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1、小鼠骨髓细胞微核试验小鼠骨髓细胞微核试验受试物: 环磷酰胺受试动物: 小鼠实验目的实验目的学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞(PCE)(PCE)微核测定微核测定方法方法 细胞分裂分为四个期细胞分裂分为四个期：1 1、G1G1期（期（DNADNA合成前期）：细胞生长，为合成前期）：细胞生长，为DNADNA复制做复制做 准备。准备。2 2、S S期（期（DNADNA合成期）：体细胞的合成期）：体细胞的DNADNA含量由含量由2C2C增加增加到到4C4C3 3、G2G2期期(DNA(DNA合成后期合成后期) )：该期主要为：该期主要为M M期作准备，包期作准备，包括复制因子的失
2、活和有丝分裂促进因子的分化括复制因子的失活和有丝分裂促进因子的分化, ,有有关细胞骨架系统重新组装的蛋白质合成关细胞骨架系统重新组装的蛋白质合成4 4、M M期期( (有丝分裂期有丝分裂期) )：前期，早中期，中期，：前期，早中期，中期， 后后期（微核形成期），末期期（微核形成期），末期图图13-1 13-1 细胞周期可划分为四个阶段细胞周期可划分为四个阶段 微核微核（micronucleus）是染色体或染色单体的无着丝点片断或纺锤体是染色体或染色单体的无着丝点片断或纺锤体受损而丢失的整个染色体，于细胞分裂后期留在受损而丢失的整个染色体，于细胞分裂后期留在细胞质中，末期后，单独形成几个规则的次
3、核，细胞质中，末期后，单独形成几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，比主核小，故叫微核。包含在子细胞的胞质内，比主核小，故叫微核。 原理：原理：1 1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点 的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中质中2 2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中移动，从而遗留在细胞质中 结论结论：微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗
4、的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点传学终点 微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数PCEPCE细细胞中的微核，因为成红细胞发展为红细胞时，主胞中的微核，因为成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为核排出，成为PCEPCE，这些细胞保持其嗜碱性约，这些细胞保持其嗜碱性约2424小小时，然后成为正染红细胞（时，然后成为正染红细胞（NCENCE）, ,并进入外周血。并进入外周血。注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中操作步骤：操作步
5、骤：一染毒：染毒途径：腹腔注射环磷酰胺，染毒二次，染毒途径：腹腔注射环磷酰胺，染毒二次，0 0、2424小时各染毒一次，小时各染毒一次，6h6h后取样后取样染毒剂量：染毒剂量：50mg/kg50mg/kg二处死：颈椎脱臼法处死小鼠颈椎脱臼法处死小鼠三：骨髓液的制备和涂片1 1 处理：方法：取胸骨，去掉血污和肌肉，剪去处理：方法：取胸骨，去掉血污和肌肉，剪去每节骨骺，用弯止血钳将骨髓挤于预先滴有小牛每节骨骺，用弯止血钳将骨髓挤于预先滴有小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片2 2 固定：将推好凉干的骨髓片放进染色缸，甲固定：将推好凉干的骨髓片放进染色缸，甲醇固定
6、醇固定1515分钟，取出晾干分钟，取出晾干3 3 染色：用新鲜配制的染色：用新鲜配制的GiemsaGiemsa应用液（应用液（GiemsaGiemsa储备液一份加储备液一份加pH6.8pH6.8的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液9 9份）染色份）染色10101515分钟，细流水冲掉玻片染色液，晾干分钟，细流水冲掉玻片染色液，晾干 四观察和计数：观察：先用低倍镜观察，选择分布均匀的域，观察：先用低倍镜观察，选择分布均匀的域，再在油镜下观察计数。再在油镜下观察计数。PCEPCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞呈灰蓝色，正染红细胞（细胞（NCENCE）桔黄色。细胞中的微核大半呈圆形，）桔黄色。细胞中的微核大半呈圆
7、形，边缘光滑，嗜色性与核质一致，一个细胞内可以边缘光滑，嗜色性与核质一致，一个细胞内可以出现一个或多个微核。出现一个或多个微核。 计数：计数：10001000个个PCEPCE中含微核的中含微核的PCEPCE数，并计算数，并计算200200个细胞中个细胞中PCE/NCEPCE/NCE的比值的比值结果与分析：1 结果：试验只计数PCE中的微核，微核率以千分率表示。每组的雌雄动物分开计数微核PCE均值。2 分析：正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），如果0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；如果0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。 图图 1 1 ：正常嗜多染红细胞：正常嗜多染红细胞
8、 PCE PCE （ 400 400 ） 图图 2 2 带微核嗜多染红细胞带微核嗜多染红细胞 MNPCE MNPCE （ 400 400） 注意事项：1、剪胸骨时通过剪断两边的肋骨来把整块胸骨取下来，以防不小心把胸骨剪断2、挤出骨髓处的肌肉要剔除干净3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂时要涂匀，以便推片4、染色前可以先看一下整体涂片情况，细胞分散度是否良好5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优良的染色流程图流程图 处死小鼠，取胸骨处死小鼠，取胸骨推推片片固固定定染染色色观察并记观察并记数数动物骨髓细胞染色体畸变分析动物骨髓细胞染色体畸变分析目的和意义目的和意义:1、学习动物骨髓细胞染色体标本的
9、制作2、了解动物体内染毒及染色体畸变类型 染色体畸变染色体畸变：指染色体的结构改变，它是指遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现染色体畸变分析：染色体畸变分析：指观察染色体形态结构和数目改变，又称为细胞遗传学实验 实验原理实验原理: 1 染色体畸变只能在细胞分裂的染色体畸变只能在细胞分裂的中期中期进行观察进行观察和分析，为收集足够的中期相细胞，在收获细胞和分析，为收集足够的中期相细胞，在收获细胞前，用秋水仙碱处理，以阻断微管蛋白的聚合，前，用秋水仙碱处理，以阻断微管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使分裂间期和前抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使分裂间期和
10、前期的细胞停留在中期相。期的细胞停留在中期相。2 细胞通过低渗，使染色体均匀散开，然后固细胞通过低渗，使染色体均匀散开，然后固定、染色，可在油镜下观察定、染色，可在油镜下观察操作步骤操作步骤一、收获细胞一、收获细胞1 1 秋水仙碱处理实验动物（小鼠秋水仙碱处理实验动物（小鼠4mg/kg 4mg/kg 处死动物前处死动物前6h6h腹腔注射）腹腔注射）2 2 取股骨取股骨3 3 PBSPBS液液5ml5ml冲洗骨髓，冲洗骨髓，1500r/min1500r/min离心离心10min10min，去上清去上清二、低渗二、低渗1 1 打散沉淀物打散沉淀物，加入，加入37 37 预温的预温的0.075mol
11、/L0.075mol/L的的 KCl 6mlKCl 6ml混匀，于混匀，于3737低渗低渗151520min 20min 2 2 再加再加固定液固定液1 12ml2ml混匀，立即于混匀，立即于1000r/min1000r/min离心离心10min10min，去上清，去上清 三、固定三、固定1 1 使细胞悬浮，加入固定液使细胞悬浮，加入固定液4ml4ml混匀，混匀，放置室温放置室温101020min20min，然后，然后1000r/min1000r/min离心离心10min10min，去上清，去上清2 2 同样方法再固定一次，去上清，留同样方法再固定一次，去上清，留0.5ml0.5ml 四、制片
12、染色四、制片染色使细胞悬浮，将细胞悬液滴于使细胞悬浮，将细胞悬液滴于冰冻的冰冻的载玻片上，干燥，用载玻片上，干燥，用1010GiemsaGiemsa染液染色染液染色101020min20min，取出清洗自然干，取出清洗自然干五、阅片五、阅片先在底倍镜下选择分散良好、细胞未先在底倍镜下选择分散良好、细胞未破裂的中期分裂相，油镜下观察并记录染色体结破裂的中期分裂相，油镜下观察并记录染色体结构异常和数目异常细胞构异常和数目异常细胞结果分析与评价结果分析与评价结果：结果：以每只动物为观察单位，每只动物观察以每只动物为观察单位，每只动物观察100100个中期分裂相，计算其畸变细胞率个中期分裂相，计算其畸
13、变细胞率分析与评价：分析与评价：1 1 阴性和阳性对照组的畸变率应与所用阴性和阳性对照组的畸变率应与所用动物的种属及有关资料相符动物的种属及有关资料相符2 2 试验结果可以用多种统计方法处理，试验结果可以用多种统计方法处理，所得结果应该是相同的所得结果应该是相同的3 3 各实验组即便细胞率与阴性对照组相各实验组即便细胞率与阴性对照组相比较，应该有显著性差异，还应有剂量反应关系比较，应该有显著性差异，还应有剂量反应关系图 1：正常精母细胞（ 1000 ） 图 2 ：精母细胞染色体环（ 1000 图 3 ：精母细胞链状四价体（ 1000 ）图 4 ：精母细胞染色体数目减少（ 1000 ） 注意事项：注意事项：低渗是本实验的关键，控制好低渗时间，做出分散良好的染色体标本，关系到实验结果的准确性流程图流程图处死小鼠，取股骨处死小鼠，取股骨取骨髓，离心取骨髓，离心低渗、低渗、固定、再离心固定、再离心固定两次固定两次染色染色阅片阅片
