二培养基及其制备

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1、第二章第二章 培养基及其制备培养基及其制备 重点：培养基的原料；培养基的营养成分；发酵培养基的选择；淀粉水解糖的制备； 难点：淀粉水解理论基础；生物合成的前体物质1第一节第一节 培养基的原材料培养基的原材料一、培养基的营养成分及用途一、培养基的营养成分及用途l 微生物的养料来源微生物的养料来源 光光 光能自养光能自养 氢、硫、氨氢、硫、氨 自养菌自养菌.能源能源 亚硝酸盐、亚铁盐亚硝酸盐、亚铁盐 化能自养化能自养 碳水化合物等有机物碳水化合物等有机物 石油天然气和石油化工产品石油天然气和石油化工产品 异养菌异养菌 功能：生长、繁殖需要；功能：生长、繁殖需要； 2 碳酸气碳酸气 淀粉水解糖、糖蜜

2、、亚硫酸盐纸浆废液等淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等 石油、正构石蜡、天然气石油、正构石蜡、天然气 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品 功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础；功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础； 豆饼或蚕蛹水解液、味精废液豆饼或蚕蛹水解液、味精废液.氮源氮源 玉米浆、酒糟水等有机氮玉米浆、酒糟水等有机氮 尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等无机氮、气态氮尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等无机氮、气态氮 功能：构成菌体、含氮代谢物；功能：构成菌体、含氮代谢物；. .碳碳碳碳源源源源3 磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐.无机盐无

3、机盐 铁、锰、钴等微量元素铁、锰、钴等微量元素 功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调节透压，调节pHpH值，维持氧化还原电位；值，维持氧化还原电位；.特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等醇等 功能：酶的辅助部分，维持生命活动；功能：酶的辅助部分，维持生命活动；.水分水分 功能：生化反应均在水溶液中进行功能：生化反应均在水溶液中进行4二、培养基的类型二、培养基的类型 1. 1.依营养物质的来源分类依营养物质的来源分类 天然培养基；天然培养基；（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末

4、等）（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等） 合成培养基；合成培养基； （高氏培养基、察氏培养基等（高氏培养基、察氏培养基等 ） 半合成培养基；半合成培养基； （牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖培养基）（牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖培养基） 2. 2.依培养基制成的形式分：依培养基制成的形式分： 液体培养基；液体培养基； 固体培养基；固体培养基； 3. 3.依培养基主要成分和使用目的来分依培养基主要成分和使用目的来分 基础培养基基础培养基 完全培养基完全培养基5 鉴别培养基（鉴别培养基（pHpH指示剂：不同微生物颜色）指示剂：不同微生物颜色） 选择培养基（如加抗生素）选择培养基（如加抗生素） 4. 4.根据生产工

5、艺来分根据生产工艺来分 孢子培养基孢子培养基 种子培养基种子培养基 发酵培养基发酵培养基 附：培养基配方举例附：培养基配方举例6肉汤培养基l1 1、成份：牛肉膏、成份：牛肉膏 5 5克克l 蛋白胨蛋白胨 10 10克克l 氯化钠氯化钠 5 5克克l2 2、制法：、制法：l（1 1）于）于10001000毫升水中，加入上述成分，混合加热溶解。毫升水中，加入上述成分，混合加热溶解。l（2 2）用）用1mol1mol氢氧化钠矫正氢氧化钠矫正pH7.2pH7.27.67.6，煮沸，煮沸3 3分分钟。用滤纸滤过，补足失掉的水分。钟。用滤纸滤过，补足失掉的水分。l（3 3）分装于烧瓶或试管中，瓶口或管口塞

6、好棉塞包装）分装于烧瓶或试管中，瓶口或管口塞好棉塞包装后，高压蒸气灭菌，后，高压蒸气灭菌，121121灭菌灭菌2020分钟。分钟。l（4 4）灭菌后放于阴凉处，或放冷后存于冰箱中备用。）灭菌后放于阴凉处，或放冷后存于冰箱中备用。7土豆葡萄糖琼脂培养基土豆葡萄糖琼脂培养基l土豆土豆 500g 500g 葡萄糖葡萄糖 20.0g 20.0g 琼脂琼脂 20.0g 20.0g l称取称取500500克土豆，去皮切成丁，立即加入克土豆，去皮切成丁，立即加入1000ml1000ml水，充分煮沸，用棉布过滤。滤水，充分煮沸，用棉布过滤。滤液用水定容至液用水定容至1000ml1000ml，再加入其它成分。，

7、再加入其它成分。高压灭菌：高压灭菌：115115，2020分钟。分钟。 8三、发酵培养基的选择三、发酵培养基的选择 发酵培养基的用途与要求、成分、发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；成本及工艺管理；工业上确定发酵培养基的方法：工业上确定发酵培养基的方法： 1 1、了解菌种的营养要求；、了解菌种的营养要求； 2 2、了解菌种的培养条件；、了解菌种的培养条件； 3 3、先进行小试验，摸索菌种对碳源和氮源的、先进行小试验，摸索菌种对碳源和氮源的 利用情况。利用情况。9四、原料转换及意义四、原料转换及意义 发酵培养基中所

8、用原材料，大部分属于粮食、发酵培养基中所用原材料，大部分属于粮食、油脂、蛋白质和农用肥料，其中山芋粉、玉米粉、油脂、蛋白质和农用肥料，其中山芋粉、玉米粉、淀粉、糊精、麦芽糖等都是可供人畜食用的粮食、淀粉、糊精、麦芽糖等都是可供人畜食用的粮食、油料或以粮食为原料的产品；我国人口众多，发油料或以粮食为原料的产品；我国人口众多，发酵产品的品种和产量与日俱增，每年都要消耗大酵产品的品种和产量与日俱增，每年都要消耗大量粮食、油料和蛋白质原料。量粮食、油料和蛋白质原料。 原则：以废代好（废糖蜜、农业废料等）原则：以废代好（废糖蜜、农业废料等） 以可再生代替不可再生（野生植物淀以可再生代替不可再生（野生植物

9、淀粉、纤维水解物）粉、纤维水解物） 节约原料：使发酵稳定、高产节约原料：使发酵稳定、高产10第二节第二节 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备l多数微生物不能直接利用淀粉多数微生物不能直接利用淀粉l淀粉水解糖已应用于谷氨酸发酵等淀粉水解糖已应用于谷氨酸发酵等工业工业l淀粉水解后的糖液主要是葡萄糖，淀粉水解后的糖液主要是葡萄糖，少量二糖、低聚糖等少量二糖、低聚糖等l提高出糖率、糖的质量提高出糖率、糖的质量11l一、淀粉水解糖的制备方法一、淀粉水解糖的制备方法1.1.酸解法：以酸为催化剂，高温高压转化酸解法：以酸为催化剂，高温高压转化 优点：简单、设备少、时间短优点：简单、设备少、时间短 缺点：设备易

10、腐蚀、要耐高温高压，有缺点：设备易腐蚀、要耐高温高压，有副反应；淀粉粒小、浓度不能太高。副反应；淀粉粒小、浓度不能太高。水解条件：第水解条件：第1919页页2.2.酶解法：淀粉酶，包括液化（酶解法：淀粉酶，包括液化（-淀粉酶）淀粉酶）和糖化（糖化酶）两步和糖化（糖化酶）两步 水解条件：第水解条件：第2020页页12双酶水解法制葡萄糖的优点双酶水解法制葡萄糖的优点 ：（1 1）淀粉水解是在酶的作用下进行的，酶解的反应条件）淀粉水解是在酶的作用下进行的，酶解的反应条件比较温和。比较温和。（2 2）酶作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水）酶作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水解糖液纯度高

11、，淀粉的转化率高。解糖液纯度高，淀粉的转化率高。（3 3）可在较高淀粉浓度下水解（）可在较高淀粉浓度下水解（40%40%比酸水解高一倍）。比酸水解高一倍）。（4 4）由于微生物酶制剂中菌体细胞的自溶，糖液的营养）由于微生物酶制剂中菌体细胞的自溶，糖液的营养物质较丰富，发酵培养基的组成可简化。物质较丰富，发酵培养基的组成可简化。（5 5）用酶法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量）用酶法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高，有利于糖液的精制。高，有利于糖液的精制。 双酶水解法制葡萄糖的缺点：双酶水解法制葡萄糖的缺点： 时时间间长长（2 23 3天天）、设设备备多多、条条件件（适适合合酶酶水

12、水解解）较较多多、过滤困难过滤困难133.3.酸酶结合法酸酶结合法 酸酸酶酶法法：先先将将淀淀粉粉酸酸水水解解为为糊糊精精或或低低聚聚糖，再用糖化酶水解为葡萄糖。糖，再用糖化酶水解为葡萄糖。 应用：玉米、小麦等谷类淀粉，坚实。应用：玉米、小麦等谷类淀粉，坚实。 酶酶酸酸法法：先先用用-淀淀粉粉酶酶液液化化，再再用用酸酸水水解为葡萄糖。解为葡萄糖。 应用：碎米淀粉等，酸水解不均匀。应用：碎米淀粉等，酸水解不均匀。14不同糖化工艺所得糖化液不同糖化工艺所得糖化液质量比较质量比较醛15二、淀粉酸水解理论基础 淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生：水解反应、复合反应、分解反应；其中水解反应是主要的。

13、在淀粉糖化过程中，这三种化学反应的关系如下：淀粉葡萄糖复合二糖 5-羟甲基糠醛复合低聚糖有机酸、有色物质等复合复合盐酸 分解分解水解水解16 1 1、淀粉的水解反应及其影响因素、淀粉的水解反应及其影响因素 淀粉：直链（淀粉：直链（a-1a-1，4 4键缩合）、支链（键缩合）、支链（a-1a-1，6 6键缩合），聚合度高键缩合），聚合度高-淀粉酶淀粉酶 ：又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉：又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉-1-1，4 4葡萄糖苷健，其作用特点是可以快速将葡萄糖苷健，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精；长链的淀粉水解成短链糊精；淀粉淀粉-1-1，4 4；1 1，6 6葡萄糖

14、苷酶，又称为糖化酶，葡萄糖苷酶，又称为糖化酶，可以水解淀粉分子的可以水解淀粉分子的-1-1，4 4；或；或-1-1，6 6葡萄糖葡萄糖苷健，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速苷健，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。度越快，水解产物为葡萄糖。 酸的种类：盐酸酸的种类：盐酸 硫酸硫酸 磷酸磷酸 酸水解主要因素酸水解主要因素 酸浓度：高利于水解，但应适当酸浓度：高利于水解，但应适当 水解温度：温度加速水解水解温度：温度加速水解172 2、葡萄糖的复合反应及其影响因素、葡萄糖的复合反应及其影响因素 复合反应：葡萄糖分子间经复合反应：葡萄糖分子间经1-61-6糖苷键结合成龙

15、胆糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖）。聚糖）。 在淀粉的酸水解过程中，水解生成的葡萄糖受酸和在淀粉的酸水解过程中，水解生成的葡萄糖受酸和热的影响，葡萄糖分子之间通过糖苷键相聚合，生成二热的影响，葡萄糖分子之间通过糖苷键相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。糖、三糖及其他低聚糖。l影响复合反应的因素：影响复合反应的因素： 1 1）淀粉浓度的影响：淀粉乳浓度高，水解所得葡萄糖浓）淀粉浓度的影响：淀粉乳浓度高，水解所得葡萄糖浓度也高，复合反应也强。度也高，复合反应也强。 2 2）酸的影响：酸浓度高，复合反应强；盐酸）酸

16、的影响：酸浓度高，复合反应强；盐酸 硫酸硫酸 草酸草酸183、葡萄糖的分解反应及其影响因素 分解反应：葡萄糖分解反应：葡萄糖5-5-羟甲基糠醛羟甲基糠醛有机酸有机酸（乙酰丙酸、蚁酸）、色素等。（乙酰丙酸、蚁酸）、色素等。 影响因素： （1）浓度：表2-9、葡萄糖浓度高， 5-5-羟甲羟甲基糠醛生成量大；基糠醛生成量大； （2 2）pH值：表2-11、pH为3时5-5-羟甲基糠醛羟甲基糠醛生成量最小；生成量最小； （3）反应时间：表2-10、时间延长，5-5-羟甲羟甲基糠醛生成量增大；基糠醛生成量增大；19第三节 糖蜜前处理一、糖蜜的来源与特点甘蔗厂、甜菜厂的副产物；非结晶糖，可发酵，无需糖化；

17、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的成分：表2-12 总糖含量50%左右 胶体物质约10% 灰分约10%20lBx(玻利克斯，锤度)：表示溶液的比重的方法l定义：某一溶液的Bx，表示该溶液的比重和相同浓度（为Bx%）的蔗糖溶液的比重相等。21二、糖蜜前处理的方法l处理目的： la.除去胶体性物质，降低糖蜜的粘度，提高发酵液的流动性， 有利于改善发酵过程中氧的传递。lb.脱色，除去有色物质，色素对产品的质量有影响，对微生物的生长和代谢有影响。lc.中和过量的酸碱性物质，除去部分对pH值有影响的缓冲性物质。22处理方法：1.加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法）程序：稀释加酸通气静置取上清制备糖液 2.加热加酸沉淀法（

18、热酸通风沉淀法）程序：稀释加酸加热、通气静置取上清制备糖液 糖蜜经酸化后主要是除去糖蜜中胶体性物质，通风的目的是除去一些挥发性物质。 233.添加絮凝剂澄清处理法（聚丙烯酰胺）程序：稀释加酸加热、加絮凝剂静置取上清制备糖液l聚丙烯酰胺（ PAM）作为絮凝剂，可以促进大分子物质的沉降，有利于糖蜜的澄清。 l工艺过程：l 原溶液（稀释）-40Bx -调pH值(33.8)-絮凝、加热到90- 静置l絮凝剂的用量：8mg/L，静置时间：1小时24三、谷氨酸发酵糖蜜前处理 糖蜜中生物素含量高，不适合谷氨酸发酵糖蜜中生物素含量高，不适合谷氨酸发酵1.1.糖蜜预处理法糖蜜预处理法 活性炭处理法活性炭处理法

19、树脂处理法树脂处理法 亚硝酸处理法亚硝酸处理法 2.2.添加化学药剂处理法添加化学药剂处理法 添加青霉素法：破坏细胞壁结构添加青霉素法：破坏细胞壁结构 添加表面活性剂：改变细胞膜的通透性添加表面活性剂：改变细胞膜的通透性 添加抗氧剂法添加抗氧剂法 25l3.3.追加糖蜜法追加糖蜜法l生物素只对谷氨酸产生菌初期有作生物素只对谷氨酸产生菌初期有作用，待菌酶系生长完全后，生物素用，待菌酶系生长完全后，生物素无作用，因此，可先用无生物素的无作用，因此，可先用无生物素的糖蜜发酵，在用不经处理的糖蜜。糖蜜发酵，在用不经处理的糖蜜。l4.4.营养缺陷型突变株法：营养缺陷型突变株法：l将生物素缺陷型转变为其他

20、类型的将生物素缺陷型转变为其他类型的缺陷型，如油酸缺陷型、组氨酸缺缺陷型，如油酸缺陷型、组氨酸缺陷型等，生物素对它没影响。陷型等，生物素对它没影响。26第四节第四节 纤维素代粮发酵纤维素代粮发酵一、石油代粮发酵一、石油代粮发酵2020世纪中期研究较热世纪中期研究较热石油消耗加速，价格上升石油消耗加速，价格上升微生物可利用石油的各种馏分微生物可利用石油的各种馏分二、纤维素代粮发酵二、纤维素代粮发酵1 1、纤维素的结构、纤维素的结构D-吡喃葡萄糖环；吡喃葡萄糖环；-1，4糖苷键；直链多糖糖苷键；直链多糖两相共存学说：结晶区（分子链有序、紧密）、两相共存学说：结晶区（分子链有序、紧密）、无定形区（分

21、子链疏松）无定形区（分子链疏松）酶催化降解：成本高，但发展前景好酶催化降解：成本高，但发展前景好27第五节第五节 前体物质、促进剂前体物质、促进剂一、生物合成的前体物质一、生物合成的前体物质 前前体体指指某某些些化化合合物物加加入入到到发发酵酵培培养养基基中中，能能直直接接被被微微生生物物在在生生物物合合成成过过程程中中合合成成到到产产物物分分子子中中去去，而而其其自自身身的的结结构构并并没没有有多多大大变变化化，但但是是产产物的产量却因加入前体而有较大的提高。物的产量却因加入前体而有较大的提高。 特特别别是是对对于于某某些些氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸和和抗抗生生素素的的发发酵酵生生产产，添添

22、加加一一定定量量的的前前驱驱物物质质（前前体体）其其作作用是非常明显的。用是非常明显的。 前体物质还可避免氨基酸合成途径中的反馈前体物质还可避免氨基酸合成途径中的反馈抑制。抑制。28青霉素：分子量青霉素：分子量356 356 苯乙酸苯乙酸: :分子量分子量136136作用：前体有助于提高产量作用：前体有助于提高产量用量：前体的用量可以按分子量衡算，具用量：前体的用量可以按分子量衡算，具 体使用有个转化率的问题体使用有个转化率的问题29l例：发酵生产6000单位/ml的青霉素G,需要添加多少苯乙酸？l青霉素6000*0.6（微克）36mg/mll苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml

23、=1.38%l实际使用时的转化率在46-90%之间l用法：用法：l1）前体使用时普遍采用流加的方法）前体使用时普遍采用流加的方法l2）前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利）前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利l苯乙酸，一般基础料中仅仅添加苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%l3）前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧）前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率化，流加也有利于提高前提的转化率30氨基酸发酵的前体物质氨基酸氨基酸菌种菌种前体物质前体物质产率（产率（% %）丝氨酸色氨酸色氨酸蛋氨酸异亮氨酸异亮氨酸苏氨酸嗜甘油棒状杆菌异常汉孙酵母

24、麦角菌脱氮极毛杆菌粘质赛氏杆菌阿氏棒状杆菌谷氨酸小球菌甘氨酸氨茴酸吲哚硫代丁酸-氨基丁酸D-苏氨酸高丝氨酸1.61.60.80.81.31.31.11.10.80.81.51.52.02.031二、发酵过程的促进剂和抑制剂二、发酵过程的促进剂和抑制剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。添加剂。 所谓抑制剂是指那些非细胞生长所必须的营所谓抑制剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能抑制某种抗生素养物，又非前体，但加入后却能抑制某种抗生素的合成。的

25、合成。32l促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的：是多方面的：l 1、有些促进剂本身是酶的诱导物；、有些促进剂本身是酶的诱导物；l 2、有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的、有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；活有保护作用；l 3、有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重、有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。金属离子。33抗生素的抑制剂抗生素被抑制的产物抑制剂链霉

26、素去甲基链霉素四环素去甲基金霉素头孢菌素C利福霉素甘露糖链霉素链霉素金霉素金霉素头孢霉素N其他利福霉素甘露聚糖乙硫氨酸溴化物、硫脲硫胺化合物L-蛋氨酸巴比妥药物34第六节第六节 培养基灭菌培养基灭菌l重点：消毒与灭菌的区别；灭菌方法；重点：消毒与灭菌的区别；灭菌方法；加热灭菌的原理；影响培养基灭菌的其加热灭菌的原理；影响培养基灭菌的其他因素；培养基灭菌时间计算；分批灭他因素；培养基灭菌时间计算；分批灭菌和连续灭菌比较；菌和连续灭菌比较； l难点：培养基灭菌时间计算；难点：培养基灭菌时间计算；35l一、消毒与灭菌的区别：一、消毒与灭菌的区别：l所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微所谓灭菌就是杀死一

27、切微生物，包括微生物的营养体和芽孢。生物的营养体和芽孢。l消毒是指消灭一切致病微生物（病原体）消毒是指消灭一切致病微生物（病原体）。 l二、消毒与灭菌在发酵工业中的应用二、消毒与灭菌在发酵工业中的应用l牛奶巴氏消毒法：牛奶巴氏消毒法：80-9580-95，10min10minl发酵培养基的灭菌发酵培养基的灭菌:121,20min:121,20min36l三、灭菌方法：三、灭菌方法：l1 1、干热灭菌：灼烧灭菌；加热方式有电、干热灭菌：灼烧灭菌；加热方式有电热、红外线加热等；相对与湿热灭菌，热、红外线加热等；相对与湿热灭菌，干热要求时间长，温度高（一般干热要求时间长，温度高（一般160160，2

28、hr2hr） l1）火焰焚烧法：接种环、试管口等）火焰焚烧法：接种环、试管口等l2）干烤法：利用热空气灭菌）干烤法：利用热空气灭菌l 用法：用法：160,2小时小时 l 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死。所以温度高、时脱水状态下不易杀死。所以温度高、时间长。间长。37l2 2、湿热灭菌：蒸气释放热量，使微生物蛋白、湿热灭菌：蒸气释放热量，使微生物蛋白质变性。质变性。l特点：温度低、时间短、灭菌效果好特点：温度低、时间短、灭菌效果好l原因：原因：l 1) 菌体内含水量越高，则凝固温度越低；菌体内含水量越高，则凝固温度越低；l 2) 蒸汽冷凝会

29、放出潜热；蒸汽冷凝会放出潜热；l 3) 饱和水蒸汽穿透力强；饱和水蒸汽穿透力强；l 4) 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。性，主要破坏氢键结构。38湿热灭菌优点：湿热灭菌优点：1 1）蒸气来源易，低价无毒；）蒸气来源易，低价无毒；2 2）蒸气穿透力强灭菌彻底；）蒸气穿透力强灭菌彻底；3 3）蒸气冷凝释放热量；）蒸气冷凝释放热量；4 4）蒸气易输送，易调节，）蒸气易输送，易调节，易管理。易管理。湿热灭菌缺点：湿热灭菌缺点： 1 1）设备费用高；）设备费用高；2 2）不能用于怕受潮的物料；）不能用于怕受潮的物料；39l3 3、射线灭菌法：

30、、射线灭菌法：l 1）电离辐射：）电离辐射：、射线射线 。 原理原理 ：引起水和其他物质的电离，产生：引起水和其他物质的电离，产生游离基，破坏游离基，破坏DNA，从而造成细胞损伤。，从而造成细胞损伤。 l 特点；穿透力强，无专一性，对所有生特点；穿透力强，无专一性，对所有生物均有杀伤作用。物均有杀伤作用。l 适用：菌种诱变。适用：菌种诱变。40l2）非电离辐射（紫外线）非电离辐射（紫外线）l方法：在波长方法：在波长265-266nm处，杀菌力最强。处，杀菌力最强。l原理：原理：l（1）作用于）作用于DNA ，使同链，使同链DNA相邻嘧啶间形相邻嘧啶间形成嘧啶二聚体，引起成嘧啶二聚体，引起DNA

31、结构变形，阻碍正常结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成菌的变异或死亡。（光的碱基配对，从而造成菌的变异或死亡。（光复活酶可修复）复活酶可修复）l（2）有氧时产生过氧化氢，强氧化杀菌。）有氧时产生过氧化氢，强氧化杀菌。l适用：空气、水的消毒杀菌（紫外灯）。适用：空气、水的消毒杀菌（紫外灯）。l特点：穿透力差。特点：穿透力差。414 4、化学药品灭菌、化学药品灭菌l方法：浸泡、熏蒸、喷洒、擦拭等，常用化学药品：方法：浸泡、熏蒸、喷洒、擦拭等，常用化学药品：l1 1）表面消毒剂：）表面消毒剂：l（1）酚类）酚类：l 石炭酸（苯酚），石炭酸（苯酚），0.1%抑菌；抑菌；1%杀菌杀菌l 甲酚皂（甲酚甲

32、酚皂（甲酚+肥皂）：肥皂）：3-5%皮肤消毒皮肤消毒l 机理：作为表面活性剂，使膜损伤；蛋白质变性机理：作为表面活性剂，使膜损伤；蛋白质变性l P.C.（石炭酸系数）：为消毒剂杀菌效率的标准。（石炭酸系数）：为消毒剂杀菌效率的标准。l是在一定时间内（是在一定时间内（10min）被测试的药剂能杀死全部）被测试的药剂能杀死全部供试微生物的最高稀释度与达到同样效果的酚最高稀供试微生物的最高稀释度与达到同样效果的酚最高稀释度的比值。释度的比值。42l（2）醇类：）醇类：l乙醇：乙醇：70-75%杀菌效率最高杀菌效率最高l机理：具脱水作用，能穿透菌体进入蛋机理：具脱水作用，能穿透菌体进入蛋白质分子肽链间

33、隙，使蛋白质变性或脱白质分子肽链间隙，使蛋白质变性或脱水沉淀，造成微生物死亡。水沉淀，造成微生物死亡。l无水乙醇：表面蛋白凝固，保护膜，杀无水乙醇：表面蛋白凝固，保护膜，杀菌力差菌力差l甲醇可使眼睛失明，故不宜做消毒剂；甲醇可使眼睛失明，故不宜做消毒剂；其他醇因不溶于水，一般不用。其他醇因不溶于水，一般不用。43l（3 3）醛类：）醛类：l甲醛：甲醛： 机理：蛋白质烷化剂；机理：蛋白质烷化剂； 应用：福尔马林（应用：福尔马林（40%40%）；）； 10% 10%的甲醛熏蒸，用于空气灭菌。的甲醛熏蒸，用于空气灭菌。l（4 4）表面活性剂：）表面活性剂：l 可降低表面张力效应的物质。可降低表面张力

34、效应的物质。l机理：使菌体细胞膜破损；使菌体蛋白质变性。机理：使菌体细胞膜破损；使菌体蛋白质变性。l种类：洗必泰、新洁尔灭等种类：洗必泰、新洁尔灭等l特点：快速、彻底、效率高特点：快速、彻底、效率高44l（5 5）氧化剂类：）氧化剂类：l机理：破坏蛋白质的巯基，强氧化剂可破坏蛋机理：破坏蛋白质的巯基，强氧化剂可破坏蛋白质的氨基与酚羟基白质的氨基与酚羟基l碘酒碘酒 7g I 7g I：5g KI5g KI，溶于，溶于100ml 95%100ml 95%乙醇。乙醇。l 1% 1%碘酒碘酒10min10min可杀死芽孢杆菌和部分真菌，可杀死芽孢杆菌和部分真菌，l 并使流感病毒灭活。并使流感病毒灭活。

35、l漂白粉（氯化钙与次氯酸钙的混合物）漂白粉（氯化钙与次氯酸钙的混合物）45l（6 6）重金属及其化合物：）重金属及其化合物：l所有重金属盐所有重金属盐CuCu、AsAs、AgAg、HgHg等对微生等对微生物均有毒性。物均有毒性。l机理：机理：l1 1）可与酶蛋白的）可与酶蛋白的-SH-SH基结合，使酶失活；基结合，使酶失活；l2 2）易与带阴电荷的菌体蛋白吸附，使之）易与带阴电荷的菌体蛋白吸附，使之变性沉淀。变性沉淀。l应用：波尔多液、红汞、硝酸银等。应用：波尔多液、红汞、硝酸银等。l特点：简便。但使用应谨慎，防止在体特点：简便。但使用应谨慎，防止在体内积累。内积累。46l（7 7） pH p

36、H的杀菌作用的杀菌作用l酸酸: : 蛋白质变性蛋白质变性 l无机酸无机酸: :杀菌力与杀菌力与H+H+浓度成正比。浓度成正比。l有机酸有机酸: :与不电离的部分成正比与不电离的部分成正比, ,故有时有机酸故有时有机酸的灭菌效果的灭菌效果 无机酸，分子杀菌力大于离子。无机酸，分子杀菌力大于离子。l碱碱: : 强碱造成蛋白质、核酸大分子变强碱造成蛋白质、核酸大分子变 性、水解，使菌死亡。性、水解，使菌死亡。472）抗代谢药物l机理：与正常代谢产物同时存在，并产生竞争机理：与正常代谢产物同时存在，并产生竞争性拮抗作用（与相应酶竞争性结合）。只有当性拮抗作用（与相应酶竞争性结合）。只有当正常代谢产物的

37、量少或不存在时，抗代谢物才正常代谢产物的量少或不存在时，抗代谢物才有用。有用。l种类：磺胺种类：磺胺抑制叶酸合成抑制叶酸合成l 6 - 巯基嘌呤巯基嘌呤抑制嘌呤合成抑制嘌呤合成l 5 - 甲基色氨酸甲基色氨酸抑制氨基酸合成抑制氨基酸合成l机理：磺胺机理：磺胺对氨基苯甲酸的类似物，竞争对氨基苯甲酸的类似物，竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，抑制叶酸合成性地与二氢叶酸合成酶结合，抑制叶酸合成483）抗生素 （1）抗生素：生物产生的一种次生代谢产物或）抗生素：生物产生的一种次生代谢产物或其衍生物，在低浓度下抑制或影响其他生物的其衍生物，在低浓度下抑制或影响其他生物的生命活动。生命活动。l （2）抗菌谱：

38、抗生素的作用对象有一定范围，）抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，将这一范围称该抗生素的抗菌谱。将这一范围称该抗生素的抗菌谱。l 广谱：对多种微生物有作用（四环素广谱：对多种微生物有作用（四环素G+，G-）l 窄谱：仅对某一类微生物有作用（青霉素窄谱：仅对某一类微生物有作用（青霉素G+）l （3）效价：抑菌圈大小，生物活性单位，标）效价：抑菌圈大小，生物活性单位，标准曲线准曲线49l抗生素作用机理：抗生素作用机理：l 1）对细胞壁形成有抑制作用；（如：青）对细胞壁形成有抑制作用；（如：青霉素）霉素）l 2）影响细胞膜功能；（如：多粘菌素）影响细胞膜功能；（如：多粘菌素）l 3）抑制蛋白质合成；

39、（如：绿霉素、链）抑制蛋白质合成；（如：绿霉素、链霉素）霉素）l 4）干扰核酸代谢；（如：利福霉素、灰）干扰核酸代谢；（如：利福霉素、灰黄霉素）黄霉素）l抗药性：变异、适应、进化抗药性：变异、适应、进化l原因：药物无效；药物被修饰；原因：药物无效；药物被修饰；l R质粒（药物抗性基因）质粒（药物抗性基因）50四、加热灭菌的原理四、加热灭菌的原理l1.1.微生物的热阻：微生物对热的抵抗力；微生物的热阻：微生物对热的抵抗力；定义：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。其定义：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同对热的抵抗能力越大，可以理解为热

40、阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。概念。l 相对热阻：两种微生物的热阻之比。相对热阻：两种微生物的热阻之比。 l例如：芽孢例如：芽孢/ /大肠杆菌大肠杆菌=3000000/1=3000000/1；l 病毒病毒/ /大肠杆菌大肠杆菌=15/1=15/1l致死温度：杀死微生物的极限温度；致死温度：杀死微生物的极限温度；l致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物的时间；致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物的时间；l 温度越高，致死时间越短。温度越高，致死时间越短。512.2.微生物的热致死动力学：对数残留方程。微生物

41、的热致死动力学：对数残留方程。 菌体是一个复杂的高分子体系，其受热被杀菌体是一个复杂的高分子体系，其受热被杀死，主要的原因是高温能使蛋白质变性，这种反死，主要的原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属于单分子反应（一级反应），因此，杂菌在应属于单分子反应（一级反应），因此，杂菌在一定温度下受热死亡的过程可用单分子反应历程一定温度下受热死亡的过程可用单分子反应历程加以描述。加以描述。 -dN/dt = k * N-dN/dt = k * N式中式中dN/dtdN/dt：表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率 N N：表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数：表示表示灭菌过程中某

42、瞬间的活菌数 K K：表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数：表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数52l上式的积分形式为：上式的积分形式为： l t = （2.303/k） lnN0/Nt l式中式中N0，Nt： 分别表示灭菌前、灭菌后培分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个养基中菌体的浓度（个/ml）l灭菌时间灭菌时间 t 取决于污染程度取决于污染程度N0、灭菌程度、灭菌程度 Nt 与与灭菌速度常数灭菌速度常数Kl灭菌程度：对于灭菌程度：对于 Nt ，如果取，如果取Nt = 0，那么，那么，t = ，这显然是与现实情况不符。，这显然是与现实情况不符。l 对于如何对于如何Nt取值？通常取取值？通常

43、取Nt= 10-3，即灭菌，即灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产过程中的技术管理水平。过程中的技术管理水平。53l3.3.热致死反应的速度常数热致死反应的速度常数K Kl K K是表达微生物耐热性的特征常数，是表达微生物耐热性的特征常数，K K除了决定于菌体的种类及存在形式外，除了决定于菌体的种类及存在形式外，还是温度的函数（与普通化学反应一样）还是温度的函数（与普通化学反应一样），因此灭菌温度的选择是灭菌操作的核，因此灭菌温度的选择是灭菌操作的核心。心。lK

44、K越小，该微生物越耐热，越小，该微生物越耐热，121121细菌芽细菌芽孢孢K K为为1min1min-1-1, ,而营养细胞为而营养细胞为10-1010-101010minmin-1-1l4 4、杀灭芽孢的温度和时间、杀灭芽孢的温度和时间l见表见表4-244-24（4242页）页）, ,不同芽孢耐热性不同不同芽孢耐热性不同, ,培养条件不同培养条件不同, ,耐热性也不同。耐热性也不同。54l5.5.灭菌温度的选择灭菌温度的选择l温度对化学反应的影响特别显著，主要温度对化学反应的影响特别显著，主要是影响速度常数。是影响速度常数。l灭菌温度的选择应考虑的因素主要有：灭菌温度的选择应考虑的因素主要有

45、：l1 1）微生物的热致死温度，应高于该温度，）微生物的热致死温度，应高于该温度，通常以芽孢为准。通常以芽孢为准。l2 2）高温对营养成分的破坏，灭菌的过程）高温对营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程，因此，实质上也是营养成分破环的过程，因此，灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。分的破坏。 55l速度常数与温度之间的关系（阿累尼乌斯公式）速度常数与温度之间的关系（阿累尼乌斯公式）： K= Ae-E/RT l式中式中K：速度常数，：速度常数，1/Sl E,：活化能（：活

46、化能（J/mol）l R：气体常数，：气体常数，1.987*4.18 J/mol*kl T：反应的绝对温度，：反应的绝对温度，kl上式也可表示为：上式也可表示为：llgK=-E/2.303RT+lgAl 对于某种特定的细菌，活化能对于某种特定的细菌，活化能E E也是一定也是一定的，因此，灭菌速度常数的对数的，因此，灭菌速度常数的对数lgKlgK与灭菌温与灭菌温度度T T成反比。成反比。l表表2-262-26为部分细菌芽孢的活化能为部分细菌芽孢的活化能56五、影响培养基灭菌的其他因素五、影响培养基灭菌的其他因素l培养基成分：保护作用；培养基成分：保护作用；lpHpH值：值： pH pH值值6-8

47、6-8，微生物最耐热，表，微生物最耐热，表2-282-28；l培养基中的颗粒：颗粒大，灭菌难；培养基中的颗粒：颗粒大，灭菌难；l泡沫：不利于灭菌。泡沫：不利于灭菌。57六、培养基灭菌时间的计算六、培养基灭菌时间的计算l分批灭菌：分批灭菌操作要点分批灭菌：分批灭菌操作要点l(1)(1)定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。冷却管道，夹套。l(2)(2)培养基升温时，打开所有的排气阀门，培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气。排掉空气。l(3)(3)培养基升温时开动搅拌系统，以使培养培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到

48、基内部传热均匀，当温度升温到100100时，时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基的温度升温到面，当培养基的温度升温到100100时，培养时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。基的沸腾，可以起到搅拌作用。58l(4)(4)注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。l保温期间温度：保温期间温度：118121118121，时间：，时间：3030分钟。分钟。l(5)(5)灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，

49、保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。冷却使罐内形成负压，易染菌。l分批灭菌时间的计算：例分批灭菌时间的计算：例2-12-1l连续灭菌时间计算：连续灭菌时间计算： t = （2.303/k） lnN0/Nt 式中式中N0、Nt分别为单位体积培养基灭菌前后菌数分别为单位体积培养基灭菌前后菌数59七、分批灭菌与连续灭菌比较l连续灭菌的优点：连续灭菌的优点：l1 1、可采用高温短时，培养基破坏少；、可采用高温短时，培养基破坏少；l2 2、发酵罐利用率高；、发酵罐利用率高；l3 3、蒸汽负荷均衡；、蒸汽负荷均衡；l4 4、可节约能

50、源；、可节约能源；l5 5、劳动强度小。、劳动强度小。60八、培养基灭菌条件l1 1、分批灭菌：、分批灭菌：121121，30min30min，适用于一，适用于一般培养基、消泡剂等；般培养基、消泡剂等；l2 2、连续灭菌：、连续灭菌：130 130 ，5min5min，也有，也有115 115 ，6-8min6-8minl3 3、其他：如尿素溶液、其他：如尿素溶液105 105 ，5min5min61思考题思考题l1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？l2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？l3.淀粉的水解方法主要有什么？试进行优缺点比较？l4.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。 62