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1、欢迎您阅读并下载本文档，本文档来源于互联网，如有侵权请联系删除！我们将竭诚为您提供优质的文档！不同品种枇杷果实酚类物质及其抗氧化活性解析 酚类物质是植物重要的次生代谢产物之一，广泛存在于植物中，影响植物的品质，由于酚类物质结构中携有一个或多个羟基， 对自由基有良好的清除能力， 表现出很强的抗氧化活性， 因而植物酚类物质及抗氧化活性研究成为近年农业科研领域的热点， 在枇杷叶、 花、 核、果已有相关报道。 研究表酚类具体的组成及各成分含量与抗氧化能力有很高的相关性， 在枇杷花、叶中也得到相同结果，枇杷果实中酚类的组成研究较少，仅张文娜、徐红霞等研究了浙江 10 个品种的枇杷果实酚类物质组成， 其他
2、品种尚未见报道。 福建是枇杷的主产区之一，2013 年年产量达 23.7 万吨，主栽的品种有红肉系的早钟 6 号、长红 3 号、解放钟和白肉系的白梨等， 本实验以这 4 种枇杷果实为试材， 采用超声波辅助乙醇提取法提取其中的酚类物质， 用 DPPH 法( DPPH 自由基清除法) 和 FRAP 法( 铁还原比色法) 来评价其抗氧化能力，并使用高效液相色谱法分析酚类组成， 研究不同品种果实酚类组成与抗氧化性关系， 并与已研究较多的宁海白比较，以期为枇杷深加工提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 5 种枇杷果实莆田市果树研究所提供， 按成熟时间分为早熟的早钟 6 号， 中熟的长红 3
3、 号和宁海白，中晚熟的白梨及晚熟的解放钟，果实于正常食用成熟度采收，当天运至实验室，选取成熟度一致、无虫害、无明显损伤、果实饱满的枇杷置于-70 超低温冰箱冷冻保存待用; 表儿茶酸、鞣花酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸美国 Sigma 公司; 新绿原酸、隐绿原酸、TPTZ( 2，4，6-反式 2-吡啶基三嗪) 、DPPH( 1，1- 二苯基-2- 三硝基苯肼) 上海源叶生物科技有限公司; 甲醇、乙腈色谱纯，国药集团化学试剂有限公司; 其他试剂分析纯; 实验用水超纯水。 Agilent 1100 高效液相色谱仪美国 Agilent 公司采用紫外检测器 ZORBAXSB-C18 色谱柱( 150 mm
4、4.6 mm，5 722- 型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司; KQ-100DE 型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司; KDC-40 低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司; Ultra pure 超纯水机上海和泰仪器有限公司。 1.2 实验方法 1.2.1 枇杷果实酚类物质提取果实从冰箱取出去皮去核后，果肉迅速切成碎末，准确称取10.000 g，加入 30 mL 70%乙醇溶液，浸泡 1 h，超声提取 20 min( 温度 30 ，功率 200 W) ，再以 5000 g 的转速离心 20 min，减压抽滤得到滤液，滤液用 70% 乙醇定容至 50 mL，即为枇杷果实提取液， 用于测定
5、DPPH的清除能力和铁离子还原能力及浓缩后用于酚类物质分析。 1.2.2 总酚含量测定采用 Folin-Ciocaileu 比色法测多酚含量， 取 1 mL 提取液加入 20 mL 水，2.5 mLFoLin-CiocaLteu 试剂，反应 5 min 后加入 2.5 mL 饱和碳酸钠溶液，最后加水定容至50 mL 静置 2 h， 于 765 nm 波长处测定其吸光度。 以没食子酸( GAE) 为标样绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中总酚含量，结果以样品中含有的没食子酸当量( g /g FW)表示。 1.2.3 提取液枇杷果实抗氧化能力的测试 1.2.3.1 清除 DPPH 能力的测定参照文
6、献加以修改， DPPH 乙醇溶液浓度为2.13 10 - 4 mol /L，取等体积的 DPPH 溶液和枇杷提取液混合，室温避光反应 30 min 后于 517 nm 波长处测定其吸光度( Ai) ; 等体积的 DPPH 溶液和乙醇混合，测溶液的吸光值( A0) ; 等体积的提取液和乙醇混合， 测溶液的吸光值( Aj) 。 记录 A0， Ai 和 Aj， 按下列公式计算清除率 IP:IP( %) = 100。 1.2.3.2 铁离子还原力测定参照文献方法测试提取液 FRAP 值。取 1 mL 提取液，稀释至25 mL。取该稀释液 1 mL，加入 2.7 mL FRAP 工作液( 20 mmol
7、 /L 三氯化铁溶液、300 mmol /L 醋酸盐缓冲液、 10 mmol /LTPTZ 溶液按 1 10 1 配制) ， 加入 6 mL 水， 37 下反应 10 min 后测定 593 nm 处的吸光度。以硫酸亚铁铵溶液为标样绘制标准曲线，以达到相同吸光度所需硫酸亚铁的量来计算样品 FRAP 值，单位为 mmol /L。 1.2.4 枇杷果实提取液的 HPLC 分析 1.2.4.1 HPLC 检测条件色谱柱: Kromasil C18( 150 mm 欢迎您阅读并下载本文档，本文档来源于互联网，如有侵权请联系删除！我们将竭诚为您提供优质的文档！4.6 mm) ; 进样量: 20 流速:
8、0.8 mL/min;柱温: 30 ; 检测波长: 280 nm; 流动相 A: 5%乙酸水溶液; 流动相B: 100% 乙腈。 梯度洗脱程序: 0 25 min时A 从90% 降至70%， 25 35 min 时 A 从 70%升回至 90%。 1.2.4.2 酚单体的 HPLC 分析分别准确称取 7 种酚单体对照品，用色谱纯的甲醇溶解，配制成 0.1 mg /mL 的溶液，测定其保留时间。再配制各酚单体浓度为 0.1 mg /mL 的混合对照品溶液并逐级稀释，测定峰面积，计算得到浓度与峰面积的回归方程，溶液测试前过 0.45 m 的滤膜。 1.2.4.3 样品的处理与分析取 25 mL 的
9、提取液减压蒸馏除去乙醇，再用正己烷萃取 3 次，通过减压蒸馏除去正己烷后， 用甲醇定容到 5 mL， 用于 HPLC 分析， 溶液测试前过 0.45 m 的滤膜，采用外标法计算含量。 1.3 综合抗氧化能力指数( APC) 的计算 参照文献计算综合抗氧化能力指数( APC)来进行提取液中酚类物质抗氧化活性的总体比较:APC 指数= 。 1.4 数据分析 所有测定重复 3 次， 运用 Origin 8.5 软件进行数据作图， 运用 SPSS 20 软件进行数据分析: 单因素显著性分析( One-way analysis of variance，ANOVA) ，皮尔森相关性分析( Pearsons
10、 correlation analysis) 。所得结果采用平均数据 标准偏差表示。 2 结果与分析 2.1 不同品种枇杷果实总酚含量与抗氧化活性分析 没食子酸线性回归方程为 y = 0.0078x + 0.0026， R2 = 0.9986， 线性范围: 4.1028.67 mg /L。对照回归方程可得 5 个品种枇杷果实的总酚含量介于 327.31615.22 g /g 之间( 见表 1) ，高低顺序为解放钟早钟 6 号宁海白白梨长红 3 号，其中宁海白的总酚含量与冯健君的报道吻合，比徐红霞的结果低，可能是由生长环境及成熟度不同引起。早钟 6 号与解放钟果实的总酚含量接近于长红 3 号与白
11、梨含量的 2 倍，组间差异达到显著水平。由表 2 可知道，5 个品种枇杷果实提取液均有抗氧化活性，其中 DPPH 法显示清除能力排序为宁海白早钟 6 号长红 3 号解放钟白梨，早钟 6 号与解放钟、白梨的差异达到显著水平; FRAP 法( 回归方程为 y = 0.9686x-0.0333，R2= 0.9982，线性范围: 0.2 2.0 mmol /L 测定的结果显示各品种抗氧化能力排序为宁海白早钟 6 号解放钟长红 3 号白梨。DPPH 法主要评价物质的清除自由基能力，FRAP 法评价物质的还原能力，测试方法不同，响应物不同，2 种评价结果不完全一致说明反应底物可能有区别，可进一步分析其组成
12、。综合抗氧化能力指数 APC 显示福建产的红肉系的早钟 6 号、解放钟、长红 3 号总抗氧化活性高于白肉系的白梨，早钟 6 号正是福建主栽的枇杷品种，抗氧化能力较高说明其在营养保健方面有一定优势。 2.2 不同品种枇杷果实酚类物质组成分析 2.2.1 不同品种枇杷果实的酚类物质组成定性定量分析参考文献报道，通过对比对照品、样品及加标样品的保留时间，用 HPLC 法共鉴定出 7 种酚类物质，按出峰时间排序为: 新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，表儿茶素，咖啡酸，鞣花酸，阿魏酸。各酚含量总体上为绿原酸 新绿原酸 隐绿原酸 表儿茶素 阿魏酸 咖啡酸 鞣花酸， 绿原酸含量明显高于其他酚类物质，与报道相符，且
13、其在 5 个品种中的含量差异达到显著水平，其中宁海白中最高，早钟 6 号次之; 新绿原酸和隐绿原酸的含量大小顺序均为宁海白早钟 6 号长红 3 号解放钟白梨 表儿茶素、咖啡酸、鞣花酸和阿魏酸的含量较低，大小顺序随品种变化较大。整体上看宁海白和早钟 6 号的各种酚单体含量均比较高，白梨最低; 长红 3 号与解放钟中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、表儿茶素等的含量差异均达到显著水平，但总含量相近，这与其总抗氧化能力大小相符。 2.2.2 枇杷果实抗氧化物质组成与抗氧化能力相关性分析从表 3 可见，总酚含量及 HPLC 欢迎您阅读并下载本文档，本文档来源于互联网，如有侵权请联系删除！我们将竭诚为您提供
14、优质的文档！法测定的总含量与 DPPH 清除能力、FRAP 值都呈正相关关系，其中与总酚含量 DPPH 的相关性到达显著水平，但酚单体与抗氧化能力 DPPH、 FRAP 的关系不尽相同。 其中新绿原酸、绿原酸含量与 DPPH 呈显著的正相关( r 分别为 0.941、0.887，p 均小于 0.05) ，与 FRAP 存在正相关。隐绿原酸含量与 DPPH 存在极显著的线性正相关关系( r = 0.963，p 小于 0.01) ，与 FRAP 存在正相关但相关性不显著。表儿茶素含量与 DPPH、FRAP; 咖啡酸含量与 DPPH、FRAP; 鞣花酸含量与 DPPH 均呈中等强度相关但影响效果不显著。 其它酚单体与抗氧化能力的相关性较弱，可能是因为含量较低或者本身抗氧化能力比较弱。 3 结论 运用 2 种方法来评价枇杷果实抗氧化能力，结果表明宁海白的抗氧化能力最高，白梨的抗氧化能力最低。福建产的枇杷抗氧化能力为: 红肉枇杷果实 白肉枇杷果实，早钟 6 号最高。HPLC 检测表明在 5 种枇杷果实中均存在 7 种酚类物质，分别是新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，表儿茶素，咖啡酸，鞣花酸，阿魏酸。绿原酸含量最高，其次是新绿原酸、隐绿原酸，这三种酚含量与抗氧化能力显著正相关，是主要的抗氧化性活性酚类物质。
