《血液凝固调节系统》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血液凝固调节系统（53页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、血液凝固调节系统 对血液凝固系统的调节，使其改变凝血性质，减少纤维蛋白的形成、降低各种凝血因子的活化水平就是抗血液凝固作用。与此作用相关的生理性物质组成了抗血液凝固系统。在其中应该包括血管内皮细胞合成分泌抗凝物质、光滑内皮阻止血小板活化和纤维蛋白的沉积的抗凝作用，以及单核-巨噬细胞对活化凝血因子消除作用的抗凝功能体现。但这种细胞承担的抗凝作用机制不明，目前的检测技术不足以说明细胞抗凝能与生理性抗凝蛋白作用相比。因此，本节主要阐述血液中生理抗凝蛋白的作用和特性。广义上，对纤维蛋白的降解以及有关酶类对活化凝血因子的消除都是对血液凝固的调节。因此，纤溶系统也可算作抗凝系统的一部分。生理性抗凝蛋白（1
2、）抗凝血酶 抗凝血酶（antithrombin， AT）是主要的生理性血浆抗凝物质，尤其对凝血酶的灭活能力占所有抗凝蛋白的70%80%。AT与丝氨酸蛋白酶作用的活性位点位于Arg393-Ser394处，蛋白酶攻击该键使其裂解并引起AT变构，从而形成AT与酶1：1复合物，这种共价结合是不可逆的，但能被肝素或硫酸乙酰肝素（heparansulfate）大大加强。AT与其他丝氨酸蛋白酶抑制物如1-AT、2-AP、HC-II、Nexin及PAI等在氨基酸序列结构上具有同源性。 肝素和抗凝血酶的抑酶作用HeparinAntithrombin Thrombin 除肝以外，其他脏器如肺、脾、肾、心、肠、脑等
3、也有合成AT的能力，血管内皮细胞、巨核细胞也是AT的合成场所。AT的抑酶谱很广，除凝血酶外，它还能抑制凝血因子Xa、IXa、Xla、XIIa以及纤溶酶、胰蛋白酶、激肽释放酶等。作用机制都是相同的，通过形成1：1共价复合物而灭活这些活性因子或蛋白酶。肝素作用于AT的赖氨酸残基从而大大增强AT的抗凝酶活性（2000倍以上）。利用培养的J82细胞研究发现，AT -heparin可有效抑制VIIa/TF复合物，这一作用甚至可被因子X和XI加强，已证明这种抑制并不是由TFPI所引起的，也不需要Xa的活性丝氨酸残基。AT缺乏是发生静脉血栓与肺栓塞的常见原因之一，但与动脉血栓形成关系不大。目前对先天性AT缺
4、乏的分子机制研究报道很多，获得性AT缺乏一般因合成障碍（如肝受损）或消耗过度（DIC、脓毒血症、深静脉血栓、急性早幼粒细胞白血病等）所致。生理性抗凝蛋白（2）蛋白C系统 目前认为蛋白C系统除蛋白C（proteinC，PC）外，还包括蛋白S（proteinS，PS）、血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）和内皮细胞蛋白C受体（endothelialproteinCreceptor，EPCR）。PC由肝细胞合成，是一个依赖维生素K的蛋白质，因此与凝血因子IX、X及凝血酶原等有很高的同源性，分子结构分为羧基谷氨酸区（Gla区），EGF区（PC有两个EGF结构）及含有活性位点的丝氨酸蛋白酶
5、区段。PS也是由肝细胞合成的依赖维生素K的蛋白质，PS是维生素K蛋白质中碱性最大的一种。人类PS有10个羧基谷氨酸残基（牛PS有11个），此外分子中还有1个很短的凝血酶敏感区和4个EGF样结构。TM是一相对分子质量为74000的单链糖蛋白，与PC分子具有同源性，EGF区（共6个，236aa，凝血酶的结合点即位于该区）、SerThr富含区（34aa）、跨膜区（23aa）、C端为38aa的胞内区。已知TM存在于除脑血管外的所有血管内皮细胞中，淋巴管内皮细胞、成骨细胞、血小板、原始巨核细胞系及循环单核细胞中也有发现，但其合成场所目前还不能肯定。人血及尿中还存在一种相对分子质量略低于细胞型TM的可溶性
6、TM。 内皮细胞蛋白C受体自从1994首先在内皮细胞表面发现存在一种穿膜的蛋白受体，它可以影响活化蛋白C的活性，并对整个蛋白C调节血液凝固作用有作用。迄今对这种被称为EPCR的物质还不太了解。但有几点是可以肯定的：由内皮细胞合成；贮存于内皮细胞胞质中；在炎性反应时可表达内皮细胞表面；在胚胎细胞中就可检测出EPCR的基因。蛋白蛋白 C 的抗凝途径的抗凝途径Blood FlowThrombomodulinProtein CAPC损伤处下游的抗凝作用损伤处下游的抗凝作用ThrombinThrombinThrombus血管损伤处发生的血栓血管损伤处发生的血栓EPCRVIIIai蛋白蛋白 C 的主要抗凝
7、作用的主要抗凝作用Blood FlowVIIIaVaThrombusVaiAPCAPCPSPSFactor V LeidenVai 蛋白C系统是微循环抗血栓形成的主要血液凝固调节物质。蛋白C系统的活化随着凝血酶的产生并与内皮细胞表面的血栓调节蛋白TM形成复合物而启动。此时，若内皮细胞表面表达了EPCR，则可与蛋白C结合，结合于EPCR的蛋白C可被TM与凝血酶复合物激活，使蛋白C切下12氨基酸的多肽。（蛋白C肽，Protein C peptide， PCP）。生理性抗凝蛋白（3）组织因子途径抑制物TFPI是一单链糖蛋白，血浆含量为(54142)g/L，均值100g/L。TFPI属于Kunitz族
8、丝氨酸蛋白酶抑制物，即分子中含有Kunitz结构。这一族的典型分子是抑肽酶（aprotinin）。除血浆中存在TFPI以外，血小板的颗粒及溶酶体中也有TFPI，含量为8g/L，是由巨核细胞合成的，血小板活化后也会释放入血浆。此外，发现体内活化的巨噬细胞可能合成TFPI。 激活的VIIa非常稳定，即使在肝素存在时，AT对它的灭活也很缓慢。已知TFPI是主要的调节物。TFPI可以直接抑制活化的X（Xa），并以依赖Xa的形式在Ca2+存在条件下抑制TF/VIIa复合物。TFPI对Xa的抑制通过形成1：1复合物的形式来实现，这步不需要Ca2+参与。但TFPI结合于Xa的活性中心，形成TFPI-Xa后，
9、需在Ca2+存在下与TF/VIIa形成多元复合物。在这种结合中，Xa的富含梭基谷氨酸区域（Gla区）是不可缺少的，因此这是Ca2+的结合位点。 TFPI抑制谱不很广，除抑制Xa及TF/VIIa外，还能抑制胰蛋白酶，对纤溶酶及糜蛋白酶也有轻微抑制，但不抑制凝血酶，活化蛋白C、t-PA等。组织因子途径抑制物（组织因子途径抑制物（TFPITFPI）与凝血）与凝血因子因子XaXa（FXaFXa）的机制）的机制TFPI+FXaTFPI-FXa复合物TF，FVIIaTFPIFXa/TFFVIIa四聚体FXa，FVIIa被灭活生理性抗凝蛋白（4）蛋白Z和蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物 PZ是一种维生素K依赖的糖蛋
10、白，由肝脏合成分泌后进入循环血液中。与其他维生素K依赖的因子一样具有 Gla残基，在结构上与因子VII、IX、X和蛋白C极为相似。华法令可使PZ水平下降到正常时的15%以下；DIC、肝病、骨髓纤维化以及新生儿的PZ水平都是很低的。而凝血酶可以与PZ结合也可以将PZ裂解。 ZPI是一种丝氨酸蛋白酶，相对分子质量为72000，由肝脏合成分泌。与别的氨基酸蛋白酶存在25%35%的相同构形，与大鼠的存在87%的同源性。ZPI在血液凝固或血栓形成时会大量消耗。 在这两个调节蛋白中，较早发现有血液凝固调节作用的是PZ。比较明确的实验是检测血浆或者因子Xa与PZ孵育后，因子X活性会明显下降。这种作用在磷脂和
11、Ca2+的存在时变得更加明显。这种现象可以解释为PZ与因子Xa在磷脂表面存在一种反应，而这种反应的结果是使因子Xa失活。 在以后的研究中进一步证实，ZPI在PZ的协助下，可形成Xa-ZPI-PZ复合物而使因子Xa在1min内失去95%以上的凝血活性。蛋白Z和蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物的抗凝机制纤维蛋白溶解系统 纤维蛋白溶解系统（fibrinolyticsystem）简称纤溶系统，是指纤溶酶原经特异性激活物使其转化为纤溶酶（plasmin，PL），以及PL降解纤维蛋白和其它蛋白质的过程。纤溶过程是一系列蛋白酶催化的连锁反应，是正常人体的重要生理功能，它与血液凝固存在着既矛盾而又统一的动态平衡关系，
12、其主要作用是将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解而保持血管畅通，防止血栓形成或使已形成的血栓溶解，血流复通。纤维蛋白溶解系统（1）纤溶活性物质 纤溶酶原（plasminogen，PLG）是一种单链糖蛋白，主要由肝脏合成而分泌入血。根据纤溶酶原含糖量和结构的不同，可分为两种不同的类型。天然纤溶酶原的N端是谷氨酸，故称为谷氨酸纤溶酶原，它是由两条肽链组成，A链及B链，由二硫键连接。在少量纤溶酶的作用下，在N端切去一个短肽，使N端为赖氨酸，称为赖氨酸纤溶酶原。赖氨酸纤溶酶原被激活剂激活的效率极大，同时与纤维蛋白的亲和力较高，因而能较迅速地转变为赖氨酸纤溶酶，起到更有效的纤溶作用。 组织型纤溶酶原激活物（t
13、issueplasminogenactivator，t-PA）t-PA主要由内皮细胞合成和释放，单核细胞、巨核细胞及间皮细胞也产生一定量的t-PA。游离状态的t-PA与PLG的亲和力低，只有在t-PA、PLG和纤维蛋白三者形成复合体后，才能有效地激活PLG转变成PL，从而使纤维蛋白凝块溶解。 尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinaseplasminogenactivatoru-PA）u-PA属丝氨酸蛋白酶，是一种单链糖蛋白。u-PA主要由泌尿生殖系统上皮细胞产生，血中浓度为（220）ng/ml。u-PA有两种类型，未活化的单链尿激酶常称为scu-PA（single chain urokinog
14、en type plasminogen activator, scu-PA），已活化的双链尿激酶称为tcu-PA（two chains urokinogen type plasminogen activator, tcu-PA）。两种u-PA 均可以直接激活PLG，不需纤维蛋白作为辅因子，但scu-PA对纤溶系统的激活较tcu-PA为弱。 纤溶酶（plasmin,PL）PL是由PLG经PA作用，使PLG活化、裂解后所产生的。单链PLG在t-PA或u-PA的作用下，在其精氨酸560-缬氨酸561之间的肽键断裂，形成双链PL，一条为重链（相对分子质量为60000），另一条为轻链（相对分子质量为25
15、000），活性中心位于轻链部分。PL是一种活性较强的丝氨酸蛋白酶，其主要作用为 降解纤维蛋白原和纤维蛋白；水解各种凝血因子（、）；分解血浆蛋白和补体；可将单链t-PA、单链u-PA转变为双链t-PA、u-PA；将谷氨酸PLG转变为赖氨酸PLG；可降解GPb、GPb/a激活转化生长因子，降解纤维连接蛋白，TSP等各种基质蛋白质。 纤维蛋白溶解系统（2）纤溶抑制物 纤溶酶原激活抑制物-1（plasminogenactivatorinhibitor，PAI-1）PAI-1是一种单链糖蛋白，含有379个氨基酸，相对分子质量为52000，其q21-22之间，全长约12.2Kb。PAI-1主要由血管内皮细
16、胞和血小板合成，正常人血浆中浓度为585g/L。它主要作用是与u-PA或t-PA结合形成不稳定的复合物，使它们失去活性，其次也可抑制凝血酶Fa、Fa、K和APC的活性。 纤溶酶原激活抑制物-2（plasminogenactivatorinhibitor，PAI-2）PAI-2是一种糖蛋白，含有415个氨基酸，其基因位于18q21-23，基因全长16.5Kb。PAI-2最早是从人胎盘中提取的，其它如白细胞、单核细胞、巨噬细胞也能合成PAI-2。正常人血浆中浓度极低，5g/L。妇女妊娠期间逐渐升高，分娩后1周降至检测不到水平。PAI-2有两种类型，一种为非糖基化型（低相对分子质量型），相对分子质量
17、为46000；另一种为糖基化型（高相对分子质量型），相对分子质量为70000。PAI-2的主要作用是有效地抑制tct-PA、tcu-PA，在正常妊娠时调节纤溶活性。 蛋白C抑制物（proteinCinhibitor,PCI）PCI是一种相对分子质量为57000的单链糖蛋白，由肝脏合成或释放，能有效地抑制APC，故又称为APC抑制物（ACPI）。正常人血浆中浓度为5mg/L。PCI能与以丝氨酸为活性中心的蛋白酶形成1：1的复合物，使蛋白酶失活。 也有人称起为3型纤溶酶原激活抑制物。 2-抗纤溶酶（2-antiplasmin,2-AP）2-AP又称2-纤溶酶抑制物（2-plasmininhibit
18、or,2-PI）,是一种单链糖蛋白，含有452个氨基酸，相对分子质量为67000。2-AP主要由肝脏合成或释放，正常人血浆中浓度为1mol/L。2-AP以两种形式存在于血循环中，一种能与PL结合，约占总2-AP的70%，另一种为非纤溶酶结合型，无抑制功能。2-AP的主要功能是抑制PL、凝血因子（Fa、Fa、Fa）、胰蛋白酶、激肽释放酶等以丝氨酸为活性中心的蛋白酶，其发挥作用的机理为：与PL以1:1的比例形成复合物；FXIIIa使2-AP以共价键与纤维蛋白结合，减弱纤维蛋白对PL作用敏感性。 2-巨球蛋白（2-macroglobulin,2-MG）2-MG是一种二聚体糖蛋白，由两个完全相同的亚基
19、所组成，总相对分子质量为725000。每个亚基含有1451个氨基酸。2-MG主要由肝脏和巨噬细胞产生，正常血浆中浓度为25mol/L。2-MG有两个功能区，易裂区（baitregion）和硫醇酯区，是一种广谱的蛋白酶抑制物，可与PL结合形成复合物而使PL灭活。纤维蛋白溶解系统（3）纤溶的作用和产物1内激活途径主要是通过内源凝血系统的有关因子裂解PLG形成PL的过程。F经接触激活成为Fa，后者使PK转变为激肽释放酶，激肽释放酶能激活PLG为PL，此是继发时纤溶理论基础。2外激活途径主要是指t-PA和u-PA使PLG转变为PL的过程，t-PA和u-PA受PAI-1及PAI-2的抑制，它们之间的作用
20、，激活、抑制调节着纤溶系统，此是原发性纤溶的理论基础。3外源性激活途径药物依赖途径，激活纤溶系统的制剂如SK、UK、重组t-PA注入体内，使PLG转变成PL，此是溶栓治疗的理论基础。 纤维蛋白原的降解PL作用于Fg，并从Fg的B链上裂解下来一个小肽B1-42，再从A链上裂解下来的一种极附属物（碎片A、B、C）留下的片段称为X片段（相对分子质量250000），X片段继续被PL作用，裂解为D片段（相对分子质量100000）及Y片段，Y片段再进一步被裂解为D和E片段（相对分子质量为50000），故Fg在PL的作用下产生降解产物，是由X、Y、D、E、B1-42和极附属物A、B、C、H碎片组成，统称为纤
21、维蛋白原降解产物（FgDP）。 可溶性纤维蛋白的降解Fg在凝血酶的作用下，分别从A链及B链裂解下纤维蛋白肽A（fibrinpeptideA,FPA）（A1-16）和纤维蛋白肽B（fibrinpeptideB,FPB）（B1-14），形成纤维蛋白和（可溶性纤维蛋白单体）。Fb-在PL的作用下，先从其B链上裂解出小肽B1-42，再从其A链裂解出A、B、C、H极附属物，最终形成X、Y、D和E。在PL的作用下Fb-中B链被裂解释放出肽B15-42，然后又从A链裂解出A、B、C、H极附属物，最终也降解出X、Y、D和E碎片。 交联性纤维蛋白的降解Fb-和Fb-可自行发生聚合，经因子XIIIa作用而形成交联
22、的纤维蛋白。后者在PL的作用下，形成X，Y，D，E碎片外，还生成D-二聚体和-二聚体、A链的附属物（碎片A、B、C、H）、复合物1（DD/E），复合物2（DY/YD）和复合物3（YY/DXD）等。这些产物统称为纤维蛋白降解产物（fibrindegradationproducts,FbDP）。Fg降解产物（FgDP）和纤维蛋白降解产物（FbDP）统称为纤维蛋白（原）降解产物（FDPs）。FDPs对血液凝固和血小板的功能均有一定的影响。其中所有的碎片均可抑制血小板的聚集和释放反应。碎片（X）因与可溶性纤维蛋白单体结构相似，故可与Fg竞争凝血酶，并可与FM形成复合物，以阻止FM的交联；碎片Y（Y）和
23、D可抑制纤维蛋白单体的聚合，碎片E可以抑制凝血活酶的生成；极附属物A、B、C、H可延长APTT及凝血时间。血液凝固调节系统检测筛查试验1.蛋白CGlobal试验2.活化蛋白C抵抗(APCR)试验3.纤维蛋白降解产物(FDP)测定4.D二聚体(DDimer)测定5.纤溶酶原(PLG)检测蛋白C Global试验 原理原理:凝血酶（T）与血管内皮细胞表面的凝血酶调节蛋白（TM）形成复合物（T-TM），后者使蛋白C（PC）形成活化蛋白C（APC）。APC在蛋白S（PS）的辅助下，灭活因子Va和因子VIIIa，还抑制纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）使纤溶活性增强。此外，Agkistrodoncon
24、torix蛇毒可以取代T-TM复合物直接激活PC，使PC转化为APC，APC也受PCI的抑制检测方法：检测方法：在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直接激活PC转变为APC。随后加入APTT试剂以检测依赖PC活性的血浆凝固时间（ProteinCactivity-dependentclottingtime，PCAT）。若待测血浆中的PC系统正常，则加入Ca2+后血浆凝固时间显著延长。为了避免诸多因素的影响，本试验设计了对照组，即在试验过程中以缓冲液代替PC激活剂，血浆不依赖PC活性的血浆凝固时间（PCAT/O），其结果应短于60秒。参考值参考值：PCAT为85200秒，PCAT/O为3355秒（n2
25、34）临床意义：临床意义：本试验多用于蛋白C、蛋白S、FVLeiden突变和FII20210GA突变的检测，起到蛋白C系统筛选检测作用。本试验也有假阳性，见于凝血因子V、VIII活性升高、口服抗凝剂和狼疮抗凝物等。123450123各种凝固比值各种凝固比值 (m mg/ml)APTTPTRVVT时间时间ControlFactor V LeidenAPCR的实验示意图APCR 对对 FVLeiden突变的筛查突变的筛查APTTXsecondsAPTT+aPCYsecondsYX正常Y=X或YX患者血清纤维蛋白（原）降解产物检测 【原理】 胶乳凝集法：在受检血清中加入用特异性抗纤维蛋白（原）D、E
26、片段抗体标记的胶乳颗粒悬液，如果血清中含有纤维蛋白（原）降解产物（FDP），特别是D、E片段，即可发生抗原抗体反应，导致胶乳颗粒凝集。【参考值】 血清FDP10g/ml【临床评价】 本法具有快速、简便和可靠的优点，是国际上最先选用的有关纤溶和DIC的检验方法。目前认为，血清FDP的检测是诊断DIC的敏感和可靠指标之一。 1血清FDP轻度增高（1040g/ml） 常见于急性静脉血栓、急性心肌梗死、严重肺炎、大手术后、恶性肿瘤和休克等。 2血清FDP明显增高（40g/ml） 见于原发性纤溶症、DIC、急性早幼粒细胞白血病及应用链激酶等溶栓治疗时。 血浆D-二聚体检测【原理】 血浆D-二聚体（D-d
27、imer,D-D）检测，常用下列两种方法：1胶乳凝集法 受检血浆中加入标有D-二聚体单抗的胶乳颗粒悬液，如果血浆中含高于0.5mg/L的D-二聚体，便与胶乳颗粒的抗体结合，此时胶乳颗粒发生凝集。2ELISA法 将D-二聚体单抗包被于酶标反应板，加入受检血浆，血浆中的D-二聚体（抗原）与包被在反应板的D-二聚体抗体结合。然后再加酶标记的D-二聚体抗体，与包被的D-二聚体结合。最后加入底物显色，显色的深浅与血浆中D-二聚体的含量成正相关，所测得的A值可从标准曲线中计算出血浆中D-二聚体的含量。【参考值】 胶乳凝集法：阴性； ELISA法：小于400g/L。【临床评价】 D-二聚体是交联纤维蛋白降解
28、产物之一，为继发性纤溶之特有代谢物，可作为原发性与继发性纤溶鉴别的可靠指标，同时也可作为溶栓治疗有效的观察指标。其中胶乳凝集法方便、快速，是临床上经常采用的D-二聚体定性试验，而ELISA法作为具有更敏感和精确的定量试验方法之一。 1DIC时呈阳性或明显增高，是诊断DIC的重要依据之一。此外，在深静脉血栓、心肌梗死、肺栓塞、重症肝炎等疾病中，D-二聚体也升高。 2D-二聚体在原发性纤溶时呈阴性或不升高，而在继发性纤溶时呈阳性或升高，故可作为两者鉴别的重要依据。 血浆纤溶酶原活性检测【原理】 纤溶酶原活性（plasminogen activity,PLG:A）检测，发色底物法：纤溶酶原在尿激酶作
29、用下转变为纤溶酶，发色底物在纤溶酶的作用下，释放对硝基苯胺而显色。颜色深浅与纤溶酶活性呈正相关，通过计算求得血浆中PLG:A的量。 【参考值】 75%140%。【临床评价】 PLG测定可替代早先的优球蛋白溶解时间测定和染色法进行的纤溶酶活性测定，尤其是PLG活性测定，在单独选用时较为可靠。在溶栓治疗时，因使用的溶栓酶类不同，在治疗开始阶段PLG含量和活性的下降，不一定是纤溶活性增高的标志，应同时进行FDP的测定，以了解机体内真正的纤溶状态。先天性纤溶酶原缺乏症必须强调抗原活性和含量同时检测。以了解是否存在交叉反应物质。 1增高 表示纤溶活性减低，见于血栓前状态和血栓性疾病。 2减低 表示纤溶活
30、性增高，常见于原发性纤溶症和DIC外，还见于前置胎盘、肿瘤扩散、大手术后、肝硬化、重症肝炎、门脉高压、肝切除等获得性纤溶酶原缺乏症。 3.PLG缺陷症 可分为交叉反应物质阳性（CRM+）型（PLG:Ag正常和PLG:A减低）和CRM-型（PLG:Ag和PLG:A均减低）。 血浆纤溶酶原抗原检测【原理】 血浆纤溶酶原抗原（PLG:Ag）测定，ELISA法：将纯化的兔抗人纤溶酶原抗体包被在酶标反应板上，加入受检血浆，血浆中的纤溶酶原（抗原）与包被在反应板上的抗体结合，然后加入酶标记的兔抗人纤溶酶原抗体，酶标抗体与结合在反应板上的纤溶酶原结合，最后加入底物显色，显色的深浅与受检血浆中纤溶酶原的含量呈
31、正相关。根据受检者测得的A值，从标准曲线计算标本中PLG的含量。【参考值】 （0.22士0.03）g/L。 【临床评价】 同纤溶酶原活性测定。 血液凝固调节系统检测特殊试验1.生理性抗凝蛋白缺陷2.病理性抗凝物质(异常抗凝物质)增多3.纤溶活性异常检测血液凝固调节系统异常疾病1.异常抗凝物质增多2.易栓症3.血栓性疾病4.原发性纤溶亢进症5.继发性纤溶亢进症JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkW
32、nZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C
33、4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRi
34、UmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTls&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y+B3E
35、6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQhTl
36、Wo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2D5
37、H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%vC3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr
38、%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7
39、JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$
40、t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePho#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMe
41、PhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-
42、A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(yF7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo
43、#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSnZr$u(x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9
44、KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v
45、(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&wD5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjV
46、mYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTk#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)y0C3F
47、7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmt*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNeQ
