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1、大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定水、环境中微生物的测定水、环境中微生物的测定水、环境中微生物的测定水、环境中微生物的测定林亲雄林亲雄 阎春兰阎春兰 李晓华李晓华了解光电比浊计数法的原理。了解光电比浊计数法的原理。 学习、掌握光电比浊计数的操作方法。学习、掌握光电比浊计数的操作方法。通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线。征和规律，绘制生长曲线。 实验实验31 31 大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定一、实验目的一、实验目的生长曲线生长曲线 将将少少量量纯纯种种单单细细胞
2、胞微微生生物物接接种种到到定定量量的的液液体体培培养养基基中中，定定时时取取样样测测定定细细胞胞数数量量，以以培培养养时时间间为为横横坐坐标标，以以菌菌数数为为纵纵坐坐标标作作图图，得得到到一一条条反反映映单单细细胞胞微微生生物物在在整整个个培培养期间菌数变化规律的曲线。养期间菌数变化规律的曲线。二、实验原理二、实验原理一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期稳定期和衰亡期四个时期微生物数量的测定方法微生物数量的测定方法稀释平板计数法稀释平板计数法显微镜直接计数法显微镜直接计数法最大概率法最大概率法光电比浊法光电比浊法稀释平板计数法稀释
3、平板计数法对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。优点：优点：活菌计数方法，对设备要求不高。活菌计数方法，对设备要求不高。缺点：缺点：操作复杂。操作复杂。显微镜直接计数法显微镜直接计数法使用血球计数板在显微镜下直接计数。使用血球计数板在显微镜下直接计数。优点：优点：操作简便，计数直观。操作简便，计数直观。缺点：缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。计数结果为活细菌和死菌体的总和。最大概率法最大概率法 待待测测菌菌液液经经十十倍倍系系列列稀稀释释，每每稀稀释释度度做做3-53-5个个重重复复，经经培培养养后后，检检查查细细菌菌的的生生长长，以以有有细细菌菌生生长长
4、的的最最后后三三个个稀稀释释度度的的管管数数作作数数量量指指标标，由由数数理理统统计计表表查查出出近近似似值值，再再乘乘以以数数量量指指标标第第一一位的稀释倍数，即为原菌液中的菌数。位的稀释倍数，即为原菌液中的菌数。最大概率法最大概率法例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下：例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下：稀释度：稀释度： 10 10-3-3 10 10-4-4 10 10-5-5 10 10-6-6 10 10-7-7 10 10-8-8重复数：重复数： 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5有菌生长管数：有菌生长管数： 5 5 5 4 1 0 5 5 5 4 1 0根据上述
5、结果，数量指标为根据上述结果，数量指标为“541541”，查表得近似值为，查表得近似值为1717，乘，乘以第一位数的稀释倍数，得出原始培养物的活菌数以第一位数的稀释倍数，得出原始培养物的活菌数= =171017105 5个个优点：优点：活菌计数，适用于特殊细菌。活菌计数，适用于特殊细菌。缺点：缺点：计数结果为概值。计数结果为概值。光电比浊法光电比浊法光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所
6、吸收的光线越多。测定时所吸收的光线越多。优点：优点：简便快速，适合于自动控制。简便快速，适合于自动控制。 缺点：缺点：测定结果受培养液成分影响；某些样品测定结果受培养液成分影响；某些样品 样品不适合用此法。样品不适合用此法。 菌种菌种 培养不同时段的大肠杆菌。培养不同时段的大肠杆菌。仪器或其他用具仪器或其他用具 分光光度计，比色皿等。分光光度计，比色皿等。三、实验器材三、实验器材开开电电源源，仪仪器器预预热热20 20 minmin，将将波波长长调调至至600 600 nmnm处。处。打打开开样样品品室室，将将挡挡光光体体插插入入比比色色皿皿架架，将将其推或拉入光路。其推或拉入光路。盖盖好好样
7、样品品室室盖盖，在在T T MODEMODE下下，按按0%T0%T键键调调零零透射比。透射比。取出挡光体，按取出挡光体，按100%T/OA100%T/OA键调键调100%100%透射比。透射比。四、实验步骤四、实验步骤1.1.样品测试前的调试样品测试前的调试2.2.样品测定样品测定将将参参比比溶溶液液（未未接接种种的的LBLB液液体体培培养养基基）以以及及被测溶液倒入比色皿中。被测溶液倒入比色皿中。打打开开样样品品室室盖盖，将将参参比比溶溶液液放放在在样样品品架架的的第第一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。将参比溶液推入光路，按将参比溶液推入光路，按
8、100%T/OA100%T/OA键调满度。键调满度。按按MODEMODE，将将测测试试方方式式调调至至吸吸光光度度方方式式（A A）。此时此时, ,显示器显示显示器显示“0.000”0.000”。将将被被测测溶溶液液推推入入光光路路，显显示示器器显显示示为为被被测测样样品的吸光值。品的吸光值。 在在600 600 nmnm波波长长下下，用用未未接接种种的的LBLB液液体体培培养养基基作作空空白白对对照照，分分别别对对培培养养了了0 0、4 4、8 8、1212、1616和和20 20 h h的的大大肠肠杆杆菌菌培培养养液液，进进行行光光电电比比浊浊测测定定。对对于于高高浓浓度度的的大大肠肠杆杆
9、菌菌培培养养液液, ,要要用用未未接接种种的的LBLB培培养养基基进进行行稀稀释释，使使其其吸吸光光值值在在0.1-0.650.1-0.65范围内。范围内。 比比色色皿皿经经蒸蒸馏馏水水清清洗洗后后，必必须须经经待待测测样样品品润润洗洗。比比色色皿皿的的毛毛面面用用吸吸水水纸纸擦擦干干，而而光光面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。 比色皿之间吸光度进行比较。比色皿之间吸光度进行比较。四、实验结果四、实验结果 记录不同记录不同大肠杆菌培养液大肠杆菌培养液的的ODOD600600值，值，并绘制大肠杆菌的生长曲线。并绘制大肠杆菌的生长曲线。 培养时间培养时间培养时
10、间培养时间（h h） 4 4 8 8 12 12 16 16 20 20 24 24光密度值光密度值光密度值光密度值ODOD600600五、思考题五、思考题光电比浊计数的原理是什么？这种计数法有何光电比浊计数的原理是什么？这种计数法有何优缺点？优缺点？如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？两者各有什么优缺点？什么不同？两者各有什么优缺点？ 比较不同场所和不同条件下细菌的数量和类比较不同场所和不同条件下细菌的数量和类型。型。观察不同类群微生物的菌落形态特征。观察不同类群微生物的菌落形态特征。 体会无菌操作的重要性。体会无菌操作的重要性。掌握水和
11、环境中微生物的测定方法。掌握水和环境中微生物的测定方法。检测污染水域微生物的类型和数量。检测污染水域微生物的类型和数量。 实验实验67 67 水、环境中微生物的测定水、环境中微生物的测定一、实验目的一、实验目的应用平板菌落计数技术测定污染水的细菌应用平板菌落计数技术测定污染水的细菌总数。由于细菌种类繁多，不可能找到一总数。由于细菌种类繁多，不可能找到一种培养基在一种条件下，使所有的细菌均种培养基在一种条件下，使所有的细菌均能生长繁殖。因此，计算出来的细菌总数能生长繁殖。因此，计算出来的细菌总数仅是一种近似值。仅是一种近似值。利用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基可以大利用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基可以
12、大致测定不同环境中存在的微生物。致测定不同环境中存在的微生物。二、实验原理二、实验原理样品的采取样品的采取 自来水自来水自来水自来水 取自自来水管道。取自自来水管道。取自自来水管道。取自自来水管道。 橙汁橙汁橙汁橙汁 购于超市。购于超市。购于超市。购于超市。 口腔、人民币、门把手和实验环境中的微生物。口腔、人民币、门把手和实验环境中的微生物。口腔、人民币、门把手和实验环境中的微生物。口腔、人民币、门把手和实验环境中的微生物。 南湖水南湖水南湖水南湖水 距水面距水面距水面距水面10-15 cm10-15 cm10-15 cm10-15 cm的深层水样。的深层水样。的深层水样。的深层水样。培养基培
13、养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 。仪器或其他用具仪器或其他用具 灭菌培养皿，无菌枪头，涂棒等。灭菌培养皿，无菌枪头，涂棒等。灭菌培养皿，无菌枪头，涂棒等。灭菌培养皿，无菌枪头，涂棒等。三、实验器材三、实验器材 无无菌菌操操作作采采用用1010-1-1， 1010-2-2 ， 1010-3-3稀稀释释液液涂涂布布牛牛肉肉膏膏蛋白胨平板蛋白胨平板; ;每个稀释度每个稀释度2 2个重复。个重复。N-乙酰葡糖胺四、实验步骤四、实验步骤1.1.南湖水中微生物的测定南湖水中微生物的测定每个培养皿每个培养皿加加0.1ml 0.1ml 稀稀释液释
14、液(LTA)2.2.口腔、人民币和门把手口腔、人民币和门把手微生物的测定微生物的测定 用棉签分别从牙周、人民币纸币和门把手表面用棉签分别从牙周、人民币纸币和门把手表面挑取微生物，然后放入装有挑取微生物，然后放入装有0.5 ml0.5 ml无菌水的无菌水的EPEP管中，管中，颠倒均匀后，用移液器全部吸入牛肉膏蛋白胨平板颠倒均匀后，用移液器全部吸入牛肉膏蛋白胨平板中，涂布均匀。中，涂布均匀。3.3.实验室空气中实验室空气中微生物的测定微生物的测定 将将牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨平平板板盖盖揭揭开开，分分别别置置实实验验台台1010，2020，3030，4040，5050，60 60 minmin后后
15、，盖盖上上皿皿盖盖，倒倒置置培培养。养。4.4.自来水自来水、橙汁、橙汁中中微生物的测定微生物的测定 取取1 1 mlml涂涂布布牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨平平板板。自自自自来来来来水水水水用用无无菌菌三角瓶收集。三角瓶收集。四、四、实验结果实验结果计算每计算每mlml南湖水中含有微生物的数量。南湖水中含有微生物的数量。你你所所测测定定的的环环境境中中微微生生物物的的数数量量和和种种类类；并并试试着着分分别别记记录录每每种种细细菌菌的的大大小小、形形态态、干干湿、透明度、颜色以及边缘等特征。湿、透明度、颜色以及边缘等特征。观测实验结果时间观测实验结果时间？ 名名名名 称称称称 南南南南 湖湖湖湖
16、 水水水水 自来水自来水自来水自来水（个（个（个（个/ /mLmL）口口口口 腔腔腔腔（个（个（个（个/ /cmcm2 2）人民币人民币人民币人民币（个（个（个（个/ /cmcm2 2）门把手门把手门把手门把手（个（个（个（个/ /cmcm2 2） 空空空空 气气气气（分钟）（分钟）（分钟）（分钟） （个（个（个（个）1010-1-11010-2-21010-3-3总数总数总数总数 数数数数 量量量量 形形形形 态态态态五、思考题五、思考题你所测定的南湖水的污染程度如何？你所测定的南湖水的污染程度如何？通过本次实验，在防止培养物的污染与防止通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到了什么？有什么细菌的扩散方面，你学到了什么？有什么体会？体会？本次实验安排本次实验安排比浊法测定大肠杆菌生长曲线。比浊法测定大肠杆菌生长曲线。倒牛肉膏蛋白胨平板倒牛肉膏蛋白胨平板1212个。个。南湖水稀释分离涂布南湖水稀释分离涂布(6(6皿皿) )。口口腔腔、人人民民币币、门门把把手手、空空气气（1010，2020，3030，4040，5050，60 60 minmin）、自自来来水水和和橙橙汁微生物的测定。（汁微生物的测定。（1 1种种/ /人）人）每组每组6 6人人本次实验完本次实验完
