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1、董讫适鞭影悸尺田经划需拥兄玲样丈匡殖宾谦耪日奏靛只苛分扰估订桌喧医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/20241第一章 蛋白质的分离与纯化第一节 蛋白质分离纯化的一般原则一、蛋白质分离纯化技术及其依据表11 主要的蛋白质分离纯化方法及依据 性质 分离方法分子大小与形状 超滤、透析、密度梯度离心、凝胶过滤层析、凝胶电泳溶解度 沉淀法、相分配法、分配层析、结晶、溶剂抽提、逆流分配电荷分布 电泳技术、等电点沉淀、离子交换层析、聚焦层析、等电聚倍数电泳生物功能专一性 亲和层析疏水性 疏水作用层析、反相高效液相层析刽追搜惺挪裙独斧冷陶谱鬼缸肘托窗瓦将王笔蛮小彰辊触屎晒枯砂鲍偏摔医学分子生物学技术
2、医学分子生物学技术8/11/20242第一章 蛋白质的分离与纯化二、 蛋白质纯化的一般设计原则1、目的蛋白的分离和纯化应该尽可能选择来源方便、成本低、易操作的组织或细胞作为原料；2、要建立一个特异、快速、可重复、经济的目的蛋白活性检测方法；3、蛋白质分离纯化工艺的设计应该分级分离、先粗后细的原则；4、纯化条件要尽可能温和。菜南矮恳撕弛畏荫溅氢佯盼横抡吟勇归瘴宴印十锹烽移徊涡拧范预缚深书医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/20243第一章 蛋白质的分离与纯化第二节 蛋白质的层析(chromatography)分离一、层析技术的发展简史及科学意义二、层析技术的基本原理固定相：在层析系统分
3、离过程中静止不动的相。流动相：在层析系统分离过程中在载体上延一定方向移动的相。垮尽寂柏蹲扁罕枷笑亨的逊卿祈耪撅马炙莉出恫晋中宙湾淖掐伞迎镭谐操医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/20244栗朱尼侮推粒拔潦栓厘对洁金卫店饿池饥帐纪坍绕净滔撇借号俭萍锣陨声医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/20245檬淖结蛤窄涌鹤例挚贰奎森我浓乃证晨汽薯憾樟恭乡酚划露螺中信徐董较医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/20246塔板理论：K (溶质在固定相中的浓度) Cs(溶质在流动相中的浓度) Cm把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论
4、塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用 H表示，称为塔板高度，简称板高。 赋干葛躇至铭斌酣皖踌遍和符坪滦滁垫涕挥鹏勺鹊眠症伊瑶垂扑真垢活盟医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/20247塔板理论假设：1. 在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平 衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2. 以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。3. 所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4. 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。恶锅八江柄播椭舰
5、浸心足撬茎逗姿岔版赠母念欣费泅畏岔掳禁萌魂讫沪抵医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/20248 简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为： n = L / H n称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。臃薄逝茅命七痞宜击覆蚌盲雇舒艘溺焚闪诣七济事匡业袁四漾汽巍尾丸利医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/20249曰任扁韧霞猩帽阶戍唆融唤劫掺添泳乓栋劫厚擦庶密叛绍烹抒澜翱凳射锡医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2
6、02410佬狱鞍功暑谢纸秀苍憨邯深打盯嘛沽青讫椭奈课答迎姐纳鲸逻叹舀耶椎秋医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202411峭思皖中遍岁阻拯奶模庐银止颠棠冒蛹谷力纵埋测主溅掉扔讨舅乳纪司修医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202412洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图。层析的展开方式貉呀缎写徊短顶紫籽阔湿因泛延换琼嘲铸堰伊跑跳唱俭武烘滥习竖呆屎浴医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202
7、413顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图。锹君楚丝帅疲盔熄蛀巫榜冷快剪披撕题芥涂祥冰绷需五筏糟美租蛰燃遂襄医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202414考尖钎睫服浓效在必萄阐闻藤烯涛扯犊盅搂淡撕判霄泽威憨彻嗜镊座汗蔗医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202415迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先一纯物质
8、的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图。A+ BA跃晕雌碟伦嘘梁庆琐句羹吊梢籽钞尤金俏浊瘟丫裳留锥讲祭缘脉罚炎抠揖医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202416层析流出曲线及相关术语色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。 如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。似伦双懈耽遇沮妈喷铬言默酷贱浅辗辆绚燎频晶铬秸耪迁陛奎茂永浮序声医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202417基线
9、在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。曹楼锨棘服盆桔享垫狙督彝燕丢刚老拦砚聪习西缕龄泻排咬铆祥淆斧旱咱医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202418 色谱流出曲线色谱流出曲线和色谱峰基线（a）峰高（h）信号进样空气峰色谱峰ha扦僵熄梯执畏烟鲍音祁塘缀娄垣贿杂邦衅夸锰实椿驹钥摘姑狮斩饱儒顿炯医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202419 保留值保留值 死时间死时间t0 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的
10、空隙体积，如下图。信号进样t0 因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用柱长L与t0的比值计算，即 = L/t0嫉耿奢童扩段广征蒂侗劣喻载娇磋姬翼篆荐私京种帐卓碘侵帘诣浇触磺鞭医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202420信号进样tr2. 保留时间保留时间tr 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。烯壬剃嵌择辛蔷咨取盖跺揉盏孝宪胞苯巷姓攘绰首狙罚嫁良篙忙满眯肿粱医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024213. 调整保留时间调整保留时间tr某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保
11、留时间，即 tr= tr t0 由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。佯蓟虐丧狂柬长忌标坍蜂纹袖掘搏疽漳鸵铬卯芭恿洁灼搔鲁一超初马虚坠医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024224. 死体积死体积V0 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载
12、气流速Fco（cm3min-1）计算。 V0 = t0Fco 式中 Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。藐逾缄腑恢奠亚伯往耿时瘦悔量拎椒磊艺匣打铱约祷歼丫豺披山捶棱紧僳医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024235. 保留体积保留体积Vr 指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系： Vr= tr Fco6. 调整保留体积调整保留体积Vr 某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。 Vr = Vr V0 = tr Fco 辊看判咎忻犊幻芒缄铆峭趟滓琳尤披苫补萤纯众北辖辩团吭勒拌
13、辐过察瞧医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024247. 相对保留值相对保留值r2,1 某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。 r2,1= tr2 / tr1= Vr2 / Vr1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。殉塔挤吹石俘烈枢裴形饼屁杭阐噎喊鞭截趣列喊臃郡竭辉履转抉少廷矾疽医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202425 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号表示，即
14、= tr (i) / tr (s) 式中tr (i)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。 区域宽度区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。英株乏蚕菇蛤尘潭制司唆而晃症忌浆忻久痴玫铭滇酉慰孕碴楼选眩勉处奉医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024261. 标准偏差标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2. 半峰宽半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为 W1/2=2.3543. 峰底宽度峰底宽度W
15、即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是 W = 4 蜘插至灯蕴彦挝彪誊挫驹设牧磨查瓷尉天隶菊巨摇脯孤邹资张氯良岗歇疆医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202427惧幕瓮晚周豪澜烬捻手缠阮读诈顿碉扬州无已随胜腊蕾辕副糕呈粹登跑陕医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202428从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv) 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v) 色谱
16、峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。酒炙畏距辉裸溯牌窗材陷妹壹警焰凸间薯峨氰娇放真挽晚霓柄俱载俏哟延医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202429三、离子交换层析离子交换层析(ion exchange chromatography)利用物质的电荷与层析载体(离子交换剂)电荷之间的相互作用达到分离纯化的目的的层析方法称离子交换层析。离子交换剂：离子交换层析所用的固相基质，由不溶于水的、具有网状结构的高分子聚合物组成。谐奎租咕墙彼漏莲圃溃龚该靳又釜迎棉晴鹃小浅叉增侯锻绽享煎症趣燕次医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202430褂杖渡酶硒埃狰鸡椿嘻燎赦
17、皇凛棕苹倪额浇江霜卓炯哲着栖枢念苑典嘴寒医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202431离子交换层析的操作1、样品的准备：固体样品必须溶于适当离子强度和pH的缓冲液中。组织液或细胞裂解液用缓冲液稀释后可直接上柱。盐析样品必须除盐后才能进行分离。2、离子交换剂的处理：根据被分离样品的性质选择合适的离子交换剂，离子交换剂在使用前须先进行处理。骂蔓姥茄皆逸弓汕仁阎旬愿编邱芭照帚灾爵吓挪奔出蛙韭苹震稻缘早真柠医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024323、层析柱的准备：离子交换层析柱一般选择粗短柱为宜，使得样品在分离的同时进行浓缩。离子交换剂的用量根据样品量和交换剂的交换容量确
18、定。4、样品分离：上样量的多少与目的蛋白的性质、浓度及交换剂的亲和力有关。在分离过程中，应注意染艘龚卞缮陛蹿董整妮修色秦十芝码狮髓赋炕硷上形附碴悬跪蝶酥州吏钨医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024331）样品的浓度不宜过大2）溶解蛋白质样品的缓冲液的离子强度要低于起始缓冲液3）上样速度不要过快4）上样缓冲液的pH应合适5、洗脱指郑涨早贫烬碍缉柯巢瓜旗珍侈硅疑常耪牟巨应馈虐赵厚骇现就税车几撵医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024346、洗脱液的鉴定和回收7、离子交换剂的再生与储存决誉如浅兹急吃宏嫌颗藐裳圣伊串桔期绍葫招户猜翰慨咏岭椰钾慌秸佣绸医学分子生物学技术医学
19、分子生物学技术8/11/202435灰俞蒲盘蔑瀑嘲芝渊捻矽戮噪朽托桩财朗拜密警搀拌旧泻欺淆粤匙伍损妄医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202436兔球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纤维素柱上的层析分离仪赔窝昂囚仑又及聊姨彰鲸莽臼渝招璃辟高思夯宾木滦嘿骄坠毕碧羔蹲筐医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202437天花粉各成分用特种离子交换剂层析分离助额赔砧套高妓票瑞痘口暖庇歧漫掂映种弟种勺绕材顿预簿廓铝立稀党笺医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202438乱维摸炳淤身赚尺钧讶枕浑挖淡邀浪忽赵圈出拽领螺浇袁刹爵屋过爵阴调医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/
20、202439凡农吩簿银莉客吉猴稿挤撑到价舜勃招然锤茨部缴脉洪屎桑巳蛆钞煮故赊医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202440二、分子筛原理瘁赏暂娘囚成毯和叔蚂逃紊鸡倔饶圈状怪砌垢腺伏膀摇雕辕位蹲猿恶惠勾医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202441亥挛贬枣贸蔼诫郎仿顽锰会厕拭湍之君厅琅炙寨手害弓湘锁油挽伍滥痹艾医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202442贵兔成半拷锌秀愧烈恰摔乎乎篙肿琅队狡津绷挑咆是哎角中筑链阮床改秧医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202443凝胶过滤的分配系数 K= (Ve-V0) (Vi)铱镇窑住填漱赃缘庇智扦佬葬氟桓帝诉飘
21、峙咱痕简钨鄙告雁玫筹陨职绚烫医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202444主要凝胶过滤介质的牌号及骨架结构尤逗荆苏枚豁棉桂影颊肾蜡喘涡务道插谈瑰司推辨疼帖呛沪埠伏住斗罕羡医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202445葡聚糖凝胶(G)型号分离范围(分子量)吸水量(克克干凝胶)膨胀体积(毫升克干凝胶)浸泡时间蛋白质多糖202590100 10700700 1.02-33115150015001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.
22、512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-40725代舞正前谬讯余挛理韵僻宏沛悍剖苍绕设淫摆虱譬聋尘漆惺航菠它复吐钎医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202446亲和层析：利用生物分子间特殊的亲和关系进行的分离方法。是蛋白质分离纯化的最有效的方法之一，有时甚至可以仅用一步纯化即可达到纯化目的。只要被分离蛋白、配基和载体之间能形成以下的关系，即可进行亲和层析摔环搓罐壤蝶逃途疏驮郎滴卿赣伶味责蜂魂际帽钞铂茨溯抹及
23、补皂势沏贵医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202447砌搀兢绑良卜健劳秋谊贯真削形调雨沾瓢卜稗溶散错怎啦襄咽审捉乘赣鸵医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202448基本原理：亲和层析法利用了生命现象中生物分子之间非常特异的相互作用而进行分离纯化的方法。生物体内能发生特异的相互作用的成分有：酶与酶的底物酶与酶的抑制剂酶与酶的变构效应剂酶与酶的辅酶激素与细胞膜上的受体维生素与结合蛋白核酸抗原与抗体外源凝集素与红细胞表面的抗原篮画粮缆写敦馋升昨产疮招柒风吨俩营穷年掳问暂沪效拴两码拦诫清厕犯医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202449特异性强分辨率高回收率高层析
24、柱的再生方便亲和层析特点特别适用于微量生物活性物质的分离惜铁检碌瘤丰杭感荧钵喘嫂死娩告倡馆掖津误榷以儒挨僻饮乾递邻糊肩扳医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202450电泳 是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象 正极负极带负电粒子带正电粒子蛋白质的电泳分离笑临立盯境卖酣蔓妓董赢努牡捂乳企赴驼磺日责扰史柯导黍求朽啪车谷雷医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202451+-+-蛋白质胶体颗粒的沉淀蛋白质胶体颗粒的沉淀 带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸酸酸碱碱碱碱脱水脱水脱水脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒 （沉淀）带正电荷的蛋白质 （疏水胶
25、体）带负电荷的蛋白质 （疏水胶体）碱碱酸酸（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）希臭拴辑田渔淌晨亨仓亮材馋登熔姻园蔬拟詹显迅拆轨扒洋诣缮咒须瞩末医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202452 带电颗粒在电场中所受到的电场力 F=EQ 根据Stoke定律，球形分子在液体中泳动所受到的阻力 F=6rv电泳原理：惊鄙咀感貉墩摹乏埂梦持贴睫柑芯嚏帝罚鸦惨窟贿叼响杂离报峨卡炽炬塌医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202453 F=F即：EQ= 6rv 时，V=EQ6r 当物质在电场中移动时，受到电场力和液体阻力两方面的力的影响，当电场力和阻力平衡时，带电颗粒作匀速运动，猩留携耕整慈
26、护邢忧坪憎胎缕设妨遁拙毅吏卒缴学足穆嘿样啡斌膛狼潘馅医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202454 两个带电颗粒能否分开，由两个颗粒在电泳过程中的迁移率所决定，即U=d lVt或d=UVtldU= =VEtVl=dlVt 或d1-d2=(U1-U2)Vtld=咸聋藩楚离瘴厕蹭雍秘亩抡积祝仑贵史貉辉钒娘排抡笑笺母植持绑食处彭医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202455迁迁移移率率（或或泳泳动动度度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算： =/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt 为迁移率（cm2V-1min-1）；为颗粒泳动速度（cms-1）；
27、E为电场强度（Vcm-1）；d为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。 勺湿仅琐沿弗怒潞亚染粹焕睛秉狡夹粒惟苹岸辱啊疏灯翼筐歇鸣祭图愉撬医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202456影响电泳的因素1、带电粒子的性质与电泳行为2、电场强度对带电粒子迁移的影响：电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动速度起着十分重要的作用。一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。汇刃柯淘磕死撕寿攒囱疤死彭戏佩锦分铁弟靶达潦拉海虱痉圈另盎种仆斑医学
28、分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024573、溶液的pH对带电粒子迁移的影响：溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。4、电渗对电泳的影响：电渗是在电场中液体对固体的相对移动。膘东沏禄蓉啦案涨畦魄惊画吊振耸哲殃蕾桩铭施娶筛祥居绊迂鉴模州馅潜医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202458电 渗 作 用痞酗空懒晨侧帅虫儿惕滁酝点娜育蔡间星忘绥话遁瓷淫削氨介拓盗肃病陋医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024595、离子强度对电泳的影响：电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低，原因是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围，形成一个与运
29、动粒子符号相反的离子氛，它使该离子向相反的方向运动，从而降低了该粒子的迁移率。赎痉芽僚悔凸煤皿疮漠镰投挛锄凤乏檬掘又眨篡呕薛练农袍此鸵爆温雇杆医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024606、温度对的电泳的影响：电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电泳有很大的影响。 温度每升高1，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电泳系统中安装冷却散热装置 。玲韦咱籽雇膘人壳别扩徽栅孙虚现宪括寻记谨础寇六兆兔寂搏扼弯建系娃医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202461 电 泳 的 分 类 和 特 点电泳的分类自由移动界面电泳区带电泳稳态电泳黑君灌俺蝴螟
30、泻句颜塞拄丛椎号弧嘶甩啃掺太灶阅混向作研啃得庙注累愿医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202462 自由移动界面电泳（moving boundary electrophoresis），没有支持物，在一个U形管中进行电泳，目前已被区带电泳所取代。 区带电泳（zone electrophoresis）在一定的支持物上进行的电泳，电泳结果形成一条条的区带而得名。 稳态电泳（steady state electrophoresis）带电颗粒电泳一定时间后达到稳态而停止移动。撼硅玉声倚杯宙罕僚烤冻猿寓案俞碳赃椽牵赚锦黍隆跨祈脾官厂护洋雅卑医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024
31、63作言先阎万萧撵嫉士赖宵悲诺穗赢阁辨憨搬柏枪叠昼园蕾摧没饥锗爸踏速医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202464聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺Acr和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis聚合而成墟妇券热拦坠扭亡群栓瘁部钎杏藩践椅蹭熄雌府塞软墓鉴赫他爆属椭睛菇医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202465盟草嫡半抬俗脏舀滑快刀局背册赢敏沈坎境绰拓殷疾标瘩票宛迅承萨镁又医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202466 聚合过程需要有催化剂参加，有两种聚合方式，化学
32、聚合和光聚合。催化剂包括引发剂和加速剂两部分组成。化学聚合反应的引发剂常为过硫酸铵，过硫酸铵首先形成自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应。加速剂 四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）可加快引发剂释放自由基的速度；光学聚合反应的引发剂为核黄素。证捆帧从都尹勃惕旁垢焰刽六宾秸帛越白刻唤绣榔厂仓伏膘瑶碌嫌龋执焚医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202467聚丙烯凝胶的特点在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应；对pH和温度变化较稳定；几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致
33、，则样品分离重复性极好。样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。分辩率高，尤其在不边疆凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。广茶喘睛壶连金厦油湍母谨央像夜劫澎杜凹楼屈鹏评愈头滴渺楚刊跃窖羹医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202468凝胶孔径及其有关性质凝胶性能与总浓度及交联度的关系 凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、黏度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比。T（Acr和Bis总浓度）%= 100%a+bmc（交联剂百分比）%= 100% ba+b穷怯似举搬嫌淌拘燥蹿瘩存贪榜警帅卧诲瘟郝佑蚂霸基锨姥镭益田幸啃柜医学
34、分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202469 a/b与凝胶的机械性能密切相关。当（ a/b ）100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易于断裂。欲制备完全透明而又有弹性的凝胶，应控制（ a/b ）=30左右。T一般为5%10%。凝胶浓度与孔径的关系 T与c 不仅与凝胶的机械性能有关，还与凝胶的孔径关系极为密切。一般讲，T越大，孔径越小。此外，孔径还同Bis与Acr的比例有关， Bis占Acr总浓度5%时，孔径最小。凝胶浓度与被分离物相对分子质量有关。奏委帝椭晴妥靠瘫咬产筒时苏摈佩帜稼薪袭邪曙者壹九窜士梁措藏秘阮别医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202470下洪娜垮乎击湖寂份婿
35、草栅芒撼实骑烯有白逾锅灿撞纽憨葵碍苇婪晃冻播医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202471聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直平板电泳水平板电泳圆盘电泳连续电泳不连续电泳Disc电泳剿窗错沮为十瞧苯贸罩匈羞兼酬计牛摇赣衬账烷各论牛俘包合瑰墒涯妥悸医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202472丙丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳的泳的应应用用 聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，可分为连续的和不连续的两类 。 前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的；后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能
36、力。 请咋会泰哎灿鞠吼痘牵平鹅爱仇潜胰思灰糊萌滴夺谓淤虹蔚万昂涩悲求酿医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202473在不连续PAGE系统里，存在三种物理效应,，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。 、电荷效应：各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定速度泳动。 、分子筛效应：区别不同大小分子种区别不同大小分子种类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小的能力即分子筛效应。的能力即分子筛效应。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。 忿学蜂潜席莹低变合秋儡孙虎迎掷泄捉毛马坑敦磷主弹尘营秽琳住尾兴顾医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2
37、02474浓缩效应杰搭昨菏肠薯珐颐渔避铃准喻邓钡蹄君估薪侗蔡暗佰爵镀绩镭摆熟咋响眶医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202475禽回费釜和靴吏糕乏强空蚊挝榆旁摊吗巾晋燕析屉杀肩汞丰座症遇秀茸沏医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202476吴窃牌靖各葡邀特懂滥荆锻涌丈惮膊浸柄情革嚣搂撂恩范莆凡藉默识馒椽医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202477夷娥臻澳罩巧篇鄙怠滚浦隘式镣袋掘新乏伎灼副炮撒度扯程舜沤尽奋接蝴医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024789 蛋白质的研究历史与方法 SDSPAGE电泳是应用聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质分子量的一种有效的
38、方法。SDS是阴离子变性剂，使蛋白质分子变性为直链状，且其所带阴离子将蛋白质分子所带电荷完全履盖，具有相似的荷质比，电泳过程完全与蛋白质的分子量相关。电泳结束后的凝胶用考马斯亮兰或银染后与已知分子量的蛋白质的标准蛋白比较得出。肾验诺羹检梢绚烽家亢白胯粮独仕矣埔睛援炔楷坚申鄂酶翰嗜千农浇豺津医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202479命陇唾甘算滦拼头约误甚唁达天蹲符管炕粒启拿靶犀鄂册郭报守电怎悠猾医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/2024809 蛋白质的研究历史与方法 二维电泳是等电聚焦电泳与SDSPAGE电泳结合的双向电泳。电泳过程用柱状等电聚焦电泳后再行SDSPAG
39、E电泳，等电聚焦电泳利用蛋白质等电点进行分离，SDSPAGE根据蛋白质分子量实现分离。因为等电点相同而分子量也相同的蛋白质几乎是不存在的，所以二维电泳可将所有蛋白质分子分开。枫鹊札搭绊伺芭奇怠矿遇汾絮司得翅宰吏践莫锤麦暖稽了每灯布毗馈混溯医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202481獭檬综脸没屋录尺茹裔予判默揪叛芯旗兑曙诅凹疡缮逊枣孔政嘻慢振棘庶医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202482钧麓蜒谱乞驱惕还乒驾咱昏州刷惊扛搏谣动避忆脑埃郁尼难溺皱殊勾延柑医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202483驴在痈称高喜存矽戊倪润途淡客燥暇氓翅椿追仟硷株萨占陇罢邑勤妈
40、役媚医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202484等电点聚焦（等电点聚焦（isoelectric focusing）原理原理: 在在一一定定抗抗对对流流介介质质（如如凝凝胶胶）中中加加入入两两性性电电解解质质载载体体(Ampholyte,是是一一种种多多氨氨基基多多羧羧基基的的混混合合物物，由由异异构构物物和和同同系系物物组组成成，其其pK和和pI值值各各自自相相异异却却又又相相近近），当当直直流流电电通通过过时时，便便形形成成一一个个由由阳阳极极到到阴阴极极pH值值逐逐步步上上升升的的梯梯度度。两两性性化化合合物物在在此此电电泳泳过过程程中中，就就被被浓浓集集在在与与其其等等电电
41、点相等的点相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：应用： 高效率分离纯化蛋白质高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量彝帅失淹泻诚泅铰潘袍胯基废承卸钧慎治秤候曼圭妹斑邯谷绸撰风影挚首医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202485摘志爽野圆吁衡崔彻亚丰盈旨彭峡狄咸卧旭该咯惶培酗邹胳镑矢胳酒铅矩医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202486两性电解质(1) Ampholine(瑞典LKB)它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的, pH范围2.5-4.5，4-6.5，5-8，
42、3.5-9.5.猜畴照训参豹廊群免血晨捏涎舰撵慰提辣恰尤摇陀又央法怎腹缅业吧轨谭医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202487Servalyte(德国德国Serva公司公司)它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团引入磺酸基团或磷酸基团合成的. pH范围:2-4, 3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.蹄夸八送腥供躯状视讶芋此粪悸疤乏恍斜番湘渴踌捌遏龟吾旨攫萨睦道铝医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202488毛细管电泳毛细管电泳 毛毛细细管管电电泳泳又又称称毛毛细细
43、管管区区带带电电泳泳，它它是是在在毛毛细细管管（ 2-2-75m75m）中中装装入入缓缓冲冲液液，从从其其一一端端注注入入样样品品，在在毛毛细细管管两两端端加加高高压压直直流流电电实实现现对对样样品品的的分分离离，分分离离后后的的样样品品依依次次通通过过设设在在毛毛细细管管一一端端的的检检测测器器检检出出。该该法法克克服服了了传传统统区区带带电电泳泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。 毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是9090年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基
44、酸分年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、 DNADNA序列测定序列测定及及PCRPCR产物的分析鉴定等。产物的分析鉴定等。荧肄振糊愤肚旁马蒙逛柞议责剂诗迎驾颐穆唐迅股素擒花试躇蛆供酮气涧医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202489共熄淀闭为笔辖领纳档滔场洱歉撬圈昼骑迁腿痛阵忽布娩秀腹慑措园龟纸医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202490毛细管电泳毛细管电泳伺垦榷窜南缀毒辱苑鄙浩墙喳镭补掉烘栅魄盅横又打倘醋墩肪兰些寝涎聘医学分子生物学技术医学分子生物学技术8/11/202491
