线性。2 2）线性线性 试验方法试验方法应在规定的测定范围内测定线性关系。应在规定的测定范围内测定线性关系。可用一贮备液
7、经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列样品的方法进行测定，至少制备样品的方法进行测定，至少制备5 5个浓度的供试样品，每个个浓度的供试样品，每个浓度各一份，每份供试样品检测浓度各一份，每份供试样品检测3 3次，以测得的响应信号最次，以测得的响应信号最为被测被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二为被测被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。乘法进行线性回归。132 2）线性线性 一般配制方法：一般配制方法：在含量测定浓度的在含量测定浓度的80%-120%80%-120%均匀选择至少五个不同的浓度均匀选择至少五个不同
8、的浓度点配制溶液各三份。点配制溶液各三份。142 2）线性线性 数据要求：数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图应列出回归方程、相关系数和线性图。推荐接受标准：推荐接受标准：相关系数相关系数R R0.9980.998其截距不应明显地偏离零点。其截距不应明显地偏离零点。153 3）范围）范围 范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。适用的高低限浓度或量的区间。 范围通常与分析方法的测试结果相同的单位表达。涉及范围通常与分析方法的测试结果相同的单位表达。涉及到定量测定的检测项目均需对范围进行验证。到定量测定的检
9、测项目均需对范围进行验证。 3 3）范围）范围含量测定时，范围通常为测试浓度的含量测定时，范围通常为测试浓度的80%-120%80%-120%。4 4）准确度）准确度 定义：系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近定义：系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。一般用回收率的程度。一般用回收率(%)(%)表示。表示。一定的准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量一定的准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需对准确度进行验证。测定的检测项目均需对准确度进行验证。 4 4）准确度准确度 测定回收率测定回收率R R一般采用空白回收法和加样回收法。一般采用空白回收法和加
10、样回收法。空白回收：已知量为空白回收：已知量为P P的对照品。测定值为的对照品。测定值为A A。如在六个空白样品中，分别加入已知浓度的样品（浓度如在六个空白样品中，分别加入已知浓度的样品（浓度范围为含量测定浓度的范围为含量测定浓度的80%-120%80%-120%）194 4）准确度）准确度 加样回收加样回收: :在已准确测定含量为在已准确测定含量为P P的样品中的样品中+ +已知量为已知量为A A的对照品或标准品测定，测定值为的对照品或标准品测定，测定值为M M。 4 4）准确度准确度 方法方法准确度应在规定范围内建立，至少用准确度应在规定范围内建立，至少用9 9个测定结果进行评个测定结果进
11、行评价。价。例如：测定含量的准确度，按标示量的例如：测定含量的准确度，按标示量的80%80%，100%100%和和120%120%配制三个浓度的溶液，每个浓度各配制配制三个浓度的溶液，每个浓度各配制3 3份供试品溶液，份供试品溶液，进行测定。进行测定。214 4）准确度准确度 数据要求：数据要求：需报告已知加入量的回收率（需报告已知加入量的回收率（% %），或测定结果平均值与），或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差。真实值之差及其相对标准偏差。一般推荐含量（一般推荐含量（HPLCHPLC、GCGC、UVUV）的回收率（平均值）要）的回收率（平均值）要求在求在98.0%-102.0%98
12、.0%-102.0%范围内。范围内。杂质的定量测定的回收率（平均值）：限度杂质的定量测定的回收率（平均值）：限度0.5%0.5%，在，在80%-120%80%-120%范围内；范围内；0.5%0.5%限度限度5%5%，在，在90%-110%90%-110%范围内；限范围内；限度度5%5%，在，在95%-105%95%-105%范围内。范围内。225 5）精密度）精密度 精精密密度度系系指指在在规规定定的的测测试试条条件件下下，同同一一均均匀匀供供试试品品，经经多多次次取取样样测测定定所所得得结结果果之之间间的的接接近近程程度度。精精密密度度一一般般用用偏偏差差、标准偏差或相对标准偏差表示。标准
13、偏差或相对标准偏差表示。5 5）精密度）精密度名称名称定义定义验证方法验证方法重复性重复性在相同条件下，由一个在相同条件下，由一个分析人员测定所得结果分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。的精密度称为重复性。在规定的线性范围内至少测定在规定的线性范围内至少测定9次次(例如例如3种浓度每种浓度种浓度每种浓度3次次)，或在，或在100的实的实验浓度下，至少测定验浓度下，至少测定6次。次。中间中间精密度精密度在同一个实验室，不同在同一个实验室，不同时间由不同分析人员时间由不同分析人员, ,用不同设备测定结果之用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间间的精密度，称为中间精密度。精密度。应根据方法使用
14、的环境而定，确定随机应根据方法使用的环境而定，确定随机事件对分析方法精密度的影响。事件对分析方法精密度的影响。变动因素为：不同日期变动因素为：不同日期 不同分析人员不同分析人员 不同设备不同设备重现性重现性在不同实验室由不同分在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的析人员测定结果之间的精密度精密度通过实验室之间的检测来评价；通过实验室之间的检测来评价；如果方法需要标准化如收载到药典中的如果方法需要标准化如收载到药典中的方法，则应考虑重现性。这些资料不是方法，则应考虑重现性。这些资料不是申请上市文档的三部分。申请上市文档的三部分。协作标定协作标定 能力验证能力验证 药品标准的实验药品标准的实验复
15、核复核系统重复性：系统重复性：相同条件下，同一分析人员对同一样品溶液多相同条件下，同一分析人员对同一样品溶液多次测试结果的接近程度。次测试结果的接近程度。同一均匀标准样品溶液，连续重复测定六次，计算各组分响同一均匀标准样品溶液，连续重复测定六次，计算各组分响应值与平均值之间的相对标准偏差。应值与平均值之间的相对标准偏差。方法重复性：方法重复性：相同条件下，同一分析人员对同一个均匀样品，相同条件下，同一分析人员对同一个均匀样品，多次取样测定所得结果的接近程度。多次取样测定所得结果的接近程度。同一样品，至少称取六份，再测定每一份样品含量，计算每同一样品，至少称取六份，再测定每一份样品含量，计算每一
16、次测定的含量与平均含量间的相对标准偏差。一次测定的含量与平均含量间的相对标准偏差。5 5）精密度精密度 256）检测限（检测限（LODLOD或或DLDL) ) 检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量。检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量。常用方法如下：常用方法如下：1.1.直观法直观法用用已已知知浓浓度度被被测测物物的的样样品品，试试验验出出能能被被可可靠靠地地检检测测出出的的最最低低浓浓度度或或量量。用用于于非非仪仪器器分分析析法法( (目目视视法法) )，也也可可用用于于仪仪器器分析法。分析法。 6）检检测测限（限（LODLOD或或DLDL) )2.2.信噪比法：信噪比法：仅适用
17、于仅适用于能显示能显示基线噪音的分析方法。基线噪音的分析方法。- -即把已知即把已知低浓度低浓度试样的试样的测试信号与空白样品的测试信号测试信号与空白样品的测试信号进进行比较行比较，计算出能被可靠地检测出的计算出能被可靠地检测出的最小浓度。最小浓度。- -通常信噪比为通常信噪比为3 3：1 1或或2 2：1 1时，检测限可以被接受。时，检测限可以被接受。276 6）检检测测限（限（LODLOD或或DLDL) ) p数据要求数据要求应当提供检测应当提供检测限限和测定检测和测定检测限限的方法的方法如果方法采用信噪比法，应提供测试图谱如果方法采用信噪比法，应提供测试图谱，说明测试过程，说明测试过程和
18、检测限结果。和检测限结果。7 7）定量限（）定量限（Limit of Quantitative, LOQLimit of Quantitative, LOQ或或QLQL）p定定义义：定定量量限限系系指指供供试试品品中中被被测测成成分分能能被被定定量量测测定定的的最最低低量量，其其测测定定结结果果应应具具一一定定准准确确度度和和精精密密度度。杂杂质质和和降降解解产产物用定量测定方法研究时，应确定定量限。物用定量测定方法研究时，应确定定量限。 p推荐测定法：推荐测定法：- -以以信信噪噪比比10:110:1时时的的浓浓度度( (或或量量) )进进样样测测定定, ,重重复复测测定定的的响响应应值值应
19、满足精密度要求。应满足精密度要求。8 8）耐用性）耐用性定定义义：耐耐用用性性系系指指在在测测定定条条件件有有小小的的变变动动时时，测测定定结结果果不不受受影响的承受程度。可用于说明正常使用时的可靠性。影响的承受程度。可用于说明正常使用时的可靠性。1.1.典典型型的的变变动动因因素素有有：被被测测溶溶液液的的稳稳定定性性, ,样样品品提提取取次次数数，时间等。时间等。8 8）耐用性）耐用性-考察因素考察因素p2.HPLC2.HPLC法法中典型的变动因素：中典型的变动因素： 流动相流动相pHpH值变化的影响值变化的影响； 流动相组分变化的影响；流动相组分变化的影响； 不同色谱柱不同色谱柱( (不
20、同的批号和或供应商不同的批号和或供应商) )； 柱温柱温； 流速。流速。8 8）耐用性）耐用性-考察因素考察因素p3.GC3.GC法法中典型的影响因素中典型的影响因素： 不同色谱柱不同色谱柱( (不同的批号和或供应商不同的批号和或供应商) )； 柱温柱温 流速流速 固定相固定相 不同类型的载体不同类型的载体 8 8）耐用性耐用性-考察因素考察因素44溶液的稳定性研究溶液的稳定性研究溶液的稳定性研究用来证明根据相应方法制备的样品溶液溶液的稳定性研究用来证明根据相应方法制备的样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在一定时间内保持稳定。和标准品溶液在规定的储存条件下在一定时间内保持稳定。如果方法中没
21、有规定有效期，样品溶液和标准品溶液需进行如果方法中没有规定有效期，样品溶液和标准品溶液需进行稳定性研究。稳定性研究。测定结果与初始结果进行比较，符合接受标准便可确认样测定结果与初始结果进行比较，符合接受标准便可确认样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在规定储存时间是品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在规定储存时间是稳定的。稳定的。33二、分析方法验证二、分析方法验证6 6、验证接受标准（含量、验证接受标准（含量-HPLC,GC,UV-HPLC,GC,UV）验证内容验证内容接受标准接受标准精密度精密度/ /重复性重复性RSD2.0%RSD2.0%，n6n6中间精密度中间精密度RSD2.0%R
22、SD2.0%，n4n4专属性专属性色谱法：色谱峰分离，无干扰色谱法：色谱峰分离，无干扰线性线性-相关系数相关系数-截距截距-剩余标准差剩余标准差r0.998r0.9982.0%2.0%2.0%2.0%范围范围至少标示量（至少标示量（100%100%溶液）的溶液）的80-120%80-120%准确度准确度-平均回收率平均回收率-回收率的回收率的RSDRSD98.0-102.0%(n=998.0-102.0%(n=9，3 3个浓度，每个浓度三份样品）个浓度，每个浓度三份样品）2.0%(n92.0%(n9，至少，至少3 3个浓度，每个浓度测个浓度，每个浓度测3 3次次) )稳定性稳定性- -样品溶液
23、样品溶液- -对照溶对照溶液液规定时间内变化规定时间内变化2.0%2.0%耐用性耐用性系统适用性实验通过系统适用性实验通过需验证项目需验证项目注意：注意：“否否” ” 表示通常不需要做的项目：表示通常不需要做的项目： “ “是是”表示通常需要做表示通常需要做的项目。的项目。假如已做了重现性，就不需再做中间精密度；假如已做了重现性，就不需再做中间精密度；分析方法缺乏专属性，可以由其他分析方法来补充；分析方法缺乏专属性，可以由其他分析方法来补充；视具体情况予以验证视具体情况予以验证，有些情况下可能需要。，有些情况下可能需要。项项目内容目内容鉴别鉴别杂质测杂质测定定含量含量测测定定定量定量限度限度准
24、确度准确度否否是是否否是是精密度精密度重复性重复性否否是是否否是是中中间间精密度精密度否否是是否否是是专专属性属性是是是是是是是是检测检测限限否否是是是是否否定量限定量限否否是是否否否否线线性性否否是是否否是是范范围围否否是是否否是是耐用性耐用性是是是是是是是是三、分析方法验证常见问题三、分析方法验证常见问题样品的选择问题样品的选择问题供试品溶液制备考察不全面供试品溶液制备考察不全面 对照品溶液浓度与供试品不匹配对照品溶液浓度与供试品不匹配标准曲线的制备标准曲线的制备 样品测定不在线性范围之内取样、范围样品测定不在线性范围之内取样、范围太小、单位等问题太小、单位等问题色谱条件的选择色谱条件的选择 应详述理由并附相关图谱应详述理由并附相关图谱方法改变后应与原方法作比较方法改变后应与原方法作比较对照品溶液的制备对照品溶液的制备 对照品称量难以达到精密称定的要求对照品称量难以达到精密称定的要求回收率测定问题回收率测定问题谢谢！谢谢！37结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！38
