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1、实验实验五五培养细胞的形态观察和计数培养细胞的形态观察和计数 实验目实验目的的了解了解培养中培养中的动物细胞的的动物细胞的一一般形态般形态和生长状态和生长状态；掌握细掌握细胞计数的基本胞计数的基本方法方法。 1 1实验用品实验用品一、材料和标本 培养中的几种细胞。二、器材和仪器 倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管。三、试 剂 0.3% 台盼兰染液等2 2实验内容实验内容 一、培养细胞的形态观察一、培养细胞的形态观察( (一一) )原理原理体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞 , 如内皮细胞,叫贴壁型细胞。体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞-
2、并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如 HL-60, 叫做悬浮型细胞,这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。 3 34 45 56 67 7( (二二) ) 操作操作1.1.从从培培养养箱箱中中取取出出细细胞胞培培养养瓶瓶, ,注注意意观观察察细细胞胞培培养养液液的的颜颜色色和和清清澈澈度度。然然后后, ,将将细细胞胞培培养养瓶瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上。平稳地放在倒置显微镜载物台上。2.2.打打开开倒倒置置镜镜光光源源, , 通通过过双双筒筒目目镜镜将将视视野野调调到合适的亮度。到合适的亮度。3.3.调调节节载载物物台台的的高高度度进进行行对对焦焦, , 在在看看到到细细胞胞层
3、层之之后后, , 再再用用细细调调节节器器将将物物像像调调清清楚楚, , 注注意意观观察察细细胞胞的的轮轮廓廓、形形状状和和内内部部结结构构。在在观观察察时时，最经常使用的是最经常使用的是1010物镜。物镜。8 8（三）（三）结果结果贴贴壁壁细细胞胞一一般般有有两两种种形形状状, ,即即上上皮皮细细胞胞形形和和成成纤纤维维细细胞胞形形细细胞胞。上上皮皮细细胞胞形形细细胞胞呈呈扁扁平平的的不不规规则则多多角角形形, ,圆圆形形核核位位于于中中央央, ,生生长长时时常常彼彼此此紧紧密密连连接接成成单单层层细细胞胞片片, , 如如HeLa HeLa 细细胞胞。成成纤纤维维细细胞胞形形细细胞胞形形态态
4、与与体体内内成成纤纤维维细细胞胞形形态态相相似似, ,胞胞体体呈呈梭梭形形或或不不规规则则三三角角形形, ,中中央央有有圆圆核核, ,胞胞质质向向外外伸伸出出2 23 3个个长长短短不不同同的的突突起起, ,细细胞胞群群常常借借原原生生质质突突连连接接成成网网, ,如如 NIH3T3NIH3T3。9 9贴贴壁壁细细胞胞在在生生长长状状态态良良好好时时, ,细细胞胞内内颗颗粒粒少少, ,看看不不到到有有空空泡泡, ,细细胞胞边边缘缘清清楚楚, , 培培养养基基内内看看不不到到悬悬浮浮的的细细胞胞和和碎碎片片, ,培培养养液液清清澈澈透透明明, ,而而当当细细胞胞内内颗颗粒粒较较多多, ,透透明明
5、差差, ,空空泡泡多多时时, ,表表明明生生长长较较差差。当当瓶瓶内内培培养养基基混混浊浊时时，应应想想到到细细菌菌或或真真菌菌污污染染的的可能。可能。悬悬浮浮细细胞胞当当边边缘缘清清楚楚, ,透透明明发发亮亮时时, ,生生长长较好较好；反之反之, ,则则较差或已死亡。较差或已死亡。1010由于培养基内有由于培养基内有pHpH指示剂的存在指示剂的存在, ,因此它的因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色呈橙黄色，细胞一般生长状态较好细胞一般生长状态较好；呈淡黄呈淡黄色时色时, ,则可能是培养时间过长则可能是培养时间过长, ,营养不足营养不足,
6、 ,死死亡细胞过多亡细胞过多；如呈紫红色如呈紫红色, ,则可能是细胞生则可能是细胞生长状态不好长状态不好, ,或已死亡。或已死亡。一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的, ,它随营养、它随营养、pHpH、生长周期而改变生长周期而改变, ,但在比较但在比较稳定的条件下形态基本是稳定的条件下形态基本是一一致的致的。在贴壁细在贴壁细胞培养中胞培养中, ,镜下折光率高镜下折光率高, ,圆而发亮的一般被圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。特征。11111212二二、培养细胞的计数及活细胞的培养细胞的计数及
7、活细胞的鉴定鉴定（一）原理（一）原理细细胞胞生生物物学学的的实实验验中中, ,往往往往要要进进行行活活细细胞胞的的鉴鉴定定和和细细胞胞的的计计数数、调调整整细细胞胞的的密密度度, ,是是进进行行实实验验必必不可少的一种基本技能。不可少的一种基本技能。1313（二二）操作操作1.1.将将培培养养瓶瓶中中的的培培养养液液倒倒人人干干净净试试管管中中, ,向向培培养养瓶瓶中中加加入入 0.25%0.25%胰胰蛋蛋白白酶酶 /0.02% /0.02% EDTAEDTA混混合合消消化化液液1.0m1,1.0m1,静静置置3 35 5分分钟钟, ,待待见见到到细细胞胞变变圆圆, ,彼彼此不连接为止。此不连
8、接为止。2.2.将将试试管管中中的的培培养养液液倒倒回回培培养养瓶瓶中中, ,并轻轻进行吹打并轻轻进行吹打, ,制成细胞悬液。制成细胞悬液。14143.3.取取细细胞胞悬悬液液0.5m1,0.5m1,加加入入0.3%0.3%台台盼盼兰兰染染液液0.5ml0.5ml时时, ,混合后染色混合后染色 3 35 5 分钟。分钟。4.4.滴滴加加少少许许已已染染色色的的细细胞胞悬悬液液于于放放有有盖盖片片的的细细胞胞计计数数板板的的斜斜面面上上, ,使使液液体体自自然然充充满满计计数数板板小小室室。注注意意不不要要使使小小室室内内有有气泡产生气泡产生, ,否则要重新滴加。否则要重新滴加。在普通光镜在普通
9、光镜1010物镜下计数四个大格内物镜下计数四个大格内 ( (如图如图1 1， 2 2 示示) )的细胞数的细胞数, ,压线者数上压线者数上不数下不数下, ,数左不数右。数左不数右。15151616（三）结果（三）结果细胞浓度计数细胞浓度计数4 4大格细胞总数大格细胞总数大格细胞总数大格细胞总数10104 4稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数/4 = /4 = 细胞数细胞数细胞数细胞数mlml（4 4大大大大格格格格中中中中细细细细胞胞胞胞总总总总数数数数染染染染色色色色细细细细胞胞胞胞）10104 4稀稀稀稀释释释释倍倍倍倍数数数数/4 /4 = = 活细胞数活细胞数活细胞数活细胞数mlml悬液
10、悬液悬液悬液 注注注注 4 4大大大大格格格格中中中中的的的的每每每每一一一一大大大大格格格格体体体体积积积积为为为为0.l 0.l mmmm3 3。 1ml1ml1000010000大格，因此，大格，因此，大格，因此，大格，因此，1 1大格细胞数大格细胞数大格细胞数大格细胞数10104 4 细胞数细胞数细胞数细胞数mlml。 注注注注 染染染染色色色色标标标标本本本本在在在在1515分分分分钟钟钟钟内内内内检检检检查查查查计计计计数数数数，因因因因为为为为台台台台盼盼盼盼兰兰兰兰染染染染液液液液可可可可以以以以迅迅迅迅速速速速地地地地使使使使死死死死细细细细胞胞胞胞染染染染上上上上兰兰兰兰色色色色，延延延延长长长长时时时时间间间间活活活活细细细细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。 17171818作业1. 总结培养细胞生长观察方法。总结培养细胞生长观察方法。2. 将你计数的每毫升细胞悬液将你计数的每毫升细胞悬液中的细胞总数，死、活细胞的中的细胞总数，死、活细胞的百分比例计算出来。百分比例计算出来。 1919
