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1、环境样品中环境样品中DNA的分离的分离纯化纯化和文库构建和文库构建制作：林存刚制作：林存刚专业：微生物专业：微生物学号：学号：2003028环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚基因文库基因文库gene library：将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小的片段，并进行克隆化，包括其中每一种片段的汇总，称为基因文库。为防止用一种限制酶可能切断某个基因，应该用不同限制酶切割建立基因文库。对于一个大的基因组，通常这种基因文库是由霰弹法克隆构建的。根据基因文库的组成，可分为基因组文库和cDNA文库等。基因文库可用于研究基因的结构功能和筛选基因工程的目的基因。 环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚
2、分离纯化和文库构建分离纯化和文库构建q从分子水平上研究微生物的意义q分离纯化q文库构建q研究进展 环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚从分子水平上研究微生物的意义从分子水平上研究微生物的意义l 传统微生物学发展l 微生物资源开发利用l 现代生物技术发展 BACK环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚分分离离纯纯化化样品采集和材料准备分离和纯化DNA浓度测定 BACK环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚样品研磨冻融抽提热处理离心抽提去除抑制剂离心TE溶解电洗脱分离纯化酶切要求环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚浓度测定浓度测定粗制DNA浓度测定： 已知DNA的酶
3、切产物与待测DNA一起进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，比较荧光亮度，推测DNA的浓度。纯化DNA的浓度测定： 利用DyNA Quant 200 荧光仪测定。 返回环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚文库构建和分析文库构建和分析v理论基础v实施方法v评估分析 环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚文文库库构构建建EcoRI酶切位点富含A/T(或PstI的酶切位点富含G/C），可以用来酶切建库。载体和酶切片段都用同一种酶酶切后，才会具有互补位点，才能连接。噬菌体菌落更容易保存。 环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚实实施施方方法法vEcoRI或PstI对纯化DNA进行酶切v琼脂糖电泳分离酶切产物v
4、DEAE纤维素滤纸回收38kbEcoRI或PstI酶切段v载体处理（经EcoRI或PstI酶切和去磷酸化处理）v连接v连接产物转化大肠杆菌（病毒转染或氯化钙法）v蓝白斑筛选重组子v培养保存 返回环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚策略策略环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚实实施施方方法法环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚评评估估分分析析l对阳性克隆插入片段进行单向测序l去载体部分处理l开放阅读框预测lBLAST同源性检索分析l推测开放阅读框可能编码的功能 BACK环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚开放阅读框开放阅读框 开放阅读框（ORF,open reading frame）是一个没有终
5、止编码的密码子序列。在原核基因中，编码区是一个单独的ORF；而真核基因的编码区通常包含几个不相连的ORF（被非编码序列即内含子所分隔）。每条双链DNA有6个潜在的读框（reading frames）或称相位（phase）：一条链沿5-3方向有3个读框（forward），称为正向读框；则其互补链沿5-3方向的3个读框称为反向读框（reverse）。 返回环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚BLAST软件软件BLAST对一条或多条序列, 在一个或多个核酸或蛋白序库中进行比对。同时还能发现具有缺口的可能比对上的序列。共有五种：1. （核酸序列到核酸库中的一种查询，库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。）2. 3. 4. 5. BACK环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚蓝蓝白白筛筛选选环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚相关研究进展相关研究进展通过设计PCR引物直接从环境样品DNA中扩增得到已知蛋白类似物的基因。用分子克隆方法从环境样品中直接得到新酶。本实验方法适用于获得对分子操作敏感且能用来高效建库的基因DNA。可以获得相关的新的外源序列。从基因文库中获得完整基因。基于序列同源性或酶活性筛选方法寻找目的基因。 环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚
