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1、12课题一课题一 菊花的组织培养菊花的组织培养 安岳中学：安岳中学： 蒋小丽蒋小丽3有丝分裂有丝分裂受精卵受精卵细细胞胞分分化化 在个体发育中，由一个或在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。性差异的过程。1 1、细胞分化的概念、细胞分化的概念一、知识回顾4 黑色素细胞在体外培养黑色素细胞在体外培养3030多代后仍能合多代后仍能合成黑色素；离体培养的上皮细胞，始终保持成黑色素；离体培养的上皮细胞，始终保持为上皮细胞，而不会变成其他类型的细胞。为上皮细胞，而不会变成其他类型的细胞。 2 2
2、、稳定性、稳定性3 3、不可逆性、不可逆性细胞分化发生在整个生命进程中。细胞分化发生在整个生命进程中。1 1、持久性、持久性2 2、细胞分化的特点、细胞分化的特点 造血干细胞造血干细胞 原红细胞原红细胞 早幼红细早幼红细胞胞 中幼红细胞中幼红细胞 晚幼红细胞晚幼红细胞 成成熟红细胞熟红细胞 死亡死亡4 4、普遍性、普遍性5 细胞分化细胞分化是否意味着细是否意味着细胞中遗传物质胞中遗传物质的改变？的改变？ 遗传物质遗传物质没有改变没有改变，不同组织的细胞共同不同组织的细胞共同来源于受精卵，经有来源于受精卵，经有丝分裂产生。丝分裂产生。63、细胞分化的实质、细胞分化的实质A AB BD DC CE
3、 EEDCA BEDCA BEDCA BEDCA B基因基因在个体发育过程中，不同细胞中在个体发育过程中，不同细胞中遗传信息的执行情况不同即基因遗传信息的执行情况不同即基因的选择性表达的过程的选择性表达的过程7 红细胞红细胞合成血红蛋白合成血红蛋白 ( (不合成肌动蛋白不合成肌动蛋白) )肌细胞肌细胞肌动蛋白基因开启肌动蛋白基因开启合成肌动蛋白合成肌动蛋白 ( (不合成血红蛋白不合成血红蛋白) )肌动蛋白基因关闭肌动蛋白基因关闭血红蛋白基因关闭血红蛋白基因关闭血红蛋白基因开启血红蛋白基因开启4、细胞分化的结果、细胞分化的结果 细胞产生了不同种类的蛋白质即出现了细胞产生了不同种类的蛋白质即出现了
4、不同的结构和功能不同的结构和功能的的细胞和组织。细胞和组织。8愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体19581958，美国，斯图，美国，斯图尔德尔德 植物组织培养植物组织培养离体二、基础知识二、基础知识9（一）植物组织培养概念关键词：关键词： 外植体、脱分化、再分化、愈伤组织外植体、脱分化、再分化、愈伤组织 在在无菌无菌和和人工控制人工控制条件下，将离体的植条件下，将离体的植物物器官、组织、细胞器官、组织、细胞，培养在人工配置的培，培养在人工配置的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其脱分养基上，给予适宜的培养条件，诱导其脱分化产生愈伤组织再分化形成丛芽，最终形成化产生愈伤组织再分化形成丛芽，最终形成完整
5、的植株完整的植株。又称：又称：植物离体培养植物离体培养10脱分化（或去分化）脱分化（或去分化）：由高度分化的植物组由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。织或细胞产生愈伤组织的过程。再分化再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程。养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程。外植体外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段用于离体培养的植物器官或组织片段。愈伤组织愈伤组织：细胞排列疏松、无规则、高度液：细胞排列疏松、无规则、高度液泡化的无定形的薄壁细胞。泡化的无定形的薄壁细胞。11切取切取形成层形成层无菌无菌接种接种诱导愈伤组织
6、诱导愈伤组织的形成的形成试管苗的形成试管苗的形成培养室培养室移栽移栽脱分化脱分化再分化再分化（二）植物组织培养的基本过程（二）植物组织培养的基本过程12植物组织培养过程植物组织培养过程离离离离体体体体组组组组织织织织或或或或细细细细胞胞胞胞植植植植物物物物体体体体脱分化脱分化脱分化脱分化细胞分细胞分细胞分细胞分裂素裂素裂素裂素生长素生长素生长素生长素愈愈愈愈伤伤伤伤组组组组织织织织芽芽芽芽根根根根细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素素素素 生长素生长素生长素生长素细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素素素素 生长素生长素生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素 生长素生长素生长素生长素细
7、胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素有利于根的分化有利于根的分化有利于根的分化有利于根的分化有利于芽的分化，抑制根的分化有利于芽的分化，抑制根的分化有利于芽的分化，抑制根的分化有利于芽的分化，抑制根的分化促进愈伤组织生长促进愈伤组织生长促进愈伤组织生长促进愈伤组织生长vv激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：的发育方向：25思考：以下培养基出现的现象反应了什么问题？思考：以下培养基出现的现象反应了什么问题？生长素生长素生长素生长素/ /细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素高高高高 利于根的形成利于根的形成利于根的形成利于根的形成适中适
8、中适中适中 利于愈伤组织的形成利于愈伤组织的形成利于愈伤组织的形成利于愈伤组织的形成26供参考的配方供参考的配方n1 1、诱导菊花愈伤组织：、诱导菊花愈伤组织：n在在MSMS培养基中加入培养基中加入BABA和和NAANAA，质量浓度均为，质量浓度均为0.5mg0.5mgn、诱导菊花从芽、诱导菊花从芽：n在在MSMS培养基中加入培养基中加入BABA和和NAANAA，质量浓度分别为，质量浓度分别为2-2-3mg3mg和和0.020.03mg0.020.03mgn3 3、诱导菊花生根：、诱导菊花生根：n在在MSMS培养基各成分用量减半，并添加入培养基各成分用量减半，并添加入NAANAA或或IAAIA
9、A，质量浓度均为，质量浓度均为0.1mg0.1mg274温度、光照、pH的影响光照：光照：菊花每日用日光灯照射菊花每日用日光灯照射12h12h。温度：温度：大多数植物组织培养控制在大多数植物组织培养控制在23232727 , , 低于低于1515时植物组织会表现生长停止时植物组织会表现生长停止, , 高于高于3535时对植物生长不利。时对植物生长不利。 菊花的组织培养控制在菊花的组织培养控制在18182222。pHpH： 不同植物对培养基最适不同植物对培养基最适pH的要求不的要求不 同，大多数控制在同，大多数控制在56.5。 菊花的组织培养控制在菊花的组织培养控制在5.8左右。左右。28制备制
10、备MS固固体培养基体培养基外植体消毒外植体消毒 接种接种 培培 养养栽栽 培培四、实验操作四、实验操作 移移 栽栽冲洗冲洗酒精酒精无菌水冲洗无菌水冲洗氯化汞氯化汞无菌水冲洗至少三无菌水冲洗至少三次之上次之上配制各种母液配制各种母液配制培养基配制培养基灭菌灭菌29（一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基MSMSMSMS培养基包括培养基包括培养基包括培养基包括20202020多种营养成分，实验室一般使用多种营养成分，实验室一般使用多种营养成分，实验室一般使用多种营养成分，实验室一般使用4 4 4 4保存配制好的保存配制好的保存配制好的保存配制好的培养基培养基培养基培养基母液母液母液母液来制
11、备来制备来制备来制备1 1、配制各种母液、配制各种母液无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩10101010倍，微量元素浓缩倍，微量元素浓缩倍，微量元素浓缩倍，微量元素浓缩100100100100倍，常温保存倍，常温保存倍，常温保存倍，常温保存激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml1mg/ml1mg/ml1mg/ml的质量浓度的质量浓度的质量浓度的质量浓度单独单独单独单独配制成母液配制成母液配制成母液配制
12、成母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量倍数，计算用量倍数，计算用量倍数，计算用量302 2、配制培养基、配制培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml50ml或或100ml100ml 配制培养液配制培养液 调调PHPH 培养基的分装培养基的分装 由于菊花的茎段的组织培养比较容由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素易，因此不必添加植物激素3 3、灭菌、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起分装好的培养基连同其他器械一
13、起进行高压蒸汽灭菌进行高压蒸汽灭菌311 1 1 1、选材：、选材：、选材：、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒（二）外植体消毒2 2 2 2、消毒、消毒、消毒、消毒流水冲洗流水冲洗流水冲洗流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在轻刷洗，刷洗后在轻刷洗，刷洗后在轻刷洗，刷洗后在流水流水流水流水下冲洗下冲洗下冲洗下冲洗20min20min20min20mi
14、n左右左右左右左右 酒精处理酒精处理酒精处理酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积体积体积体积分数为分数为分数为分数为70707070的酒精的酒精的酒精的酒精中摇动中摇动中摇动中摇动2 2 2 23 3 3 3次，持续次，持续次，持续次，持续6 6 6 67s7s7s7s，立，立，立，立即将外植体取出，在即将外植体取出，在即将外植体取出，在即将外植体取出，在无菌水无菌水无菌水无菌水中清洗中清洗中清洗中清洗 消毒液处理消毒液处理消毒液处理消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外
15、植体表面的水分，放取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入入入入质量分数为质量分数为质量分数为质量分数为0.10.10.10.1的氯化汞溶液的氯化汞溶液的氯化汞溶液的氯化汞溶液中中中中1 1 1 12min2min2min2min，取，取，取，取出后在出后在出后在出后在无菌水无菌水无菌水无菌水中至少清洗中至少清洗中至少清洗中至少清洗3 3 3 3次，漂净次，漂净次，漂净次，漂净消毒液消毒液消毒液消毒液32（三）接种（三）接种污染的主要来源是空气中的污染的主要来源是空气中的污染的主要来源是空气中的污染的主要来
16、源是空气中的细菌和孢子细菌和孢子细菌和孢子细菌和孢子，接种室消毒，接种室消毒，接种室消毒，接种室消毒是至关重要的。用是至关重要的。用是至关重要的。用是至关重要的。用70707070的酒精的酒精的酒精的酒精喷雾使空气消毒，喷雾使空气消毒，喷雾使空气消毒，喷雾使空气消毒， 酒酒酒酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20202020分钟分钟分钟分钟。1 1、接种室消毒、接种室消毒2 2、无菌操作要求、无菌操作要求操作要在操作要在操作要在操作要在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁
17、完成，每次使用器械后，都需完成，每次使用器械后，都需完成，每次使用器械后，都需完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3 3、材料的切取和接种、材料的切取和接种 将消过毒的菊花茎段在将消过毒的菊花茎段在将消过毒的菊花茎段在将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿无菌培养皿无菌培养皿无菌培养皿中切成中切成中切成中切成0.50.50.50.51cm1cm的小段，用的小段，用的小段，用的小段，用镊子镊子镊子镊子夹取菊花茎段接种。夹取菊花茎段接种。夹取菊花茎段接种。夹取菊花茎
18、段接种。334 4、接种注意事项、接种注意事项每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70707070的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种一遍，冷却后再接种一遍，冷却后再接种一遍，冷却后再接种外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根外植体
19、在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般据锥形瓶的大小确定，一般据锥形瓶的大小确定，一般据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜胡萝卜胡萝卜胡萝卜3 3 3 34 4 4 4块，菊的茎或块，菊的茎或块，菊的茎或块，菊的茎或叶叶叶叶6 6 6 68 8 8 8块块块块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养，也不要太少，以充分利用培养基中的营养，也不要太少，以充分利用培养基中的营养，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件成分和光照条件成分和光照条件成分和光照条件插入时应注意方向，插入时应注意方向，插入时应注意方向，插入时应注意方向，形态学上端朝上，形态学下端形态学上端朝上，
20、形态学下端形态学上端朝上，形态学下端形态学上端朝上，形态学下端朝下，朝下，朝下，朝下，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分收水分和养分收水分和养分收水分和养分35正常苗正常苗污染苗污染苗361、外植体带菌、外植体带菌2、培养基及接种、培养基及接种器具灭菌不彻底器具灭菌不彻底3、接种操作时带入、接种操作时带入4、环境不清洁、环境不清洁污染途径污染途径37思考：你打算做几组重复？你打算设置思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？对照实验吗？答：每种材料或配方
21、至少要做答：每种材料或配方至少要做一组以上一组以上的重复。的重复。设置对照实验可以取用一个设置对照实验可以取用一个经过灭菌经过灭菌的装有培养的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。38（四）培养（四）培养n接种后的锥形瓶最好放在接种后的锥形瓶最好放在无菌箱无菌箱中培养，中培养，培养期间应定期消毒培养期间应定期消毒n培养温度控制在培养温度控制在18-22n每日用日光灯每日用日光灯光照光照12h39（五）移栽（五）移栽 移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的移栽生
22、根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日封口膜，让试管苗在培养间生长几日封口膜，让试管苗在培养间生长几日封口膜，让试管苗在培养间生长几日。一般放置在一般放置在一般放置在一般放置在2020202025252525的的的的遮荫环境遮荫环境遮荫环境遮荫环境中，适应中，适应中，适应中，适应5 5 5 57d7d7d7d。试管苗不萎蔫，有试管苗不萎蔫，有试管苗不萎蔫，有试管苗不萎蔫，有新生长的趋势，便可移栽。新生长的趋势，便可移栽。新生长的趋势，便可移栽。新生长的趋势，便可移栽。1 1、打开封
23、口膜、打开封口膜2 2、清洗转移、清洗转移 用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒将幼苗移植到消过毒将幼苗移植到消过毒将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下的蛭石或珍珠岩等环境下的蛭石或珍珠岩等环境下的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间生活一段时间生活一段时间生活一段时间3 3、移栽、移栽幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗长壮后，移栽到土壤中40固体基质型，含水量高、固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培蓄水性强、透性好，适合栽培珍珠岩珍珠岩 ,珍珠岩是一种火山喷发珍
24、珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而成的的酸性熔岩，经急剧冷却而成的玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，如珍珠的结构，所以被命名为珍如珍珠的结构，所以被命名为珍珠岩珠岩 。蛭石蛭石是一种天然、无毒的矿物质，是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。酸盐。 41（六）栽培（六）栽培 幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，长情况，适时浇水、施肥，直至开花适时浇水、施肥，直至开花421、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）、培养基的灭菌（高
25、压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）、外植体的消毒（酒精、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯、接种的无菌操作（酒精、酒精灯灼烧）灼烧）4、无菌箱中的培养；、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。在整个操作过程中，是如何来实现在整个操作过程中，是如何来实现无菌无菌环境的？环境的？43结果分析与评价（一）对接种操作中污染情况的分析（一）对接种操作中污染情况的分析（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化（三）是否进行了统计、对照与记录（三）是否进行了统计、对照与记录（四）生根苗的移栽是否合格
26、（四）生根苗的移栽是否合格44五、课题延伸五、课题延伸1 1、一般来说，容易进行、一般来说，容易进行无性繁殖无性繁殖的植物，也容的植物，也容易进行组织培养易进行组织培养2 2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季营养繁殖营养繁殖扦插扦插嫁接嫁接压条压条 45扦插扦插嫁接嫁接压条压条 46练习练习1.答：植物组织培养所利用的植物材料体积小、答：植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养
27、生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。2.答：外植体的生理状态是成功进行组织培养答：外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。好，容易诱导脱分化和再分化。47菊菊花花的的组组织织培培养养再分化再分化材料性质、营养物质、材料性质、营养物质、调节物质、环境条件调节物质、环境条件外植体的消毒外植体的消毒接种接种基本原理基本原理:细胞的全能性细胞的全能性基本过程基本过程:脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织影响因素：影响因素：操作流程：操作流程：配制配制MS固体培固体培养基养基培养培养移栽移栽栽培栽培48
