实时荧光定量PCR技术

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1、8/11/20241 主要内容主要内容第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应 第二节第二节 其他其他PCRPCR相关技术相关技术第三节第三节 实时实时/ /荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术第四节第四节 PCRPCR产物分析产物分析8/11/20242 n标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系总体积 X XA A 0. .11ugB B 各0.10.2umol/LC C 2. .5u D D 各200umol/LE E 含含 缓冲液缓冲液 1. .5 mmol/L PCRPCR扩增反应体系配制扩增反应体系配制8/11/20243 lPCR的程序编排与解读 1234522557294时间（m

2、in）温度（）D3B1C2重复 X 步Y 轮目的DNA片段扩增 Z Z 倍以上A8/11/20244 第三节第三节实时实时/荧光定量荧光定量PCR 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧，利用荧光信号累积光信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 Real-time /Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction 8/11/20245 n常规常规PCRPCR技术：技术： 对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终

3、点产物终点产物进行定量和定性分进行定量和定性分析。析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时检测（开盖检测（开盖检测“气溶胶气溶胶”污染污染问题）。问题）。 n实时实时/ /荧光定量荧光定量PCRPCR技术：技术： 利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环每一个循环扩增产物量的变化扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标准和标准曲线的分析对曲线的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析定量分析 实时实时/荧光定量荧光定量PCR的优势的优势8/11/20246 由于各反应管内由于各反应管内P

4、CRPCR扩增效率的差异使扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大差异得相同的样品扩增结果存在很大差异同时扩增同时扩增96份相同样品的份相同样品的Ct值一样，最终产物量却差异巨大值一样，最终产物量却差异巨大n终点检测法终点检测法定量的缺点定量的缺点8/11/20247 n荧光定量荧光定量PCR实时检测实时检测的优点的优点终产物终产物量一样量一样起始量起始量不同不同8/11/20248 n普通和实时定量普通和实时定量PCR的综合比较表的综合比较表项项 目目普通普通PCR实时定量实时定量PCR检测方法检测方法终点检测终点检测实时检测实时检测准确性准确性差差 好好重复性重复性差差 好好安全性安全

5、性低低 高高通通 量量低低 高高价价 格格便宜便宜昂贵昂贵8/11/20249 n荧光荧光染料法染料法 SYBR greenSYBR green :特异性结合双链，释放荧光信号n荧光荧光探针法探针法 1.Taqman1.Taqman技术技术 2.molecular Beacon2.molecular Beacon技术技术 3.3.复合探针法复合探针法 一、荧光定量荧光定量PCRPCR荧光标记物荧光标记物 8/11/202410 （一） 荧光染料法 SYBRSYBR荧光染料荧光染料SYBRSYBR荧光染料能特异性地掺荧光染料能特异性地掺入入DNADNA双链，发出荧光信号，而双链，发出荧光信号，而

6、不掺入链中的不掺入链中的SYBRSYBR染料分子不会发出任何荧光信号染料分子不会发出任何荧光信号，从而保，从而保证荧光信号的增加与证荧光信号的增加与PCRPCR产物的增加完全同步。产物的增加完全同步。 此方法未使用目的特异性探针，其此方法未使用目的特异性探针，其特异性完特异性完全由引物决定全由引物决定。在有非特异双链。在有非特异双链DNADNA产生时，产生时，其荧光也同样增强，此法与常规其荧光也同样增强，此法与常规PCRPCR的特异性的特异性差别不大。差别不大。 8/11/202411 q SYBR Green SYBR Green 能能结合到双链结合到双链DNADNA的的小沟小沟部位部位q

7、SYBR Green SYBR Green 只有和双链只有和双链DNADNA结合后才发荧光结合后才发荧光q 变性时，变性时，DNADNA双链分开，无荧光双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链复性和延伸时，形成双链DNADNA， SYBR Green SYBR Green 发荧光，发荧光，在此阶段采集荧光信号。在此阶段采集荧光信号。SYBR SYBR Green Green 8/11/202412 原理：未结合DNA的SYBR染料不发荧光，但只要掺入DNA双链，SYBR荧光染料能发射荧光，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。 uSYBR荧光染料法 8/11/202413 nSYBR

8、 Green 法优缺点 q 对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性 -适用于任何适用于任何DNADNAq 使用方便使用方便 -不必设计复杂探针不必设计复杂探针q 非常灵敏非常灵敏q 便宜便宜优 点q 容易与非特异性双链容易与非特异性双链DNADNA结合，产生假阳性结合，产生假阳性, ,但可以通但可以通过过融解曲线的分析融解曲线的分析，优化反，优化反应条件应条件q 对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高缺缺 点点8/11/202414 （二） 荧光探针法与目标序列互补v 55端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R) (Reporter, R) ，如如FAMFAM、VIC

9、VIC等等 v 33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)(Quencher, Q)v 探针完整，探针完整，R R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被Q Q基团吸收基团吸收 ，“不发不发”荧光，荧光， R R与与Q Q分开，发荧光分开，发荧光v TaqTaq酶有酶有 5353外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，延伸时延伸时水解探针水解探针1 1水解探针技术（水解探针技术（TaqmanTaqman技术）技术） 8/11/202415 TaqManTaqManTaqManTaqMan技术原理示意图技术原理示意图技术原理示意图技术原理示意图3端的荧光Q分子吸收5端荧光R分子

10、的荧光信号 探针5端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来 荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例 5353QRQ53R53激发激发5353激发激发RQ引物Taq 酶8/11/202416 8/11/202417 TaqmanTaqman探针探针+UNG+UNG酶技术动画酶技术动画8/11/202418 nTaqManTaqMan法优缺点法优缺点q 对目标序列的高特异性对目标序列的高特异性 -阴性结果确定阴性结果确定q 设计相对简单设计相对简单 -与目标序列某一区与目标序列某一区域互补域互补q重复性比较好重复性比较好优优 点点q 只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标q 委托公司

11、标记，价格较高委托公司标记，价格较高q 不易找到不易找到本底本底低的探针低的探针缺缺 点点8/11/202419 n Taqman技术的延伸：TaqMan- MGB探针 针对针对TaqmanTaqman探针荧光淬灭不彻底的问题，探针荧光淬灭不彻底的问题，MGBMGB探针，探针，33端采用了端采用了非荧光性的淬灭基因非荧光性的淬灭基因淬灭基团吸收报淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。8/11/202420 TaqManTaqManTaqManTaqMan-MGB-MGB-MGB-MGB探针示意图探针示意图探针示意图探针

12、示意图 MGB:MinorGrooveBinder(Tmenhancer)MGBNFQRn此外，此外，MGBMGB探针的探针的33端还连接了一个端还连接了一个三肽三肽，可以，可以大大稳定探针与模板的杂交大大稳定探针与模板的杂交, , 升高探针升高探针Tm Tm 值值, , 使较使较短的探针同样能达到较高的短的探针同样能达到较高的Tm Tm 值值而而短探针短探针的荧的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近光报告基团和淬灭基团的距离更近, , 淬灭效果更好，淬灭效果更好，荧光背景更低，信噪比更高。荧光背景更低，信噪比更高。8/11/202421 将荧光供体分子和受体分子分别标记在两个将荧光供体分子和受体

13、分子分别标记在两个不同的探针上，产生荧光供体探针和受体探针。不同的探针上，产生荧光供体探针和受体探针。 与靶序列退火时，退火时，两探针的荧光供体和受体分子紧密相邻，发生FRET产生荧光。荧光强度与起始模板的量成正比，以此可进行PCR定量分析。2.2.杂交探针技术杂交探针技术 荧光的程度与起始模板数的量成正比 ABB 荧光受体 A 荧光供体8/11/202422 3 3Molecular beaconMolecular beacon技术技术( (分子信标法分子信标法) )RQ激发激发RQQR激发激发发射发射分子灯塔形成茎环发夹结构,使荧光剂和淬灭剂紧密接触,导致荧光淬灭 单链寡核苷酸探针由于与靶

14、基因碱基序列互补而与之杂交探针5和3端分离,淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失,产生荧光 工作原理工作原理发夹形的寡聚核苷酸探针 内部淬灭荧光团8/11/202423 4 4复合探针法（复合探针法（complex probescomplex probes） 该法的基本原理是首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp），5端接一荧光分子，另一为淬灭探针（15bp），3端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探针5端杂交。Q淬 灭 Q 淬灭探针 R 发光探针RR8/11/202424 几种荧光定量PCR标记法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBR Green I 染料法染料法适用性广适用性广灵敏灵敏方便方便便宜便

15、宜引物要求高引物要求高易出现非特异性易出现非特异性带带适合科研中对各种目的基适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植的研究，转基因重组动植物的研究物的研究TaqMan探针探针特异性高特异性高重复性好重复性好价格高价格高只适合特定目标只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基病原体检测，疾病耐药基因研究因研究,药物疗效考核药物疗效考核遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断分子信标分子信标高特异性高特异性荧光荧光背景低背景低只适合特定目标只适合特定目标设计困难设计困难价格高价格高特定基因分析特定基因分析SNP分析分析8/11/202425 我校配备的实时荧光我校配备

16、的实时荧光PCRPCR仪仪 ABI-Step one 罗氏罗氏 Light Cycler 二、荧光定量PCR设备原理8/11/202426 ABI 7500荧光定量荧光定量PCR仪仪 MJ公司公司Chromo 4荧光定量荧光定量PCR仪仪 Bio-rad公司公司iCycler荧光定量荧光定量PCR仪仪 n普通普通实时荧光实时荧光PCR仪仪8/11/202427 普通实时荧光PCR仪信号采集示意8/11/202428 n离心式离心式实时荧光实时荧光PCR仪仪Rotor-Gene 3000荧光定量荧光定量PCR仪仪 Roche Light CycleTM荧光定量荧光定量PCR仪仪 8/11/202

17、429 离心式荧光定量PCR仪结构示意8/11/202430 温度温度均一性较好均一性较好；使用同一个激发光源和检测器，随时检测使用同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，旋转到跟前的样品，有效减少系统误差有效减少系统误差；可容纳样品量少，需用可容纳样品量少，需用特殊毛细管特殊毛细管，增加，增加使用成本，不带梯度功能。使用成本，不带梯度功能。 uRoche离心式实时定量离心式实时定量PCRPCR仪特点仪特点 8/11/202431 三、实时荧光PCR结果分析 328/11/202432 实时荧光PCR结果分析示例8/11/202433 定量原理定量原理介绍三个概念：介绍三个概念： 扩

18、增曲线扩增曲线、荧光阈值荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析8/11/202434 实时荧光实时荧光PCR结果分析结果分析扩增曲线扩增曲线Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase平台期平台期荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件扩增曲线图：扩增曲线图：横坐标：横坐标：扩增循环数（扩增循环数（CycleCycle）；）；纵坐标：纵坐标：荧光强度荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集每个循环进行一次荧光信号的收集8/11/2024

19、35 8/11/202436 荧光信号荧光信号阈阈值值 （threshold threshold ）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q真正的信号:荧光信号超过域值n荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。实时荧光实时荧光PCR结果分析结果分析荧光阈值荧光阈值8/11/202437 CtCt值的值的定义定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所

20、经过的扩增循环次数。C(t) value 实时荧光实时荧光PCR结果分析结果分析 CtCt值值8/11/202438 实时荧光实时荧光PCR结果分析结果分析 CtCt值的重现性值的重现性39横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量Ct值的特点：值的特点：相同模板进行相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性。值极具重现性。8/11/202439 在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。设定一个荧光阈值，得到样品的Ct值。每个模板的Ct值与该模板的起始

21、拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。 实时荧光PCR结果分析小结8/11/202440 临床检验中实时定量临床检验中实时定量PCR两种目标两种目标8/11/202441 u实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 8/11/202442 qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Samplen实时荧

22、光定量PCR原理-绝对定量258/11/202443 阴性对照阴性对照标准品标准品待测样品待测样品绝对定量实验设置绝对定量实验设置8/11/202444 标准品标准品(standard): 例如质粒，做系列梯度稀释例如质粒，做系列梯度稀释绘制标准曲线绘制标准曲线标准曲线：标准曲线：Y= a*log(X) + b8/11/202445 用于测定样品间某个基因表达水平用于测定样品间某个基因表达水平变化的差异倍数变化的差异倍数相对定量相对定量 两组样品：对照组和实验组两组样品：对照组和实验组 两个基因：内参基因和目的基因两个基因：内参基因和目的基因 不使用标准曲线，用不使用标准曲线，用 Ct法计算法

23、计算8/11/202446 对照组对照组实验组实验组目的基因目的基因内参基因内参基因相对定量实验设置相对定量实验设置8/11/202447 对照组对照组实验组实验组目的基因目的基因 Ct 内参基因内参基因Ct34321819相对变化倍数相对变化倍数 =2 - CtCt(实验组实验组)=Ct(目的基因目的基因)-Ct(内参基因内参基因)Ct(对照组对照组)=Ct(目的基因目的基因)-Ct(内参基因内参基因) Ct= Ct(实验组实验组) - Ct(对照组对照组)Ct法计算相对变化倍数法计算相对变化倍数8/11/202448 荧光定量PCR技术的主要医学应用定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNP

24、s）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等8/11/202449 第四节第四节 PCRPCR产物分析产物分析8/11/202450 PCRPCR扩增产物的检测与分析扩增产物的检测与分析n凝胶电泳凝胶电泳1 1琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法 琼脂糖凝胶电泳法的操作方法简单，能对PCR产物的长度进行粗略的鉴定，是应用最广泛的检测PCR产物的方法。不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同，如表所示：（一）（一）PCRPCR有效性和正确性有效性和正确性 （二）（二）PCRPCR产物的定量和序列分

25、析产物的定量和序列分析8/11/202451 琼脂糖浓度与分离线状DNA的有效范围琼脂糖含量(%) 分离线状DNA的有效范围(kb) 0.51-30 0.70.8-12 1.00.5-10 1.21.20.4-7 0.4-7 1.50.2-3 2.00.1-28/11/202452 电泳分析电泳分析电泳分析电泳分析8/11/202453 PCR产物的检测电泳分析电泳分析8/11/202454 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 特点：特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高(引物纯化)；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳

26、中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色弱点。用用途途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。注意：注意：相关试剂具有神经毒性。n凝胶电泳凝胶电泳8/11/202455 丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围丙烯酰胺(%) 有效分离范围(bp) 溴酚蓝位置(bp) 二甲苯蓝位置(bp) 3.51000-2000 1004605.080-500 652608.060-400 4510012.012.040-200 40-200 2020707015.025-150 156020.05-100 12458/11/202456 一、PCR-限制性片段

27、长度多态性分析法（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLPPCR-RFLP） 不同的限制性核酸内切酶有具识别的特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息用途：用途：传染病病原体基因分型、人类基因的变异研究，是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法PCR产物中点突变的分析8/11/202457 PCR-RFLPPCR-RFLP法法 限制性内切酶恶性肿瘤癌基因或抑癌基因

28、的突变检测恶性肿瘤癌基因或抑癌基因的突变检测Ras基因突变限制性内切酶8/11/202458 二、等位基因特异性寡核苷酸分子杂交（ASO） l 分别合成分别合成野生型野生型和和突变型突变型探针探针，在等位基因，在等位基因DNA DNA PCRPCR扩增产物扩增产物电泳分离后电泳分离后转移固定在膜上转移固定在膜上，分别与，分别与寡核苷酸探针杂交，可明确诊断是否有突变及突变寡核苷酸探针杂交，可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。是纯合子还是杂合子。l 其中，其中，PCRPCR产物不电泳分离，直接点膜杂交的叫产物不电泳分离，直接点膜杂交的叫斑斑点杂交点杂交。 PCR产物中点突变的分析8/11

29、/202459 等位基因特异性寡核苷酸探针杂交原理等位基因特异性寡核苷酸探针杂交原理 （Allele Specific Oligonucleotide, ASO）突变探针突变探针正常探针正常探针正常基因正常基因突变基因突变基因正常探针正常探针突变探针突变探针突变基因突变基因正常基因正常基因突变探针突变探针突变探针突变探针正正常常患患者者携携带带正正常常携携带带患患者者8/11/202460 三、 单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism，简称PCR-SSCP） 将将PCR PCR 产物双链产物双链DNADNA（dsDNAdsD

30、NA）变性为单链变性为单链DNA DNA （ssDNAssDNA），），加样于加样于变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，进行电泳，由于由于DNADNA分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构有关，而空间结构又与空间结构又与ssDNAssDNA序列有关序列有关。因此，电泳结束后，因此，电泳结束后，ssDNAssDNA带位置的差异即可反映带位置的差异即可反映出出PCRPCR产物序列的差异。产物序列的差异。 PCR产物中点突变的分析8/11/202461 PCR-SSCPPCR-SSCP过程示意过程示意 -primer-32P-dNT

31、P掺入掺入PCR扩增扩增产物产物变性变性单链单链DNA中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳1 2 3 4 5自显影自显影 1.为正常结果分析结果分析2、4、5纯合患者 3.为杂合子 . 解链构像DAN原 理过 程8/11/202462 DGGE原理：原理：当温度达到熔点温度(Tm) 时，DNA 双链的部分区段解链。梯度增加凝胶内变性剂的浓度会促使双链DNA 解链，在凝胶中形成迁移率下降的分支分子。四、变性梯度凝胶电泳DGGE PCR产物中点突变的分析通常在均一的运行温度（50-65C）和尿素与甲酰胺线性变性梯度条件下即形成变性环境，梯度以垂直或平行于电泳方向形成。DGGE 是灵敏的突变

32、检测方法，其效率可达99%。8/11/202463 n垂直变性梯度凝胶电泳垂直变性梯度凝胶电泳DGGEDGGE（一）凝胶的变性梯度方向与电泳方向垂直：（一）凝胶的变性梯度方向与电泳方向垂直： 从乳腺癌扩增p53 基因6 号外显子的野生型和突变型等位基因，通过垂直DGGE分离。8/11/202464 n平行变性梯度凝胶电泳平行变性梯度凝胶电泳DGGEDGGE p53 基因8 号外显子的野生型和突变型等位基因在平行梯度（4065% 变性剂） DGGE凝胶上。左道，突变型等位基因；中，野生型等位基因；右，突变型与野生型等位基因。（二）凝胶的变性梯度方向与电泳方向平行：（二）凝胶的变性梯度方向与电泳方

33、向平行： 8/11/202465 五、熔点曲线 SYBR Green I 染料法将温度与荧光强度的变化求导将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱 PCR产物中点突变的分析8/11/202466 熔点曲线 SYBR Green I SYBR Green I 染料法染料法熔点曲线分析，单一熔点曲线分析，单一峰无非特异性荧光：峰无非特异性荧光：单一特异产物单一特异产物熔点曲线分析，出现熔点曲线分析，出现杂峰其他产物出现非杂峰其他产物出现非特异性荧光：特异性荧光：多个不同产物多个不同产物8/11/202467 “双脱氧双脱氧ddNTP”六、PCR产物测序分析（直接

34、或克隆后测序直接或克隆后测序） 正常 PCR产物中点突变的分析8/11/202468 小结：小结：PCRPCR产物的检测与分析产物的检测与分析（一）（一）PCRPCR有效性和正确性有效性和正确性 琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法（二）（二）PCRPCR产物的定量和序列分析产物的定量和序列分析 琼脂糖凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳PCRPCR产物中点突变的分析：产物中点突变的分析： PCR-RFLP, ASO, SSCP, DGGE,PCR-RFLP, ASO, SSCP, DGGE, 熔点曲线分析，测序分析熔点曲线分析，测序分析8/11/202469 第五

35、节第五节 临床基因扩增检验的质量管理临床基因扩增检验的质量管理8/11/202470 PCR的特点及应用灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA8/11/202471 一、临床一、临床PCRPCR实验诊断的实验诊断的基本要求基本要求1应该建立应该建立实验制度实验制度，其中包括，其中包括标本采集、接收、标本采

36、集、接收、存放及处理制度存放及处理制度、临床基因诊断实验室作制临床基因诊断实验室作制度度、消毒及防止污染制度消毒及防止污染制度。2 2每个基因检测项目均建立每个基因检测项目均建立操作及质量控制手册操作及质量控制手册。3 3建立建立各级人员的工作职责各级人员的工作职责；设立；设立专业技术主管专业技术主管。4 4PCRPCR实验室实验室必备的条件不得缺少必备的条件不得缺少，否则不能开展，否则不能开展临床基因实验诊断工作。临床基因实验诊断工作。5 5临床基因诊断实验室临床基因诊断实验室禁止无关人员出人禁止无关人员出人，实验室，实验室主要通道出入口及各功能区域门口，应有主要通道出入口及各功能区域门口，

37、应有“禁止禁止入内入内”和和“生物污染生物污染”等等字样及标志字样及标志。8/11/202472 二二.PCR.PCR操作程序标准化操作程序标准化 （一）上岗人员培训制度（一）上岗人员培训制度 （二）（二）标准化标准化PCRPCR诊断实验室诊断实验室 （三）（三）PCRPCR标准化操作程序标准化操作程序 1 1试剂配制、分装及保存试剂配制、分装及保存 2 2标本的采集与处理标本的采集与处理 3 3基因扩增及其实验条件的选择基因扩增及其实验条件的选择 4 4扩增产物检测扩增产物检测 5 5PCRPCR结果的判读结果的判读 （四）（四）污染的预防及污染源的标准化处理污染的预防及污染源的标准化处理8

38、/11/202473 nPCR实验中污染的预防 严格执行各项规章制度，严格执行各项规章制度，按规程按规程进行实验操作；进行实验操作；实验时，必须戴一次性手套（处理标本时需戴乳实验时，必须戴一次性手套（处理标本时需戴乳胶手套），并胶手套），并随时更换；随时更换；工作衣、手套及实验用器材应工作衣、手套及实验用器材应分区固定使用；分区固定使用；不在不在PCR实验室从事分子克隆实验，实验室从事分子克隆实验，不得不得在室内在室内从事与实验无关的事宜；从事与实验无关的事宜；保持保持地面及桌面地面及桌面整洁整洁，保持，保持室内温度恒定室内温度恒定，室内，室内禁止禁止使用电风扇使用电风扇。8/11/20247

39、4 所有用于标本采集的容器及基因扩增管等模板或所有用于标本采集的容器及基因扩增管等模板或扩增产物污染的物品，应置于扩增产物污染的物品，应置于1molL盐酸盐酸中临中临时存放，以减少室内气溶胶形成；时存放，以减少室内气溶胶形成； 标本扩增后产物及一次性使用物品等实验材料，标本扩增后产物及一次性使用物品等实验材料，实验完毕密封包装（包装袋应有明显的生物污染实验完毕密封包装（包装袋应有明显的生物污染标记），进行标记），进行高压消毒并焚烧高压消毒并焚烧；对于不能进行高压消毒等方法处理的重复使用物对于不能进行高压消毒等方法处理的重复使用物品或器具，如塑料试管架等，可以用一般或专门品或器具，如塑料试管架等

40、，可以用一般或专门消毒液浸泡消毒，如消毒液浸泡消毒，如210的的84消毒液消毒液；超净工作台超净工作台使用前，使用前，紫外线灯消毒紫外线灯消毒不少于不少于20分钟，分钟，使用后先消毒液洗擦，再使用后先消毒液洗擦，再75乙醇擦一次。乙醇擦一次。nPCR实验中污染源的标准化处理8/11/202475 n 临床临床PCRPCR实验诊断的实验诊断的其他注意事项其他注意事项 -以实时荧光定量以实时荧光定量PCRPCR检测为例检测为例8/11/202476 特异性一定要高特异性一定要高，避免引物的，避免引物的错配和二聚体（错配和二聚体（同样发光同样发光）；）；引物设计的时候要尽可能设计引物设计的时候要尽可

41、能设计在在同一退火温度同一退火温度； 扩增子要扩增子要跨内含子跨内含子，避免微量，避免微量基因组干扰；基因组干扰； 扩增子长度在扩增子长度在80-250 bp左右。左右。注意事项一：引物设计特殊要求注意事项一：引物设计特殊要求-因为qPCR检测太敏感8/11/202477 RNA质量包含两个方面：质量包含两个方面：样品的纯度和样品的纯度和RNA的完整性的完整性260/280在在1.8至至2.128s和和 18s 条带明显，条带明显， 28s/18s 1. 1不要混入不要混入DNA污染，在加污染，在加氯仿前离心，不取中间层氯仿前离心，不取中间层注意事项二：注意事项二：RNARNA的提取的提取8/

42、11/202478 注意事项三：合理设置实验分组注意事项三：合理设置实验分组 标准品：标准品： 梯度稀释用于绘制标准曲线梯度稀释用于绘制标准曲线 阳性对照：阳性对照： 监测系统故障监测系统故障 阴性对照：阴性对照： 监测样品污染监测样品污染 实验组：实验组： 待测样品待测样品内参基因内参基因： 校准校准生物学误差生物学误差重复样品重复样品： 降低降低操作误差操作误差8/11/202479 n 内参基因的选择内参基因的选择 内参基因：内参基因：应该在实验干预条件下，在所有的待测应该在实验干预条件下，在所有的待测样品中，内参基因的表达量都是不变的。样品中，内参基因的表达量都是不变的。 8/11/2

43、02480 应寻找应寻找适合各自实验系统的适合各自实验系统的特异性稳定表达的内特异性稳定表达的内参基因；参基因；选择选择一个以上一个以上的内参基因用作内参可得到更可靠的内参基因用作内参可得到更可靠的结果。的结果。n没有万能的内参基因没有万能的内参基因 GAPDH在不同癌组织中的表达升高，在各种刺激下在不同癌组织中的表达升高，在各种刺激下(例如低例如低氧、胰岛素、地塞米松、表皮生长因子等氧、胰岛素、地塞米松、表皮生长因子等),培养细胞培养细胞GAPDH mRNA的表达水平也不同的表达水平也不同-actin 当细胞向恶性转化时表达水平增加。当细胞向恶性转化时表达水平增加。 rRNA 在有丝分裂期间

44、在有丝分裂期间, 28S、18S rRNA 明显减少。明显减少。8/11/202481 生物学重复和技术重复生物学重复和技术重复低丰度表达的基因要更多的重复低丰度表达的基因要更多的重复n 实验重复的设置实验重复的设置8/11/202482 l使用使用微量移液器微量移液器一定要仔细，勿产生一定要仔细，勿产生 气泡，减少加样误差气泡，减少加样误差l管理混乱和不戴管理混乱和不戴手套手套，会造成试剂污染，会造成试剂污染l遮挡强烈遮挡强烈日光和灯光日光和灯光，保证试剂的稳定性，保证试剂的稳定性注意事项四：减少操作误差注意事项四：减少操作误差8/11/202483 教学要求1. .掌握：掌握：PCRPCR

45、基本原理和反应过程、反应组基本原理和反应过程、反应组分和相应条件分和相应条件; ;掌握反转录掌握反转录RT-PCRRT-PCR、实时定、实时定量量PCRPCR的技术原理的技术原理. .2.2.熟悉：熟悉：以以PCRPCR为基础的相关核酸扩增技术为基础的相关核酸扩增技术如巢式如巢式PCRPCR、多重、多重PCRPCR；熟悉；熟悉PCRPCR产物检测点产物检测点突变的相关技术突变的相关技术. .3.3.了解：了解：其他核酸扩增技术；了解临床基因其他核酸扩增技术；了解临床基因扩增检验质量管理的概念和基本内容扩增检验质量管理的概念和基本内容. .8/11/202484 周五周五实验课开课实验课开课安排安排l实验内容：实验内容： 大肠杆菌质粒提取和琼脂糖电泳鉴定大肠杆菌质粒提取和琼脂糖电泳鉴定l时间：时间：2点点-5点点20分（连续分（连续5个学时）个学时）l地点：实验楼二层西南角地点：实验楼二层西南角-分析实验室分析实验室1l分组：分组：6个实验组，个实验组，确定小组负责人确定小组负责人l要求要求1：复习理论，预习操作（：复习理论，预习操作（实验动画实验动画8min） l要求要求2：带实验指导，着白大衣，注意纪律。：带实验指导，着白大衣，注意纪律。 8/11/202485 授课完毕！授课完毕！8/11/202486