《受体配体简课堂PPT》由会员分享，可在线阅读，更多相关《受体配体简课堂PPT（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第八节第八节受体的放射性配体结合分析受体的放射性配体结合分析（radioligand binding assay of receptors, RBA） 岳岳 凌凌1授课：XX一、总一、总 论论 受体受体（receptor，R） 细胞膜上或细胞内能识别生物活性物质并与细胞膜上或细胞内能识别生物活性物质并与之结合，进而引起生物学效应的生物大分子。之结合，进而引起生物学效应的生物大分子。 2授课：XX 配体配体（ligand，L） 能与受体特异性结合的生物活性分子。能与受体特异性结合的生物活性分子。 配体配体 内源性配体内源性配体外源性配体外源性配体3授课：XX RBA 原理是基于放射性核素标记的配
2、体与特异受体的理化结原理是基于放射性核素标记的配体与特异受体的理化结合反应。合反应。 应用放射性标记配体和组织、细胞或含有受体的制剂一应用放射性标记配体和组织、细胞或含有受体的制剂一起温育，使受体和配体充分结合，形成受体起温育，使受体和配体充分结合，形成受体-配体复合物，配体复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定受体物，测定受体-配体复合物的放射性，经过数据处理，可配体复合物的放射性，经过数据处理，可求得受体对配体的亲和力和受体的最大结合容量。求得受体对配体的亲和力和受体的最大结合容量。 4授课：XX RBA的分类的分类
3、 定量定量RBA 可以测定靶组织或靶细胞中能与配体结合的受体数可以测定靶组织或靶细胞中能与配体结合的受体数（以结合位点数表示）及研究受体的亲和力（常以（以结合位点数表示）及研究受体的亲和力（常以平衡解离常数表示）。平衡解离常数表示）。 定性定性RBA 发现和确定新的受体和受体亚型，及在分子水平研发现和确定新的受体和受体亚型，及在分子水平研 究受体究受体-配体的相互作用等。配体的相互作用等。 5授课：XX RBA的应用的应用 神经递质神经递质 激素和药物等的作用机制激素和药物等的作用机制 疾病的病因和发病机制疾病的病因和发病机制 新药设计和药物筛选新药设计和药物筛选 受体显像与受体介导治疗受体显
4、像与受体介导治疗 6授课：XX二、概二、概 述述1. 受体的分类受体的分类 类(class) 膜受体 核受体 亚类（subclass） 型 (type) 亚型 (subtype) 7授课：XX2. 受体与配体结合的基本特点受体与配体结合的基本特点1）可饱和性）可饱和性(saturability) 2）特异性）特异性(specificity) 3）适度的亲和力（）适度的亲和力（affinity） 4）可逆性）可逆性(reversibility) 5）识别能力）识别能力(recognition)和生物效应的一致性和生物效应的一致性8授课：XX受体与配体特异性结合的特点：受体与配体特异性结合的特点：
5、亲和力高，结合容量小。亲和力高，结合容量小。亲和力：受体与配体的结合能力。亲和力：受体与配体的结合能力。平衡解离常数（平衡解离常数（equilibrium dissociation constant，KD） 指占据半数受体所需的配体浓度。指占据半数受体所需的配体浓度。 KD值愈小，表明亲和力愈高；值愈小，表明亲和力愈高；KD值愈大，亲和力愈低。值愈大，亲和力愈低。9授课：XX三、单位点系统三、单位点系统RBA的基本规律的基本规律（一）简单单位点系统受体和配体结合反应的基本规律一）简单单位点系统受体和配体结合反应的基本规律 1. 质量作用定律质量作用定律 k1,v1 R + L RL k2,v2
6、 根据质量作用定律根据质量作用定律： v1 = k1 R L v2 = k2 RL 10授课：XX 当反应达到平衡后，当反应达到平衡后， v1 = v2 即：即： k1 RL = k2 RL 则平衡解离常数（则平衡解离常数（KD）的数学表达式（）的数学表达式（1.1）为）为： KD k2 RL k1 RL11授课：XX2. 饱和曲线饱和曲线(saturation curve)1）饱和曲线）饱和曲线 当配体的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐当配体的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此RL的的增加不是直
7、线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体结合时，绝大部分受体与配体结合时，RL的增加就非常缓慢，渐的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线 。12授课：XX2）设设LT为配体的初始浓度，为配体的初始浓度，RT为受体的为受体的 初始浓度，则有：初始浓度，则有： L = LT RL R = RT RL 将上式代入将上式代入(1.1)式，经整理得式，经整理得： RL2-RLRT+LT+KD+RTLT=0 13授课：XX 饱和曲线的形状和饱和曲线的形状和KD有关（如图有关（如图1
8、）。图图1 KD对饱和曲线的影响对饱和曲线的影响 14授课：XX饱和曲线曲线的高度取决于饱和曲线曲线的高度取决于RT（如图（如图2）。）。 图图2 RT对饱和曲线影响对饱和曲线影响15授课：XX3. Scatchard作图作图由式（由式（1.1）整理可得）整理可得： KD RT-RLL RL 将上式整理可得将上式整理可得： RL = RT 1_ RL L KD KD 16授课：XX 以复合物浓度以复合物浓度RL为横坐标，以复合物浓度和游为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值离配体的浓度比值RL/L为纵坐标作图，即为为纵坐标作图，即为Scatchard作图。作图。 简单单位点系统简单单位点系
9、统Scatchard作图为一条直线，斜作图为一条直线，斜率为率为 -（1/KD），横轴截距为），横轴截距为RT，纵轴截距为，纵轴截距为RT/ KD（见图（见图3）。）。17授课：XX图图3 简单单位点系统简单单位点系统RBA的的Scatchard作图作图18授课：XX（二）非特异性结合（二）非特异性结合(non-specific binding，NSB)NSB 在在RBA系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。结合。NSB的特点的特点 亲和力小而
10、结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见图图4）。）。19授课：XX图图4 饱和曲线实验中饱和曲线实验中TB、SB和和NSB的关系的关系20授课：XX在在RBA的数据处理时，测得的总结合的放射性的数据处理时，测得的总结合的放射性(total binding，TB)，必须减去，必须减去NSB，才能得到特，才能得到特异性结合异性结合(specific binding，SB)的数据。的数据。21授课：XX四、四、RBA的基本方法的基本方法 离体离体RB
11、A的基本方法可概述如下：的基本方法可概述如下： 1. 制备待测受体的离体标本（组织切片、细胞悬液、细胞制备待测受体的离体标本（组织切片、细胞悬液、细胞组分的分离制备等）组分的分离制备等） 2. 加样（标本、放射性标记配基、缓冲液、非标记配基等）加样（标本、放射性标记配基、缓冲液、非标记配基等） 3. 温育温育 4. 分离结合和游离的放射性标记配体分离结合和游离的放射性标记配体 5. 测定结合部分的放射性测定结合部分的放射性 6. 数据处理数据处理22授课：XX 标记配体的基本要求标记配体的基本要求 1）高比活度）高比活度 2）亲和力高）亲和力高 3）特异性强）特异性强 4）放射化学纯度高）放射
12、化学纯度高23授课：XX五、定量五、定量RBA的数据处理的数据处理定量定量RBA主要是通过已知标记配体的量主要是通过已知标记配体的量和比活度，以及测得的样本的数据，应和比活度，以及测得的样本的数据，应用数学模型求出受体的有关参数如受体用数学模型求出受体的有关参数如受体密度密度RT、KD等。等。24授课：XX1. 单点法实验的数据处理单点法实验的数据处理通常是计算饱和区的受体密度，即受体最大结合容量通常是计算饱和区的受体密度，即受体最大结合容量（maximum binding capacity，Rmax）。）。受体密度的表示方式有以下几种：受体密度的表示方式有以下几种： 胞浆胞膜等的受体含量：胞
13、浆胞膜等的受体含量：fmol/mg蛋白；蛋白； 胞核的受体含量：胞核的受体含量：fmol/mgDNA； 完整细胞受体的含量：结合位点完整细胞受体的含量：结合位点/cell（site/cell）或）或 fmol/106细胞。细胞。25授课：XX单点法实验只适用于简单单位点系统，其计算公式单点法实验只适用于简单单位点系统，其计算公式如下：如下： RT = _RL的cpm_ 探测效率（）配体比活度标本的蛋白量（DNA量）或细胞数26授课：XX2. 简单单位点简单单位点RBA的多点法实验的多点法实验多点法实验可分为简单单位点和双位点多点法实验可分为简单单位点和双位点(多位点多位点)两两方面，它们又可各
14、自分为饱和曲线实验和竞争结方面，它们又可各自分为饱和曲线实验和竞争结合实验两类。合实验两类。 27授课：XX简单单位点饱和曲线的数据处理简单单位点饱和曲线的数据处理1. Scatchard模型模型 以复合物浓度以复合物浓度RL为横坐标，以复合物浓度和游为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值离配体的浓度比值RL/L为纵坐标作图，实际应为纵坐标作图，实际应用时，用时，RL/L的浓度比值由放射性的比值的浓度比值由放射性的比值B/F代代表。表。28授课：XX具体公式如下具体公式如下： ： RL = B = RT 1_ RL L F KD KD 以以B/F对对RL作图应为一条直线，斜率为作图应为一条
15、直线，斜率为-(1/KD)，直线与横轴的交点为直线与横轴的交点为RT值，与纵轴交点为值，与纵轴交点为RT/KD。29授课：XX2. 计算机曲线拟合计算机曲线拟合饱和曲线的直接表达式为：饱和曲线的直接表达式为： RL2-RLRT+LT+KD+RTLT=0其中，其中，LT是自变量（横坐标），是自变量（横坐标），RL是因变量（纵坐标），是因变量（纵坐标），RT和和KD是固定值。应用计算机以最小二乘法或稳健回归是固定值。应用计算机以最小二乘法或稳健回归法进行曲线拟合，可以得到法进行曲线拟合，可以得到RT和和KD的值。的值。30授课：XX应应 用用1. 放射受体显像：放射受体显像： 放射性配体与靶细胞上
16、受体结合，显像。放射性配体与靶细胞上受体结合，显像。31授课：XX32授课：XX33授课：XX34授课：XX2. 受体介导的靶向治疗受体介导的靶向治疗 放射性配体注入体内，到相应受体高密度的放射性配体注入体内，到相应受体高密度的靶器官，形成放射性配体靶器官，形成放射性配体-受体复合物，经受受体复合物，经受体介导作用将放射性复合物导入细胞，发挥体介导作用将放射性复合物导入细胞，发挥射线的辐射生物效应，以及利用配体射线的辐射生物效应，以及利用配体-受体的受体的载体作用，载上药物，进行靶向治疗。载体作用，载上药物，进行靶向治疗。35授课：XX复复 习习 题题1. 受体和配体结合的特点受体和配体结合的特点2. RBA的概念、原理的概念、原理36授课：XX参考文献参考文献 在线资料在线资料： http:/ you!38
