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1、实验实验二通二通课课内毒素的内毒素的检测检测一、内毒素的一、内毒素的检测v内毒素生物学活性：致内毒素生物学活性：致热作用作用、白白细胞胞 反反应、感染性休克和感染性休克和DIC等。等。v内毒素内毒素检测的的应用：用： （ 1 ）检测输液用品或生物制品中是否液用品或生物制品中是否 含有内毒素含有内毒素 （ 2 ）临床上床上检测患者是否有革患者是否有革兰氏阴氏阴 性菌感染引起的内毒素血症（内毒素性菌感染引起的内毒素血症（内毒素 休克）等休克）等 v检测内毒素的方法有家兔内毒素的方法有家兔发热法法和和鲎实验法，家兔法，家兔发热法比法比较烦琐，且灵敏度不高，故，且灵敏度不高，故现在多用在多用鲎实验法，
2、法，鲎实验法灵敏度高，法灵敏度高，可可检测小于小于10ng/ml的内毒素。的内毒素。 原原 理理 鲎（huhu）是一种海洋）是一种海洋节肢肢动物，其血液物，其血液中含有一种有核中含有一种有核变形形细胞，胞，这种种细胞的胞胞的胞浆中含有凝固中含有凝固酶原和凝固蛋白原。原和凝固蛋白原。 内毒素内毒素（LPS）激激 活活 凝固蛋白原凝固蛋白原 凝固蛋白凝固蛋白 （溶解状（溶解状态） （凝胶状（凝胶状态）凝固凝固酶原原凝固凝固酶材材 料料vv鲎试剂vv鲎试剂溶解水溶解水vv内毒素内毒素试剂 vv无菌注射器无菌注射器 方法及方法及结果果方法：方法： 1.1.取两支取两支鲎试剂打开，分打开，分别加入加入0
3、.1ml 0.1ml 鲎试剂溶解水，溶解水， 振振摇使之完全溶解。使之完全溶解。 2.2.其中一支加入其中一支加入0.1ml0.1ml内毒素，内毒素，标记为实验组， 另一支加入另一支加入0.1ml0.1ml溶解水，溶解水，标记为对照照组。 3.3.垂直放入垂直放入3737温箱，温箱，20-3020-30分分钟观察察结果。果。结果：果： 实验组出出现凝固凝固，对照照组不出不出现凝固凝固二、二、细菌在自然界的分布及理化菌在自然界的分布及理化因素因素对细菌的影响菌的影响 1.1.空气中空气中细菌的菌的检查（每个班每个班1 1个平皿个平皿） 原理：原理：根据空气中携根据空气中携带有微生物气溶胶（以固体
4、或液有微生物气溶胶（以固体或液体微小体微小颗粒分散于空气中的分散体系称粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶，其中的气气溶胶，其中的气体是分散介体是分散介质）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到式沉降到琼脂培养基上。脂培养基上。 方法：方法：在室内在室内选择一一处放一个平皿。揭开皿盖，皿盖放一个平皿。揭开皿盖，皿盖扣置于皿底下，暴露扣置于皿底下，暴露放置放置15min，即盖上皿盖，放入，即盖上皿盖，放入37 培培养养24小小时，观察察结果。果。细菌在自然界的分布菌在自然界的分布 2. 咽喉部咽喉部细菌的菌的检查（每班（每班2个平皿）个平皿） n取血
5、取血琼脂平板脂平板1块，打开平皿盖，将培养基面置，打开平皿盖，将培养基面置于口腔前于口腔前10cm处，受，受试者用力咳嗽几次；者用力咳嗽几次；n盖上平皿盖，置盖上平皿盖，置37温箱中倒置培养温箱中倒置培养24h后取出后取出观察察结果果。细菌在自然界的分布菌在自然界的分布2 2、物理因素、物理因素对细菌的影响菌的影响（1）高高压蒸汽蒸汽灭菌菌 在在1.05kg/cm1.05kg/cm2 2(103.425KPa)(103.425KPa)的的压力下，温度达到力下，温度达到121.3121.3，维持持151530min30min，可，可杀灭包括包括细菌芽胞在内的菌芽胞在内的一切微生物一切微生物 适用
6、于耐高温高适用于耐高温高压并且不怕潮湿的物品，如敷料、并且不怕潮湿的物品，如敷料、手手术器械、器械、药品和品和细菌培养基等菌培养基等手手提提式式高高压蒸蒸汽汽灭菌菌器器(1)(1)准准备：向向锅内加水至水位内加水至水位标记线为止。将准止。将准备灭菌的培养基及菌的培养基及空玻璃器皿用牛皮空玻璃器皿用牛皮纸包好，装入包好，装入锅内套内套层中，物品放置不宜中，物品放置不宜过多，多，过挤，锅内内应留出三分之一空留出三分之一空间。然后盖。然后盖严锅盖，采用盖，采用对角式均匀角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，打开盖上的螺旋，打开锅盖上的放气盖上的放气阀。(2)(2)加加热：接通接通电源，开始加源，开始加热。至有均
7、匀白色水蒸汽冒出。至有均匀白色水蒸汽冒出为止，止，以排以排净锅内冷空气。关内冷空气。关闭排气排气阀，继续加加热。当。当压力表上升到所需力表上升到所需压力（一般力（一般为1.05kg/cm1.05kg/cm2 2或或103.425KPa103.425KPa）时，开始，开始计算算灭菌菌时间。此此时应适适时关关闭热源，不断源，不断调节热源大小，使源大小，使压力始力始终维持在所需持在所需数数值上，达到保上，达到保压时间后停止加后停止加热，使，使灭菌菌锅内内压力自然下降。力自然下降。(3)(3)结束：束：待待压力表降至力表降至“0 0”时，拧松螺旋，半开松螺旋，半开锅盖，用盖，用锅内余内余热烘干包装烘干
8、包装纸，1010分分钟后取出后取出灭菌物品。菌物品。注意事注意事项：（1 1）在）在灭菌菌过程中，程中，应注意排注意排净锅内冷空气，如排放不内冷空气，如排放不净，会，会影响影响灭菌效果，达不到菌效果，达不到彻底底灭菌的目的。菌的目的。（2 2）由于高）由于高压蒸汽蒸汽灭菌菌时，要使用高温高，要使用高温高压蒸汽，操作蒸汽，操作时，必，必须严格按照操作格按照操作规程操作，否程操作，否则容易容易发生意外事故。生意外事故。 （2）紫外）紫外线对细菌生菌生长的影响：的影响： 紫外紫外线为非非电离离辐射，波射，波长在在240240280nm280nm的紫外的紫外线具具有有杀菌作用，其中波菌作用，其中波长2
9、65265266nm266nm的紫外的紫外线杀菌能力最菌能力最强，这与与DNADNA吸收光吸收光谱范范围一致一致 其其杀菌原理是，紫外菌原理是，紫外线易被核蛋白吸收，使易被核蛋白吸收，使DNADNA的同一的同一条条链上或者两条上或者两条链上位置相上位置相邻的胸腺的胸腺嘧啶形成胸腺形成胸腺嘧啶二二聚体，从而干聚体，从而干扰DNADNA的复制，的复制，导致致细菌死亡或者菌死亡或者变异。另，异。另，紫外紫外线通通过空气空气时，可使空气中的氧气，可使空气中的氧气电离离产生臭氧，加生臭氧，加强了了杀菌作用菌作用 紫外紫外线杀菌作用菌作用强，而穿透能力弱。，而穿透能力弱。 取普通取普通琼脂平皿，用密涂法接
10、种脂平皿，用密涂法接种细菌，然后菌，然后取一无菌取一无菌滤纸片将平皿部分遮盖，用紫外片将平皿部分遮盖，用紫外线照射照射30min30min，然后将，然后将纸片拿开，放入片拿开，放入3737温箱中孵育温箱中孵育24h24h后后观察（察（滤纸片用片用过后后烧掉）。掉）。 同同样方法方法进行玻璃遮盖法行玻璃遮盖法实验。v 有些化学有些化学药品品浓度高度高时能能杀灭病原微生物，病原微生物， 称称为化学消毒化学消毒剂；v 浓度低度低时能抑制能抑制细菌生菌生长，称，称为防腐防腐剂；v 只能外用，只能外用，对细菌的敏感性不同。菌的敏感性不同。化学消毒化学消毒剂对细菌的影响菌的影响化学消毒化学消毒剂对细菌的影
11、响菌的影响方法方法：取一普通平皿培养取一普通平皿培养基，一部分写上基，一部分写上“前前”，另一部分写上另一部分写上“后后”，然，然后将手指在写有后将手指在写有“前前”的的部分沾一下，再将手指用部分沾一下，再将手指用酒精酒精进行消毒，在写有行消毒，在写有“后后”的部分沾一下。放入的部分沾一下。放入3737温箱培养温箱培养2424小小时后后观察。察。 （每个（每个实验室室4 4个平皿）个平皿） 三、致病性三、致病性肠道杆菌的分离与道杆菌的分离与鉴定定粪便便生化反生化反应SS琼脂平板脂平板（双糖含（双糖含铁培养基）培养基）（必要（必要时进行增菌培养）行增菌培养）得出得出结论革革兰染色染色菌落菌落观察
12、挑取可疑菌落察挑取可疑菌落纯培养培养血清学血清学鉴定定观察菌落特征察菌落特征取可疑菌落做革取可疑菌落做革兰染色染色将将细菌接种于两支双糖菌接种于两支双糖铁培养基上，培养基上，37 度培养度培养24小小时，观察察结果果做血清学做血清学实验（玻片凝集）（玻片凝集）给出出结果和果和鉴定依据定依据致病性致病性肠道杆菌的分离与道杆菌的分离与鉴定定常常见致病性致病性肠道杆菌道杆菌 （1）大）大肠杆菌杆菌v 生物学性状生物学性状: G-v 镜下下为杆状杆状v营养要求不高，可在普养要求不高，可在普通通琼脂培养基上生脂培养基上生长v最适宜温度最适宜温度为37，最，最适宜适宜pH为7.4（2）伤寒杆菌寒杆菌v生物
13、学特性生物学特性: G-v镜下下为杆状杆状v营养要求不高，可在普养要求不高，可在普通通琼脂培养基上生脂培养基上生长v最适宜温度最适宜温度为37，最，最适宜适宜pH为7.4大大肠杆菌：杆菌：v 圆形，凸起，灰白色，表面光滑，湿形，凸起，灰白色，表面光滑，湿润伤寒杆菌：寒杆菌：v圆形，无色，半透明形，无色，半透明菌落特点菌落特点肠道杆菌的生化反道杆菌的生化反应乳糖乳糖发酵酵试验初步初步鉴别肠道致病菌和道致病菌和肠道非致病菌道非致病菌肠道致病菌道致病菌肠道非致病菌道非致病菌多数不多数不发酵乳糖酵乳糖 多数多数发酵乳糖酵乳糖SS培养基v含有胆酸含有胆酸盐抑制抑制G+,枸枸橼酸酸钠和煌和煌绿能部分抑制能
14、部分抑制大大肠杆菌杆菌,致病的沙致病的沙门菌菌和志和志贺菌能大量生菌能大量生长.v含有中性含有中性红指示指示剂和乳和乳糖糖,中性中性红遇酸遇酸变粉粉红.v常用于培养常用于培养肠道致病菌道致病菌.SS培养基上各菌的生培养基上各菌的生长特点特点 大大肠杆菌：粉杆菌：粉红色大菌落色大菌落 伤寒杆菌：无色寒杆菌：无色细小半透明菌落小半透明菌落 福氏痢疾杆菌：无色福氏痢疾杆菌：无色细小半透明菌落小半透明菌落 双糖双糖铁培养基的特点培养基的特点v含有乳糖和葡萄糖：含有乳糖和葡萄糖：产酸酸产气气v含有硫酸含有硫酸亚铁：如：如细菌分解含硫氨基酸生成菌分解含硫氨基酸生成 硫化硫化氢，可形成，可形成黑色沉淀黑色沉
15、淀v酚酚红指示指示剂： 酸：黄酸：黄 碱：碱：红 v用于用于观察察细菌是否菌是否产生硫化生硫化氢及及对糖的糖的发酵能力酵能力v1)大大肠杆菌杆菌发酵乳糖和葡萄糖酵乳糖和葡萄糖产酸酸产气（糖气（糖发酵酵试验）,是斜面及底是斜面及底层均呈黄色并有气泡。均呈黄色并有气泡。 v2) 沙沙门菌和志菌和志贺菌只菌只发酵葡萄糖酵葡萄糖,不不发酵乳糖酵乳糖,分解葡萄分解葡萄 糖糖产的酸使培养基的酸使培养基pH下降下降,酚酚红指示指示剂变黄黄,但是培养基但是培养基中的葡萄糖中的葡萄糖仅有有0.1%,在斜面的酸性物在斜面的酸性物质被氧化成被氧化成挥发性酸性酸,且且细菌氧化氨基酸物菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作用
16、生的氨的中和作用,使斜使斜面面变红,而底而底层则为黄色。黄色。 另沙另沙门菌分解含硫氨基酸，有黑色沉淀。菌分解含硫氨基酸，有黑色沉淀。 双糖双糖铁培养基上各菌的生培养基上各菌的生长特点特点 v原理原理: 颗粒性抗原粒性抗原(未知未知细菌菌)+已知抗体已知抗体(诊断血清断血清) v材料：材料：伤寒血清、待寒血清、待检菌菌v方法方法:操作同血操作同血浆凝固凝固酶实验（将血（将血浆换成成伤寒血清）寒血清） v结果果:凝集凝集+ ，待，待测菌菌 为伤寒杆菌寒杆菌 不凝集不凝集 -，待，待测菌菌 不是不是伤寒杆菌寒杆菌 玻片凝集反玻片凝集反应v 将将粪便便标本以分区划本以分区划线法接种到法接种到SSSS培养基。培养基。 ( (每个每个实验室室8 8个平板）个平板）( (接种好后，做好接种好后，做好标记，用胶布按班，用胶布按班绑好好) )v 放入放入37温箱中培养温箱中培养24小小时。取出放。取出放4冰冰 箱箱中保存中保存备用。用。分离培养方法分离培养方法v预习下周内容：下周内容：肠道杆菌的道杆菌的鉴定、定、药敏敏实验、抗酸染色抗酸染色
