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1、大肠杆菌感受态细胞的制备、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组重组DNA的转化、克隆筛选的转化、克隆筛选1. 实验目的和要求实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。生物学研究中的意义。2. 相关知识及原理相关知识及原理感受态细胞感受态细胞(Competent cells):受受体体细细胞胞经经过过一一些些特特殊殊方方法法（如如：CaCl，RuCl等等化化学
2、学试试剂剂法法）的的处处理理后后，细细胞胞膜膜的的通通透透性性发发生生变变化化，成成为为能能容容许许多多有有外外源源DNA的的 载载 体体 分分 子子 通通 过过 的的 感感 受受 态态 细细 胞胞(competent cell) 。 转化（转化（transformation）：是是将将异异源源DNA分分子子引引入入一一细细胞胞株株系系，使使受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传性性状状的的一一种种手手段段，是是基基因因工工程程等研究领域的基本实验技术。等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的
3、遗传性遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。甲基化酶的突变株。转化的方法：转化的方法：1.化学的方法化学的方法(热击法热击法)；使用化学试剂（如；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体理将载体DNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体感受态细胞，通过高压脉冲
4、的作用将载体DNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。克隆的筛选：克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌的培养基平板上，会出
5、现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。哪个克隆含有插入片段。重组质粒克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有 -互补、小规模制备质粒互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、进行酶切分析、插入失活、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最以及杂交筛选的方法
6、。最常用的方法是小规模制备质粒常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶进行酶切分析，对于带有切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以基因的载体还可以结合结合 -互补现象来筛选。互补现象来筛选。 -互补现象：互补现象：因为有些载体都带有一个因为有些载体都带有一个LacLacZ Z基因的调控序基因的调控序列和头列和头146146个氨基酸的编码信息，编码个氨基酸的编码信息，编码 - -互补互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 - -半乳糖半乳糖苷酶实现基因内互补（苷酶实现基因内互补（ -互补互补）。）。当这种载当这种载体转入可编码体转入可编码 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端部
7、分序列的端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基宿主细胞中时，在异丙基- - -D-D硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）的诱导下，）的诱导下，宿主可同时合成这两种宿主可同时合成这两种肽段，肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为以称这种现象为 - -互补现象。互补现象。由互补产生的由互补产生的 半乳糖苷酶半乳糖苷酶( (LacLacZ)Z)能够作用能够作用于生色底物于生色底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚 D D半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)(X-gal)而产生蓝色的
8、菌落，所以利而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNADNA片段时，会造成片段时，会造成LacLacZ(Z( ) )基因的失活，破基因的失活，破坏坏 -互补作用，互补作用，就不能产生具有活性的酶。就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。组质粒的菌落为蓝色。重组重组DNADNA转化细菌过转化细菌过程示意图程示意图3仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂无无菌菌超超净净台台，电电热热恒恒
9、温温水水浴浴，分分光光光光度度计计，离离心心机，移液器，微型离心管等；机，移液器，微型离心管等；菌株：菌株：E.coliE.coli DH5 DH5质质粒粒：pBluscript KS+DNA 片片段段的的重重组组质质粒粒以以及及pBluscript KS 空质粒；空质粒；LBLB培培养养基基；含含抗抗菌菌素素的的LBLB平平板板培培养养基基（氨氨苄苄青青霉霉素素，浓浓度度50-10050-100g gmLmL，X-gal X-gal 20-4820-48g/ml, g/ml, IPTG IPTG 100 100 g/mlg/ml。一一般般将将抗抗生生素素、X-galX-gal和和IPTGIP
10、TG配配制制成成10001000 储储备备液液，用用时时按按培培养养基基的的量量再再加加入入）；预冷预冷CaClCaCl2 2溶液（溶液（0.1mol0.1molL L） 4操作步骤操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法法) （1）从从新新活活化化的的E.coli DH5菌菌平平板板上上挑挑取取一一单单菌菌落落，接接种种于于35ml LB液液体体培培养养中中，37振振荡荡培培养养12h左左右右，直直至至对对数数生生长长期期。将将该该菌菌悬悬液液以以1:1001:50转转接接于于100ml LB液液体体培培养养基基中中，37振振荡荡扩扩大大培培养养，当当培
11、培养养液液开开始始 出出 现现 混混 浊浊 后后 ， 每每 隔隔 20 30min测测 一一 次次OD600nm，至，至OD600nm0.5时停止培养；时停止培养；（2）每每组组取取培培养养液液3个个2ml转转入入2ml离离心心管管中中，在在冰冰上上冷冷却却20-30min，于于4，4000rmin离离心心10min（从从这这一一步步开开始始，所所有有操操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；（ 3） 倒倒 净净 上上 清清 培培 养养 液液 ， 用用 1ml冰冰 冷冷 的的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；（4）04，40
12、00rmin离心离心10min；（ 5） 弃弃 去去 上上 清清 液液 ， 加加 入入 500l冰冰 冷冷 的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液，小小心心悬悬浮浮细细胞胞。04，4000rmin离心离心10min；（6）弃弃去去上上清清液液，加加入入100l冰冰冷冷的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液，小小心心悬悬浮浮细细胞胞，冰冰上上放放置置片片刻刻后，即制成了感受态细胞悬液；后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制制备备好好的的感感受受态态细细胞胞悬悬液液可可直直接接用用于于转转化化实实验验，也也可可加加入入占占总总体体积积15左左右右高高压压灭灭菌菌过过的的甘甘油油，混混匀匀后后分分装装
13、于于1.5ml离离心心管管中中，置置于于-70条件下，可保存半年至一年。条件下，可保存半年至一年。2）细胞转化）细胞转化 (1) 分别取分别取3个个100l感受态细胞悬液感受态细胞悬液(如是如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作操作)，第一组，加入，第一组，加入10 l重组质粒重组质粒DNA(体积不超过体积不超过10l)+ 100l感受态细胞，此管感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，插入为转化实验组。第二组，插入DNA片段对片段对照组，即酶切后照组，即酶切后DNA片段片段25ng+100l感受感受态细胞悬液；第三组，质粒态细胞悬液；第三组，质粒DNA
14、对照组，对照组，即即1ng 未酶切未酶切pBluescript 质粒质粒DNA十十100l感受态细胞悬液。感受态细胞悬液。 (2) 将将以以上上各各样样品品轻轻轻轻摇摇匀匀，冰冰上上放放置置20-30min，于于42水水浴浴中中保保温温12min，然然后后迅速冰上冷却迅速冰上冷却2min(3) 立立即即向向上上述述管管中中分分别别加加入入0.4ml LB液液体体培培养养基基（不不需需在在冰冰上上操操作作），使使总总体体积积到到0.5ml，该该溶溶液液称称为为转转化化反反应应原原液液，摇摇匀匀后后于于37振振荡荡培培养养约约45-60min ，使使受受体体菌菌恢恢复复正正常常生生长长状状态态，并
15、并使使转转化化体体表表达达抗抗生生素素基基因产物因产物(Ampr)。3) 平板培养（有时需要稀释）平板培养（有时需要稀释）(1)取取各各样样品品培培养养液液0.1ml，分分别别接接种种于于含含抗抗菌菌素素LB平平板板培培养养基基上上，涂涂匀匀（如如果果用用玻玻璃璃棒棒涂涂抹抹，酒酒精精灯灯烧烧过过后稍微凉一下再用，不要过烫）。后稍微凉一下再用，不要过烫）。(2) 菌液完全被培养基吸收后菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，倒置培养皿，于于37恒温培养箱内培养过夜恒温培养箱内培养过夜(12-16小时小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑
16、筛选的质粒和菌株来说，养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。用用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒超螺旋质粒 DNA产生产生5 106-2 107个转化菌个转化菌落。在实际工作中，每微克有落。在实际工作中，每微克有105以上的转化以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。菌落足以满足一般的克隆实验。4) 检出转化体和计算转化率检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中的菌落数，各实验组统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况应如表所示培养皿内菌落生长状况应如表所示:
17、组组组组含抗菌素的平板含抗菌素的平板含抗菌素的平板含抗菌素的平板结果说明结果说明结果说明结果说明 转化实验组转化实验组转化实验组转化实验组 白色菌落和少量白色菌落和少量白色菌落和少量白色菌落和少量蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落说明有重组质粒导入细说明有重组质粒导入细说明有重组质粒导入细说明有重组质粒导入细胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切进一步鉴定进一步鉴定进一步鉴定进一步鉴定插入插入插入插入DNADNA片片片片段对照组段对照组段对照组段对照组无菌落或极少量无菌落或极少量无菌落或极少量无菌落或极少量白色菌落白色菌落白色菌落白色菌落说明插入片段比较
18、纯或说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或有少量模板有少量模板有少量模板有少量模板DNADNA存在存在存在存在 质粒对照组质粒对照组质粒对照组质粒对照组 蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的效率效率效率效率各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析转转化化体体总总数数菌菌落落数数（转转化化反反应应原原液液总总体体积积/ /涂涂板菌液体积）板菌液体积）插入频率蓝色菌落数插入频率蓝色菌落数/ /白色菌落数白色菌落数转转化化频频（效效）率率转转化化体体总总数数/ /加加入入质质粒粒DNADNA的的量量（计算出每微克的转化菌落数）（计算出每微克的转化菌落数）
