第第12章章 高效液相色谱高效液相色谱法法high performance liquid chromatographyHPLC HPLC与经典与经典LC区别区别经典液相色谱经典液相色谱经典液相色谱经典液相色谱现代液相色谱现代液相色谱现代液相色谱现代液相色谱固定相颗粒较大，不均固定相颗粒较大，不均固定相颗粒较大，不均固定相颗粒较大，不均匀匀匀匀固定相颗粒小，均匀固定相颗粒小，均匀固定相颗粒小，均匀固定相颗粒小，均匀常压下输送流动相常压下输送流动相常压下输送流动相常压下输送流动相高压下输送流动相高压下输送流动相高压下输送流动相高压下输送流动相柱效低柱效低柱效低柱效低柱效高柱效高柱效高柱效高分析周期长分析周期长分析周期长分析周期长分析周期短分析周期短分析周期短分析周期短 第第2 2节节 基本理论基本理论- -速率理论速率理论一、柱内展宽一、柱内展宽Csm为静态流动相传质阻力系数为静态流动相传质阻力系数 组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱峰组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱峰展宽影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度1.涡涡 流流 扩散扩散 项项 A 减少方法减少方法 ：： a 降低降低dp：：目前商品柱多采用目前商品柱多采用3-5μm粒径粒径 b 降低降低λ：：采用球形、均匀分布固定相。
采用球形、均匀分布固定相 B=2γDm Dm ∝∝T/η 2. 2. 纵纵 向向 扩扩 散散 项项 B/uB/u样品分子沿流动相方向产生扩散，所引起样品分子沿流动相方向产生扩散，所引起峰展宽峰展宽u是最佳流速的是最佳流速的3-5倍倍B/u忽略忽略液相色谱中液相色谱中Dm比比GC中小中小105 3.3.流动的流动相传质阻力项流动的流动相传质阻力项C Cm mu u流动相本身，处于不流动相本身，处于不同层流的分子具有不同层流的分子具有不同流速Dm ∝∝T/η 减免方法：减免方法：1）减少固定相颗粒直径）减少固定相颗粒直径 2）减少流动相液体黏度（甲醇））减少流动相液体黏度（甲醇） 4. 4. 静态流动相传质阻力项静态流动相传质阻力项C Csmsmu u原因：处于固定相颗粒原因：处于固定相颗粒内部孔洞内静态流动相内部孔洞内静态流动相引起引起影响影响C Csmsmu u的因素与的因素与C Cm m相同相同 5. 5. 固定相的传质阻力项固定相的传质阻力项C Cs su u影响因素：固定相内部阻力影响影响因素：固定相内部阻力影响 减免方法：减少固定相液膜厚度减免方法：减少固定相液膜厚度——化学键合相化学键合相 6 6、、HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择H = A + （（Cm+Csm））u1. 固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相（（dp≤10μm）） 首选化学键合相，匀浆首选化学键合相，匀浆法装柱法装柱 2. 2. 流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相——甲醇，甲醇，1ml/min 3. 3. 柱温的选择：柱温的选择： 选室温选室温25-300C左右。
太低，流动相黏度增加，左右太低，流动相黏度增加，太高容易产生气泡太高容易产生气泡 二、柱二、柱 外外 展展 宽宽减免方法：应尽可能减少柱外死体积减免方法：应尽可能减少柱外死体积从进样器到检测器之间的体积称柱外死从进样器到检测器之间的体积称柱外死体积，均可导致色谱展宽，柱效下降体积，均可导致色谱展宽，柱效下降 第第3 3节节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法吸附色谱法吸附色谱法化学键合相化学键合相离子对色谱法离子对色谱法 一、吸一、吸 附附 色色 谱谱 法法1 1．分离原理．分离原理2．固定相：极性和非极性固定相．固定相：极性和非极性固定相3．流动相：底剂（烷烃）．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂有机极性调节剂 二、二、 化学键合相色谱法化学键合相色谱法（（bonded phase chromatography, BPC））化学键合相：采用化学反应的方法化学键合相：采用化学反应的方法 将固将固定液的官能团键合在载体表面上定液的官能团键合在载体表面上优点：固定相不易流失优点：固定相不易流失 适用于各种样品的分离分析适用于各种样品的分离分析 正相键合相色谱法正相键合相色谱法：：极性键合相，如氨基柱、氰基柱极性键合相，如氨基柱、氰基柱适用：极性化合物适用：极性化合物 反相键合相色谱法：反相键合相色谱法：非极性键合相，如非极性键合相，如C18柱、柱、C8柱柱适用：非极性至中等极性化合物适用：非极性至中等极性化合物分分 类类 1）分离原理）分离原理 流流动动相相与与溶溶质质有有排排斥斥力力，，促促使使溶溶质质分分子子与与键键合合相相的的烃烃基基发发生生疏疏水水缔缔合合，，且且缔缔合合反反应应是是可可逆的。
逆的 k↓，，组分组分tR↓1 1、反相键合相色谱法（、反相键合相色谱法（RP-HPLCRP-HPLC）） 2）固定相：）固定相：极性小的烷基键合相极性小的烷基键合相 C8柱，柱，C18柱（柱（ODS柱）柱）十八烷基键合相：常用的非极性键合相十八烷基键合相：常用的非极性键合相反相键合相色谱法（反相键合相色谱法（RP-HPLC）） 低碳型低碳型：： R R1 1、、R R2 2都是氯都是氯高碳型高碳型：：R R1 1、、R R2 2是两个甲基是两个甲基 特点：载样量大，保留能力强特点：载样量大，保留能力强键键 合合 相相 分分 类类中碳型中碳型：：R R1 1、、R R2 2其中一个是氢，一个为氯其中一个是氢，一个为氯 表面覆盖度表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目，：参加反应的硅醇基数目，占硅胶表面硅醇基总数的比例占硅胶表面硅醇基总数的比例作用：作用：决定了键合相是分配还是吸附占决定了键合相是分配还是吸附占主导主导封尾封尾：为了减少残余的硅醇基，一般在：为了减少残余的硅醇基，一般在键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子进行钝化处理。
进行钝化处理 3）流动相：）流动相：极性大的甲醇极性大的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水水 流动相极性流动相极性 > 固定相极性固定相极性 底剂底剂 + 有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂） 例：水例：水 + 甲醇，乙腈，四氢呋喃甲醇，乙腈，四氢呋喃 反相键合相色谱法（反相键合相色谱法（RP-HPLC）） 4）流动相极性与）流动相极性与k的关系：的关系： 流动相极性流动相极性↑↑，洗脱能力，洗脱能力↓↓，，k↑k↑，，组分组分t tR R↑↑5）出柱顺序）出柱顺序：：极性大的组分先出柱极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱6）适用：）适用：非极性非极性- -中等极性组分中等极性组分反相键合相色谱法（反相键合相色谱法（RP-HPLC）） 用用ODSODS柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇- -水水（（9595：：5 5））问：问：①①哪个先出柱哪个先出柱②②若要增大若要增大t tR R，应增大甲醇还是水的比例，应增大甲醇还是水的比例? ?例：例： 1）分离机制：）分离机制：2）固定相：）固定相：极性大的极性大的氰基氰基或或氨基氨基键合相键合相3）流动相：）流动相：极性小极性小 底剂底剂 + 有机极性调节剂有机极性调节剂 üü 例：正己烷例：正己烷 + + 氯仿氯仿- -甲醇，氯仿甲醇，氯仿- -乙醇乙醇2 2、正相键合相色谱法（、正相键合相色谱法（NP-HPLCNP-HPLC）） 4）流动相极性与）流动相极性与k的关系：的关系： 流动相极性流动相极性↑，洗脱能力，洗脱能力↑，组分，组分tR↓，，k↓5）出柱顺序：）出柱顺序：极性小的组分先出柱极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱极性大的组分后出柱正相键合相色谱法（正相键合相色谱法（NP-HPLCNP-HPLC）） 6）适用）适用：：氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似氨基键合相：糖类等氨基键合相：糖类等 3 3．离子对色谱法（．离子对色谱法（IPCIPC或或PICPIC））反相色谱中，在极性流动相中加入反相色谱中，在极性流动相中加入反相色谱中，在极性流动相中加入反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂离子对试剂离子对试剂离子对试剂，使被测组分，使被测组分，使被测组分，使被测组分与其中的反离子形成与其中的反离子形成与其中的反离子形成与其中的反离子形成中性离子对中性离子对中性离子对中性离子对，增加，增加，增加，增加k k和和和和t tR R，，，，以改善分离以改善分离以改善分离以改善分离1 1 1 1）离子对试剂：）离子对试剂：）离子对试剂：）离子对试剂：烷基磺酸钠烷基磺酸钠烷基磺酸钠烷基磺酸钠→→→→分析碱分析碱分析碱分析碱 四丁基季胺盐四丁基季胺盐四丁基季胺盐四丁基季胺盐→→→→分析酸分析酸分析酸分析酸2 2 2 2）影响）影响）影响）影响k k k k的因素的因素的因素的因素a a a a．与．与．与．与m m m m的极性有关（同反相色谱）的极性有关（同反相色谱）的极性有关（同反相色谱）的极性有关（同反相色谱）b b b b．与．与．与．与R R R R的链长有关：的链长有关：的链长有关：的链长有关：R↑R↑R↑R↑长，极性长，极性长，极性长，极性↓↓↓↓小，小，小，小，t t t tR R R R↑↑↑↑，，，，k↑ k↑ k↑ k↑ 3 3 3 3））））适用：适用：适用：适用：较强的有机酸、碱较强的有机酸、碱较强的有机酸、碱较强的有机酸、碱 3 3．洗脱方式．洗脱方式．洗脱方式．洗脱方式 1 1））））等度洗脱等度洗脱等度洗脱等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）（恒组成溶剂洗脱）（恒组成溶剂洗脱）（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似类似类似类似GCGC的等温度洗脱的等温度洗脱的等温度洗脱的等温度洗脱2 2））））梯度洗脱：梯度洗脱：梯度洗脱：梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵）即不断改变其极性（两个泵）即不断改变其极性（两个泵）即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分 类似类似类似类似GCGC的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品） Phenomenex Luna C18（（250mm×4.6mm，，5 m））色谱柱色谱柱 (Aschaffenburg, Germany)。
流动相：流动相：(A)乙腈乙腈-(B)0.3%醋酸水溶液进行梯度洗脱：醋酸水溶液进行梯度洗脱：0-30min：：A 28%，，B 72%；； 30-53min：： A 28％升至％升至34％，％，B 72％降至％降至66％；％；53-70min：： A 34％升至％升至80％，％，B 66％降至％降至20％流速：流速：1.0 ml·min-1；；检测波长：检测波长：275 nm；；进样量：进样量：20μl；；柱温：柱温：30℃；； 流动相的性质和选择流动相的性质和选择1、流动相的物理性质、流动相的物理性质 1)流动相要求：流动相要求：①①易得易纯化，无毒不易燃易得易纯化，无毒不易燃②②检测器的适应性检测器的适应性:如如紫外紫外检测器对检测器对溶剂的透明波长要求；溶剂的透明波长要求；示差折光示差折光不能不能用梯度洗脱用梯度洗脱③③对样品有一定溶解度而不反应对样品有一定溶解度而不反应④④纯净纯净,低廉低廉,低粘度低粘度(5×10-4Pa.S),低沸点低沸点(>柱温柱温(20~50)) 2)流动相的流动相的物理性质物理性质沸点沸点bp、分子量、分子量M、密度、介电常数、密度、介电常数e粘度粘度η、折射率、折射率RI、紫外吸收截止波长、紫外吸收截止波长溶剂强度参数溶剂强度参数ε(Al2O3)、、溶解度参数溶解度参数δ(色散色散δd、取向极性、取向极性δ0、受质子、受质子δa给质子给质子δh)、、溶剂极性参数溶剂极性参数P/ (质子接质子接受受xe、给质子、给质子xd、偶极、偶极xn)、、选择性分选择性分组组、表面张力、、表面张力、离子对色谱溶剂强度离子对色谱溶剂强度(P/+0.25e) 常用于常用于HPLC流动相溶剂的性质流动相溶剂的性质溶溶剂P/εXeXeXdXdXnXn选择全氧全氧烃<-2<-20.250.25正戊正戊烷0 00 0正已正已烷0.10.10.010.01正庚正庚烷0.20.20.010.01环已已烷-0.2-0.20.040.04四四氯化碳化碳1.61.60.180.18苯苯2.72.70.320.320.230.230.320.320.450.457 7甲苯甲苯2.42.40.290.290.250.250.280.280.470.477 7乙乙醚2.82.80.380.380.530.530.130.130.340.341 1二二氯甲甲烷3.13.10.420.420.290.290.180.180.530.535 5正丙醇正丙醇4.04.00.820.820.540.540.190.190.270.272 2 正丁醇正丁醇3.93.90.70.70.590.590.190.190.250.252 2四四氢呋喃喃4.04.00.570.570.380.380.200.200.420.423 3乙酸乙乙酸乙酯4.44.40.580.580.340.340.230.230.430.436 6氯仿仿4.14.10.400.400.250.250.410.410.330.337 7甲乙甲乙酮4.74.70.510.510.350.350.220.220.430.437 7二氧六二氧六烷4.84.80.560.560.360.360.240.240.400.406 6吡吡啶5.35.30.710.710.410.410.220.220.360.363 3硝基乙硝基乙烷5.25.20.600.600.280.280.290.290.430.437 7丙丙酮5.15.10.500.500.350.350.230.230.420.426 6乙醇乙醇4.34.30.880.880.520.520.190.190.290.292 2乙酸乙酸6.06.01.01.00.390.390.310.310.300.304 4乙乙腈5.85.80.650.650.310.310.270.270.420.426 6DMFDMF6.46.40.390.390.210.210.400.403 3二甲二甲亚砜7.27.20.750.750.390.390.230.230.390.393 3甲醇甲醇5.15.10.950.950.480.480.220.220.310.312 2硝基甲硝基甲烷6.06.00.640.640.280.280.310.310.400.407 7乙二醇乙二醇6.96.91.111.110.430.430.290.290.280.284 4甲甲酰胺胺9.69.60.360.360.330.330.300.304 4水水10.210.20.370.370.370.370.250.258 8 ①①溶剂的强度因素溶剂的强度因素ε,P/规定：戊烷在规定：戊烷在Al2O3的的ε=0ε(硅胶硅胶)=ε(Al2O3)×0.77 混合溶剂混合溶剂 ?N摩尔分数摩尔分数;nB为吸附剂吸一个为吸附剂吸一个B分子所占面积分子所占面积,β吸附剂吸附剂活性。
一般活性一般0.6≤β≤1.0, nB=4-6随随B分子体积而变化分子体积而变化 ε0：液：液-固色谱中溶剂强度参数，反固色谱中溶剂强度参数，反映溶剂分子对吸附剂亲和力映溶剂分子对吸附剂亲和力经验：经验：ε0减小减小0.05，，k值增加值增加1~3倍倍②②溶解度参数溶解度参数δEC是是1mol气体变液体释放能量气体变液体释放能量;Vm液体摩尔体积液体摩尔体积 δ=色散色散δ+偶极偶极δ+接受质子接受质子δ+给出质子给出质子δ ③③极性参数极性参数P/ Kg为极性分配系数为极性分配系数P’:液液-液色谱溶剂极性参数，表示溶液色谱溶剂极性参数，表示溶剂洗脱强度和溶剂的选择性剂洗脱强度和溶剂的选择性经验：经验：P’改变改变2单位，单位，k值改变值改变10倍倍 极性参数极性参数P与溶剂强度参数关系与溶剂强度参数关系[投影投影]溶溶剂P PXeXeXdXdXnXn溶溶剂P PXeXeXdXdXnXn正戊正戊烷0 0乙醇乙醇4.34.30.520.520.190.190.290.29正已正已烷0.10.1乙酸乙酸乙乙酯4.44.40.340.340.230.230.430.43苯苯2.72.70.230.230.320.320.450.45丙丙酮5.15.10.350.350.230.230.420.42乙乙醚2.82.80.530.530.130.130.340.34甲醇甲醇5.15.10.480.480.220.220.310.31二二氯甲甲烷3.13.10.290.290.180.180.530.53乙乙腈5.85.80.310.310.270.270.420.42正丙醇正丙醇4.04.00.540.540.190.190.270.27乙酸乙酸6.06.00.390.390.310.310.300.30四四氢呋喃喃4.04.00.380.380.200.200.420.42水水10.210.20.370.370.370.370.250.25氯仿仿4.14.10.250.250.410.410.330.33 ④④粘度参数粘度参数注意注意:溶剂常用溶剂常用0.4-0.5mPa.s,太大柱太大柱效下降效下降,大小易成气泡大小易成气泡,混合时一般粘混合时一般粘度变化非线性度变化非线性 1 2 3 4水0B1001.正丙醇2.乙醇3.甲醇4.乙腈 2、溶剂的选择性与分类、溶剂的选择性与分类(Snyder)K与分子之间作用力？与分子之间作用力？色散力、偶极力、氢键力色散力、偶极力、氢键力 参考物的选择参考物的选择 (Snyder法法) 强偶极作用强偶极作用------硝基甲烷硝基甲烷-------Xn质子给予体质子给予体------乙醇乙醇-------------Xd质子接受体质子接受体------二氧六环二氧六环-------Xe参考物与被检溶剂间作用力关系表参考物与被检溶剂间作用力关系表参考物参考物给质子子—乙醇乙醇受受质子子—二氧六二氧六环强强偶极偶极—硝基甲硝基甲烷被被检溶溶剂作用力作用力接受接受质子子作用力作用力Xe给质子作子作用力用力Xd偶极作用偶极作用力力Xn 表表2 Snyder的溶剂选择性分组的溶剂选择性分组 混合溶剂混合溶剂P/：：?注注:模糊聚类法模糊聚类法 把溶剂对质子给予体、质子接受体、电把溶剂对质子给予体、质子接受体、电子给予体、电子接受体和定向作用力化子给予体、电子接受体和定向作用力化合物的选择性五个参数进行分类，选择合物的选择性五个参数进行分类，选择21种常用溶剂种常用溶剂 表表 混合溶剂的溶剂特性混合溶剂的溶剂特性 举例：举例：在反相色谱中，计算甲醇在反相色谱中，计算甲醇-水水(60:40)的溶剂溶剂强度，如果改用的溶剂溶剂强度，如果改用相同强度的乙腈相同强度的乙腈-水溶剂，四氢呋喃水溶剂，四氢呋喃和水其比例是多少？和水其比例是多少？解：查表得甲醇、乙腈、四氢呋喃和解：查表得甲醇、乙腈、四氢呋喃和水的溶剂强度水的溶剂强度S分别为分别为2.6,3.2,4.5,0 甲醇甲醇-水：水：S=0.60×2.6+0.40×0=1.56乙腈乙腈-水水 S=X×3.2+(1-X)×0=1.56 X=0.49 THF-水水 S=X×4.5+(1-Y)×0=1.56 Y=0.35 2)选择一般原则选择一般原则 正相键合相正相键合相 反相键合相反相键合相主体溶剂主体溶剂 正已烷正已烷(正庚烷、正戊烷正庚烷、正戊烷) 水水选择性溶剂选择性溶剂 a.质子接受体质子接受体 乙醚或甲基叔丁基醚乙醚或甲基叔丁基醚 甲醇甲醇*b.质子给予体质子给予体 氯仿氯仿 乙腈乙腈*c.偶极偶极 二氯甲烷二氯甲烷 四氢呋喃四氢呋喃* 3溶剂优化的步骤：溶剂优化的步骤：1.首选择溶剂2.多元溶剂系统组成3.洗脱能力的选择(ε,P/,S)调k重点组分k=(t-t0)/t0 ≈34.改变溶剂系统改变选择性5.混合溶剂优化6.PH缓冲剂、胺、配合物、添加剂离子强度调节剂7.组分性质差别大可用梯度洗脱 如如:四面体四面体-三角形法三角形法1选择乙腈选择乙腈-水水,2.比例比例100%往下调节确定往下调节确定k值而得最值而得最适合的比例适合的比例.图图9-293.改变溶剂改变溶剂:甲醇-水;THF-水比例计算找等洗脱强度三角形图图9-304.混合溶剂混合溶剂:三元、四元三元、四元图图9-335.七种溶剂流动相色谱分析七种溶剂流动相色谱分析 图图9-34 4、色谱分离条件的优化指标、色谱分离条件的优化指标1)色谱响应系数色谱响应系数其中其中:P=f/g,n相邻峰对数相邻峰对数;tM最大最大容许时间容许时间,tL实际时间，实际时间，α常数常数2)色谱优化函数色谱优化函数 Ai权重因子权重因子,R分离度分离度COF绝对值越大越差绝对值越大越差 [举例举例]取代萘混合物分离的优化试验取代萘混合物分离的优化试验色谱柱：色谱柱：Zorbax-C8（（150×0.46cm））1.选择溶剂强度使溶质容量因子在选择溶剂强度使溶质容量因子在1~10 选择二元溶剂选择二元溶剂溶剂溶剂 %有机有机 相近似相近似k值值 (计算值计算值 实验值实验值)乙腈乙腈 52 52 0.7~8 A甲醇甲醇 64 63 0.6~8 B四氢呋喃四氢呋喃 37 39 0.6~7 C取值取值:乙腈乙腈3.2;甲醇甲醇2.6;四氢呋喃四氢呋喃4.5水水0 2、作下列流动相的色谱图、作下列流动相的色谱图,求求β=0,Ai=1,Rd为为1.2;1.8;2.4时时COF值值C:A+B D:B+C E:C+A F:A+B+C 表表 Zorbax C8柱上取代萘的柱上取代萘的COF值值 流流 动 相相 COFRd= 1.2 1.8 2.4A-0.248 -3.21 -3.79A+B-0.248 -2.89 -3.18B-0.99 -1.80 -2.38B+C 0.00 -0.12 -0.38C-4.97 -5.78 -6.53C+A-2.48 -3.41 -4.27A+B+C 0.00 -0.38 -.067最佳最佳61%B+39%C 0.00 -0.07 -.036 。