《免疫组织化学技术培训讲学》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫组织化学技术培训讲学（32页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 免疫(miny)组织化学技术 http:/第一页，共32页。免疫免疫(miny)组织化学技术组织化学技术n n基本原理基本原理n n 通过免疫学中抗原抗体结合反应通过免疫学中抗原抗体结合反应(fnyng)，用特异性抗体（单克隆或多克隆），用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原 抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应底物显色反应(fnyng)可使之呈现某种颜色，可使之呈现某种颜色，从而可检测组织
2、细胞内的抗原，以达到诊断、从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。鉴别诊断和研究的目的。第二页，共32页。n n组织与细胞材料的制备组织与细胞材料的制备n n免疫免疫(miny)组织化学方法组织化学方法第三页，共32页。组织组织(zzh)与细胞材料的制备与细胞材料的制备n n组织石蜡切片(qi pin)制作n n组织冰冻切片(qi pin)制作n n细胞爬片制作n n细胞涂片制作第四页，共32页。切片切片(qi pin)的制作的制作n n组织的固定组织的固定(gdng)n n组织石蜡包埋组织石蜡包埋n n切片切片第五页，共32页。n n目的目的目的目的: : : :n n
3、 （1 1 1 1）防止）防止）防止）防止(fngzh)(fngzh)(fngzh)(fngzh)组织细胞的死后变化，防止组织细胞的死后变化，防止组织细胞的死后变化，防止组织细胞的死后变化，防止(fngzh)(fngzh)(fngzh)(fngzh)自溶和腐败，以保持组织细胞自溶和腐败，以保持组织细胞自溶和腐败，以保持组织细胞自溶和腐败，以保持组织细胞n n 的固有形态。的固有形态。的固有形态。的固有形态。n n （2 2 2 2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗
4、原成份转变成不溶成份转变成不溶成份转变成不溶成份转变成不溶n n 性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止防止防止防止(fngzh)(fngzh)(fngzh)(fngzh)组织细胞的组织细胞的组织细胞的组织细胞的n n 死后变化，防止死后变化，防止死后变化，防止死后变化，防止(fngzh)(fngzh)(fngzh)(fngzh)自溶和腐败，以保自溶和腐败，以保自溶和腐败，以保自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。持组织细胞的固有形态。持组织细胞的固有形态。持组织细胞的
5、固有形态。n n （3 3 3 3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造同的折射率，造同的折射率，造同的折射率，造 n n 成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。n n （4 4 4 4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织）固定剂兼有硬
6、化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制硬度、便于制硬度、便于制硬度、便于制 n n 片。片。片。片。 n n （5 5 5 5）防止）防止）防止）防止(fngzh)(fngzh)(fngzh)(fngzh)细胞过度收缩或膨胀而失去其细胞过度收缩或膨胀而失去其细胞过度收缩或膨胀而失去其细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。原有形态结构。原有形态结构。原有形态结构。n n （6 6 6 6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便着色清晰，便着色清晰，便着色
7、清晰，便 于辨认。于辨认。于辨认。于辨认。组织组织(zzh)材料的固定材料的固定第六页，共32页。n n固定液的选择固定液的选择(xunz)：n n(1)甲醛固定液：甲醛固定液：10福尔马林，福尔马林，10中性中性福尔马林，福尔马林，10中中n n 性缓冲福尔马林性缓冲福尔马林n n(2)4多聚甲醛固定液多聚甲醛固定液n n(3)Bouin S液及改良液及改良Bouin S液液n n(4)Zenker S液液n n(5)Zamboni S液液 n n(6)PLP固定液：过碘酸固定液：过碘酸-赖氨酸赖氨酸-多聚甲醛固多聚甲醛固定液。该固定剂定液。该固定剂n n 较适合富含糖类组织，对超微结构及许
8、多较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保抗原的抗原性保n n 存较好。存较好。n n(7)PLPD固定液固定液 取取PLP固定液固定液25ml，加入，加入2.5%重铬酸重铬酸25ml。n n(8)Kanovsky S液液n n(9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效固定液，对核内抗原的保存效果较好。果较好。n n(10)PEG液液n n(11)0.4%对苯醌对苯醌n n(12)碳二亚酰胺碳二亚酰胺-戊二醛（戊二醛（ECG-G）液）液n n(13)丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂第七页，共32页。n n固定固定(gdng)(gdng)时间：时间：n n 固定固定(gdng)
9、(gdng)时间要视组织块的厚薄，时间要视组织块的厚薄，固定固定(gdng)(gdng)液的种类及浓度，温度而定，液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定原则上，组织块大小与固定(gdng)(gdng)时间时间成正比，固定成正比，固定(gdng)(gdng)液的穿透力及浓度液的穿透力及浓度与固定与固定(gdng)(gdng)时间成反比。时间成反比。第八页，共32页。n n大组织大组织(zzh)(zzh)：7575乙醇乙醇3030120min120min，8585乙醇乙醇3030120min120min，9595醇醇 2h 2h，9595乙醇乙醇 2h 2h，9595乙醇乙醇过夜，无水
10、乙醇过夜，无水乙醇30 30 60min60min，无，无水乙醇水乙醇303060min60min，无水乙醇，无水乙醇60min60min120min120min，二甲苯，二甲苯、和和各各15min15min（可视观察结果而定），（可视观察结果而定），石蜡石蜡30min30min石蜡石蜡112h2h，石蜡，石蜡223h3h。n n小组织小组织(zzh)(zzh)：7575乙醇乙醇30min30min，8585乙醇乙醇30min30min，9595乙醇乙醇1h1h、1h1h、过夜或过夜或2h2h，无水乙醇，无水乙醇、和和各各30min30min，二甲苯，二甲苯15min15min、10min10
11、min、10min10min（肉眼观察），石蜡（肉眼观察），石蜡30min30min，石蜡，石蜡30min30min，石蜡，石蜡112h2h。组织(zzh)石蜡包埋第九页，共32页。切切 片片n n载玻片的清洁：n n 市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2h。n n切片粘合剂的使用：（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。（2）APES试剂(shj)（3-氨基、丙基三氧基硅烷）n n 干净载玻片丙酮5min 用镊子夹住浸入APES试剂(shj)（1ml+50ml丙酮） 13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保
12、存备用。n n （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000mln n （4）甲醛明胶液：40甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml第十页，共32页。n n切片：切片：n n 石蜡切片：石蜡切片： n n (1)连续切片按序贴在玻片的下连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)5260烤片烤片18h。 (3)切片厚切片厚24m。 (4)切片刀要快切片刀要快 (5)编上号编上号 (6)切片可在切片可在4保存数年保存数年n n 冰冻切片：冰冻切片：n n (1)冰冻切片分固定和新鲜组织，冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理固定组织需经庶糖处理n n 24h，冰冻
13、切片。，冰冻切片。n n (2)冰冻切片后需凉干后立即冰冻切片后需凉干后立即(lj)固定固定n n (3)冰冻切片固定后冰冻切片固定后-80保存备保存备用用第十一页，共32页。细胞细胞(xbo)爬片制作爬片制作n n将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。六孔板内。n n待细胞生长达到待细胞生长达到6060以上以上(y(yshng)shng)后取出玻后取出玻片。片。n n用用4%4%的多聚甲醛固定的多聚甲醛固定2h2h以上以上(y(yshng)shng)。n n可加甘油封存置于零下可加甘油封存置于零下2020度保存。度保存。第十二页，共32页。
14、细胞涂片细胞涂片(t pin)制作制作n n离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗23遍，最后(zuhu)用PBS将细胞重悬。n n吸取3050ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。n n待稍微风干以后加4多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定24小时。n n在细胞上加一层甘油放-20保存。第十三页，共32页。免疫免疫(miny)组织化学方法组织化学方法荧光标记荧光标记(bioj)免疫组织化学免疫组织化学酶联免疫酶联免疫(miny)组织化学组织化学第十四页，共32页。荧光荧光(ynggung)标记免疫组织化学标记免疫组织化学 直接(zhji)法 间接法第十五页，共32页。酶联免疫酶联免
15、疫(miny)组织化学组织化学 ABC法法 S - P法法第十六页，共32页。免疫组化二步法免疫组化二步法 第十七页，共32页。二步法免疫组化染色二步法免疫组化染色(rns)(rns)步步骤骤n n二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯n nPBSPBSPBSPBS冲洗冲洗冲洗冲洗3 3 3 3次，每次次，每次次，每次次，每次3 3 3 3分钟分钟分钟分钟n n根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复根据每一种抗体的
16、要求，对组织抗原进行相应的修复 n n0.3%0.3%0.3%0.3%过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断20202020分钟，以消除内源性过氧分钟，以消除内源性过氧分钟，以消除内源性过氧分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性化物酶的活性化物酶的活性化物酶的活性n nPBSPBSPBSPBS冲洗、浸泡冲洗、浸泡冲洗、浸泡冲洗、浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次n n正常山羊正常山羊正常山羊正常山羊(shnyng)(shnyng)(shnyng)(shnyng)血清室温封闭血清室温封闭血清室温封闭血清室温封闭10101010分钟分钟分
17、钟分钟第十八页，共32页。n n甩去血清，加入适当稀释的一抗，甩去血清，加入适当稀释的一抗，甩去血清，加入适当稀释的一抗，甩去血清，加入适当稀释的一抗，37373737孵育孵育孵育孵育60606060分钟或分钟或分钟或分钟或4444过夜过夜过夜过夜n nPBSPBSPBSPBS冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次n n滴加多聚螯合物，滴加多聚螯合物，滴加多聚螯合物，滴加多聚螯合物，37373737孵育孵育孵育孵育30303030分钟分钟分钟分钟n nPBSPBSPBSPBS冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡5 5 5 5分钟
18、，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次n n新鲜配置酶底物显色液新鲜配置酶底物显色液新鲜配置酶底物显色液新鲜配置酶底物显色液DABDABDABDAB显色显色显色显色3 3 3 310101010分钟分钟分钟分钟n n流水冲洗流水冲洗流水冲洗流水冲洗n n苏木苏木苏木苏木(s m)(s m)(s m)(s m)素复染，脱水，透明，封片。素复染，脱水，透明，封片。素复染，脱水，透明，封片。素复染，脱水，透明，封片。n n显微镜观察拍照显微镜观察拍照显微镜观察拍照显微镜观察拍照n nIPPIPPIPPIPP软件分析光密度软件分析光密度软件分析光密度软件分析光密度第十九页，共32页。抗原抗原(kn
19、gyun)修复方法修复方法n n真空负压抗原修复法：真空负压抗原修复法：切片切片(qi pin)脱蜡至水。脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇真空负压处理甲醇真空负压处理5分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M柠檬酸盐缓冲液柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压干燥箱预），真空负压干燥箱预先调至先调至95，真空负压处理，真空负压处理10分分钟。钟。待修复注降至室温的一，待修复注降至室温的一，PBS洗洗3次，随后按选好的免疫组化染色次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。方法进行染色。第二十页，共32页。n n微波微波(wib)辐射抗原修复法：辐射抗原修复法：切片脱蜡至水。切
20、片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理甲醇处理10分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M柠檬酸盐缓冲液柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波），于微波(wib)炉内炉内微波微波(wib)辐射辐射10分钟，如检测分钟，如检测Er和和Pr则需要则需要20辐射分钟左右。辐射分钟左右。待修复液降至室温后，待修复液降至室温后，PBS洗洗3次，随后按选好的免疫组织化学的次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。染色方法进行染色。第二十一页，共32页。n n高压抗原修复法：高压抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片10分钟。分钟。自来水洗，
21、蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入抗原修复液中，边同容切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续压力阀至喷汽后持续14分钟。分钟。待修复液恢复至室温后，待修复液恢复至室温后，PBS洗洗3次，随后按选好的免疫组织化次，随后按选好的免疫组织化学染色学染色(rns)方法进行染色方法进行染色(rns)。第二十二页，共32页。n n隔水热抗原修复法：隔水热抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理甲醇处理(chl)切切片片10分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲
22、液柠檬酸盐缓冲液（PH0.6）中，边同容器一起放入水）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（效温度后（92）。即开始计时，）。即开始计时，持续持续40分钟。分钟。待抗原修复液恢复至室温后，待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗洗3次，随后按选定好的免疫组化染次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。色方法进行染色。第二十三页，共32页。n n电炉加热抗原修复法：电炉加热抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片10分分钟。钟。自来水洗，蒸
23、馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。将切片放入抗原修复液中于电炉上将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达加热，不时用温度计测量温度，当达92后，即可拔离电源，当温度低于后，即可拔离电源，当温度低于92时，再插上电源，如此反复时，再插上电源，如此反复(fnf)持续至持续至10分钟左右。分钟左右。待抗原修复液降至室温后，待抗原修复液降至室温后，PBS洗洗3次，随后按选定的免疫组化染色方次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。法进行染色。第二十四页，共32页。n n胃蛋白酶消化法：胃蛋白酶消化法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片10分钟。分钟。自
24、来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。PBS洗洗3次，次，1分钟分钟/次。次。滴上配制好或商品化的胃蛋白滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片酶，处理切片20分钟左右分钟左右(zuyu)。PBS冲洗冲洗3次，次，2分钟分钟/次。次。后按选择好的免疫组化该法进后按选择好的免疫组化该法进行染色。行染色。第二十五页，共32页。n n胰蛋白酶消化法：胰蛋白酶消化法：切片切片(qi pin)脱蜡至水。脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片(qi pin)10分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。PBS洗洗3次，次，1分钟分钟/次。次。滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，滴上自配的或商
25、品化的胰蛋白酶，处理切片处理切片(qi pin)20分钟左右。分钟左右。PBS洗洗3次，次，2分钟分钟/次。次。后按选好的免疫组化染色方法进后按选好的免疫组化染色方法进行染色。行染色。第二十六页，共32页。注意事项一、抗体的保存一、抗体的保存 浓缩抗体：有效期内，只需放在浓缩抗体：有效期内，只需放在 4 冰箱内，保存时间可达冰箱内，保存时间可达1-3年。年。 即用型抗体：理论即用型抗体：理论(lln)上在上在4 冰箱内冰箱内 可保存半年左右。可保存半年左右。 PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一或抗体稀释液稀释的抗体：一般般 只可放置只可放置1-2个月。个月。第二十七页，共32页。二、出现假阳性的
26、原因二、出现假阳性的原因 组织切片质量不佳，造成假象，如组织切片质量不佳，造成假象，如 刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作 为判断阳性的依据为判断阳性的依据(yj)。 出血和坏死：红细胞的内源性过氧出血和坏死：红细胞的内源性过氧 化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化 物酶均可出现假阳性反应。物酶均可出现假阳性反应。 抗体的交叉反应。抗体的交叉反应。第二十八页，共32页。三、出现假阴性三、出现假阴性(ynxng)的原因的原因 固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。导致抗原丢失，无法补救。 固定液不合适或浓度不对，导致固定不固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用佳。最好使用10%中性福尔马林。中性福尔马林。 抗体浓度过低。抗体浓度过低。 孵育时间太短，或孵育温度太低。孵育时间太短，或孵育温度太低。 缓冲液缓冲液pH值不正确。值不正确。第二十九页，共32页。第三十页，共32页。四、必须严格设置四、必须严格设置(shzh)(shzh)阳性对照和阴性阳性对照和阴性对照。对照。五、五、DABDAB有致癌性，用后不应随处倒弃。有致癌性，用后不应随处倒弃。第三十一页，共32页。http:/第三十二页，共32页。
