第四章污染物生物效应检测

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1、 第四章第四章 污染物的生物效应检测污染物的生物效应检测 第一节第一节 生物测试及方式生物测试及方式 第二节第二节 生物毒性试验生物毒性试验 第三节第三节 生物三致效应检测生物三致效应检测 1 第一节生物测试及方式第一节生物测试及方式 一、生物测试一、生物测试 生物测试生物测试（Bioassay）指利用生物反应测定一种或）指利用生物反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时，所导致的影多种污染物或环境因素单独或联合存在时，所导致的影响或危害。实际上就是用生物去测定污染物的危害。响或危害。实际上就是用生物去测定污染物的危害。 可在分子、细胞、组织、器官、甚至个体和种群多种可在分子、细胞、

2、组织、器官、甚至个体和种群多种水平上进行。水平上进行。2污染物毒性生物测试优点污染物毒性生物测试优点： 1)生物测试不需特殊仪器、方法简单。生物测试不需特殊仪器、方法简单。 2)可提供污染物可提供污染物的生物毒性，而常规的物理和化学检测只能测定污染物的的生物毒性，而常规的物理和化学检测只能测定污染物的浓度。浓度。 3）可测定污染物之间的相互作用）可测定污染物之间的相互作用,以及它们对生以及它们对生物体的综合效应物体的综合效应,而常规的物理和化学检测则做不到。而常规的物理和化学检测则做不到。4）还可了解环境因素对污染物毒性的影响。如水体还可了解环境因素对污染物毒性的影响。如水体pH、溶、溶氧量、

3、氧化还原电位、水体中有机和元机配位体对污染物氧量、氧化还原电位、水体中有机和元机配位体对污染物毒性的影响等毒性的影响等。 3生物测试意义生物测试意义： 1）研究多种污染物联合作用的生物效应。）研究多种污染物联合作用的生物效应。 2）监测环境质量的变化。）监测环境质量的变化。 3）制订环境质量标准。）制订环境质量标准。 4）对制订排污标准，以及对污染物生态风险评价有重要）对制订排污标准，以及对污染物生态风险评价有重要意义。意义。4 但注意：但注意： （1）污染物结构、性质、毒作用机理不同，同一种生物对不）污染物结构、性质、毒作用机理不同，同一种生物对不同污染物的反应不同。同污染物的反应不同。 （

4、2）不同生物解毒机制、及能力不同，因而不同生物对相同）不同生物解毒机制、及能力不同，因而不同生物对相同污染物有不同的反应。污染物有不同的反应。（3）不同发育阶段的生物对同种污染物的反应也不同。）不同发育阶段的生物对同种污染物的反应也不同。 （4）受污染毒害的经验也会影响生物对有毒污染物的反应。）受污染毒害的经验也会影响生物对有毒污染物的反应。 5（一）生物测试方式（一）生物测试方式 根据不同的研究要求和目的，可进行不同的测试。根据不同的研究要求和目的，可进行不同的测试。 测试方法多样，测试方法多样， 有按时间分的、有按试验溶液和气体有按时间分的、有按试验溶液和气体给予方式分的。给予方式分的。1

5、、短期生物测试、短期生物测试（Short term bioassays） 指被测试的生物在指被测试的生物在短时间短时间内暴露于内暴露于高浓度高浓度的污染物的污染物下，测定污染物对生物有机体的影响。下，测定污染物对生物有机体的影响。 例：急性毒性例：急性毒性试验，以快速估价污染物的毒性。试验，以快速估价污染物的毒性。6 1) 测试目的：测试目的： （1）快速估计污染物的毒性；（）快速估计污染物的毒性；（2）评价几种毒物的）评价几种毒物的相对毒性；（相对毒性；（3）评价不同生物对不同条件如温度、）评价不同生物对不同条件如温度、pH的的相对敏感性等。相对敏感性等。 主要用于测定半致死浓度主要用于测定

6、半致死浓度(LC50)、或半抑制浓度、或半抑制浓度(IC50) 或半效应浓度或半效应浓度(EC50)。 2) 时间设定时间设定 ： 一般小于一般小于1周，如周，如 一般水蚤类一般水蚤类 2d，藻类，藻类 3d，鱼类，鱼类 4d。73) 测试特点测试特点 （1） 暴露时间短；仅几天。（暴露时间短；仅几天。（2）污染物浓度高；）污染物浓度高； （3）一般采用静止式给予有毒溶液或气体。）一般采用静止式给予有毒溶液或气体。 但对于下列情况，应用流动式给药：但对于下列情况，应用流动式给药： 1）不稳定且易）不稳定且易挥发的污染物（浓度会渐低挥发的污染物（浓度会渐低)； 2）BOD较高的污水较高的污水(低

7、低O2)； 3）代谢速率快的受试生物（产生高的代谢产）代谢速率快的受试生物（产生高的代谢产物如物如CO2和和NH3会影响受试生物的代谢。会影响受试生物的代谢。 8 2、长期生物测试、长期生物测试（Long term bioassays） 在在低浓度低浓度下，受试生物下，受试生物长期长期被暴露于污染物下的测试，又被暴露于污染物下的测试，又称称全部生活史生物测试全部生活史生物测试，常见有，常见有慢性毒性试验慢性毒性试验。 1）测定目的）测定目的 测定在长期污染下，不造成有害效应的毒物最大浓度，测定在长期污染下，不造成有害效应的毒物最大浓度，或或最大允许毒物浓度（最大允许毒物浓度（MATC）。 测定

8、包括毒物对生物生长、生殖、产卵、孵卵、幼体成测定包括毒物对生物生长、生殖、产卵、孵卵、幼体成活等的影响。活等的影响。92）时间确定）时间确定 （1）对动物而言，需要从一个卵期到下一个卵期或更长的）对动物而言，需要从一个卵期到下一个卵期或更长的连续测定；连续测定； （2）对于更小的生物如浮游生物，要持续好几代测试；）对于更小的生物如浮游生物，要持续好几代测试； （3）但对生活史特别长的动物，人们则选择在整个生活史）但对生活史特别长的动物，人们则选择在整个生活史中最敏感的几个阶段测试。如在鱼的发育早期测定，这种测中最敏感的几个阶段测试。如在鱼的发育早期测定，这种测定又称部分生活史生物测试。定又称部

9、分生活史生物测试。103) 长期生物测试要求长期生物测试要求 (1)只能采用流动式染毒性。只能采用流动式染毒性。 (2)室内试验条件，如水温、室内试验条件，如水温、pH、硬度等必需和自然季、硬度等必需和自然季节变化相符。节变化相符。 (3)受试受试 生物的生长、发育规律符合季节变化。生物的生长、发育规律符合季节变化。 113、中期生物测试、中期生物测试（Intermediate term bioassays） （1 ）目的）目的: 介于短期和长期之间的一类生物测试。如介于短期和长期之间的一类生物测试。如亚慢性毒性试验。亚慢性毒性试验。 对毒物的毒作用、靶器官和最大无作对毒物的毒作用、靶器官和最

10、大无作用剂量或中毒阈值作出估计用剂量或中毒阈值作出估计。 （2）测试时间：）测试时间：8天之内算是短期，天之内算是短期，8-90天之间中期。天之间中期。 （3）毒物给予方式：无论毒物是溶液还是气体，给予方）毒物给予方式：无论毒物是溶液还是气体，给予方式一般采用流动式，少数可采用静止式。式一般采用流动式，少数可采用静止式。12（二）受试生物的选择（二）受试生物的选择 1）对毒物敏感性：）对毒物敏感性： SO2的敏感植物：紫苜蓿、大麦、棉的敏感植物：紫苜蓿、大麦、棉花、小麦、花、小麦、 三三 叶草、叶草、 甜菜、莴苣、大豆、向日葵。甜菜、莴苣、大豆、向日葵。O3敏感敏感植物：烟草、番茄、矮牵牛、菠

11、菜、土豆、燕麦、丁香、秋植物：烟草、番茄、矮牵牛、菠菜、土豆、燕麦、丁香、秋海棠、女贞、梓树。海棠、女贞、梓树。 2）具生态学价值或经济价值。）具生态学价值或经济价值。3）实验）实验室内易培养和繁殖。室内易培养和繁殖。4）具清楚的生物学背景资料如生活史、）具清楚的生物学背景资料如生活史、生长、发育特点等；生长、发育特点等；5）足够的数量。）足够的数量。6）对毒物的反应的易）对毒物的反应的易测性。测性。 此外，个体大小、生活史长短，以及以前受污染情况也此外，个体大小、生活史长短，以及以前受污染情况也需考虑。需考虑。13二、生物测试标准化二、生物测试标准化（一）影响生物测试的因素（一）影响生物测试

12、的因素 1、受试生物、受试生物：受试生物的种类、生长年龄（生活阶段、尺：受试生物的种类、生长年龄（生活阶段、尺寸大小、脱皮阶段）、发育阶段、食物供应程度等均影响生物寸大小、脱皮阶段）、发育阶段、食物供应程度等均影响生物对毒物的敏感性。对毒物的敏感性。 2、试验条件、试验条件：如试验水质的温度和含盐量、水流速度和溶：如试验水质的温度和含盐量、水流速度和溶解氧、水域的酸碱度、受试生物的总量，不仅影响生物对毒物解氧、水域的酸碱度、受试生物的总量，不仅影响生物对毒物的反应，而且影响作用于生物的毒物浓度、性质和形态。的反应，而且影响作用于生物的毒物浓度、性质和形态。 3、实验操作、实验操作：实验结果还受

13、人员操作水平、仪器设备的精：实验结果还受人员操作水平、仪器设备的精度、测定方法的影响。度、测定方法的影响。14（二）标准化测试的优点（二）标准化测试的优点 1）增加数据的精确度，利于数据的比较。）增加数据的精确度，利于数据的比较。 2）测试可以被其它实验室重复。）测试可以被其它实验室重复。 3）筛选不同实验室一致的实验结果。）筛选不同实验室一致的实验结果。 4）可为环境标准的建立提供可靠的数据，如饮用水环境）可为环境标准的建立提供可靠的数据，如饮用水环境质量标准等。质量标准等。15（三）标准化的生物测试方法（三）标准化的生物测试方法 有水质物质对蚤类急性毒性测定方法有水质物质对蚤类急性毒性测定

14、方法B/T13266-91)、水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方、水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法法(GB/T13267-91)等。等。 主要主要对对1）毒物的分析方法、环境条件的测定方法，）毒物的分析方法、环境条件的测定方法，2）仪器设备）仪器设备, 3）生物大小、生物量，）生物大小、生物量，4）水的溶解氧和）水的溶解氧和pH, 5）统计方法作出了国家规定。）统计方法作出了国家规定。 但对那些易分解、非常见和混合污染物的测定还很难但对那些易分解、非常见和混合污染物的测定还很难进行标准化测定。进行标准化测定。16 第二节第二节 生物毒性试验生物毒性试验一、生物毒性一、生物毒性（

15、一）生物毒性的基本概念（一）生物毒性的基本概念 1、毒物（、毒物（Toxicant）和）和毒性毒性 （1）毒物）毒物：在一定条件下，以：在一定条件下，以较小剂量较小剂量给予有机体时，给予有机体时，与生物相互作用后而引起与生物相互作用后而引起功能或器质性损伤功能或器质性损伤的化学物质称的化学物质称毒物毒物。 或或剂量虽微剂量虽微，但，但积累到一定量时，就能干扰或破坏机积累到一定量时，就能干扰或破坏机体的正常生理功能，而引起暂时或持久性病变，甚至危及体的正常生理功能，而引起暂时或持久性病变，甚至危及生命的化合物，称生命的化合物，称毒物毒物。17 （2）毒性）毒性(Toxicity): 指毒物产生有

16、害作用的能力。指毒物产生有害作用的能力。 与下列因素有关：与下列因素有关： 1）进入机体的剂量。体内）进入机体的剂量。体内潜在性有毒物质存在潜在性有毒物质存在并不意味发并不意味发生中毒，通常只有达中毒剂量时，才可引起中毒。生中毒，通常只有达中毒剂量时，才可引起中毒。 2）进入机体的方式（如经口、皮肤或呼吸）。）进入机体的方式（如经口、皮肤或呼吸）。 3）接触时间及频率。时间越长、频率越高，越引起中毒。）接触时间及频率。时间越长、频率越高，越引起中毒。 18 2、中毒（、中毒（toxication） 受到毒物作用，引起生物有机体受到毒物作用，引起生物有机体功能和器质性损伤后，所出现的功能和器质性

17、损伤后，所出现的疾病状态疾病状态称中毒。称中毒。 如有机磷中毒后出现的震颤、出汗、瞳孔缩小等。如有机磷中毒后出现的震颤、出汗、瞳孔缩小等。 中毒中毒是在各种毒物作用下，在局部或全身的综合表现。是在各种毒物作用下，在局部或全身的综合表现。 （1）毒效应或毒性作用）毒效应或毒性作用 化学物引起生物有机体的损伤的总称为化学物引起生物有机体的损伤的总称为毒性作用或毒效毒性作用或毒效应应。可用相关生理生化指标表示。如有机磷农药对胆碱酯。可用相关生理生化指标表示。如有机磷农药对胆碱酯酶活性的抑制；苯抑制造血功能而引起贫血。酶活性的抑制；苯抑制造血功能而引起贫血。19 （2）毒物反应（）毒物反应（react

18、ion） 指接触化学物质后，表现某种效应的个体在一个群体指接触化学物质后，表现某种效应的个体在一个群体中所占的比例。中所占的比例。 （3）毒物危险性）毒物危险性和危害性和危害性 1）毒物毒物危危险险性性 指某一化学物质指某一化学物质在正常在正常生产、使用生产、使用过程中，能引起有机过程中，能引起有机体发生体发生中毒的可能性中毒的可能性，称毒物称毒物危险性危险性 ，是是毒物毒物对个人或群体对个人或群体的毒性效应和产生疾病甚至死亡的的毒性效应和产生疾病甚至死亡的定量估计定量估计。20 2）毒物危害性毒物危害性：指有毒物质与有机体指有毒物质与有机体接触和使用接触和使用过程中，过程中，有引起有引起中毒

19、的可能性中毒的可能性，称称毒物危害性，用来毒物危害性，用来定性定性表示毒物表示毒物对人群健康引起的有害作用。对人群健康引起的有害作用。 物质危害性的大小一般与物质进入体内的能力和数量物质危害性的大小一般与物质进入体内的能力和数量有关，挥发性小，易溶于水或血液中，并能迅速达到中毒有关，挥发性小，易溶于水或血液中，并能迅速达到中毒浓度的物质的危害性大。浓度的物质的危害性大。 21（二）毒性参数（二）毒性参数 1、常用毒性参数、常用毒性参数 （1）致死剂量或致死浓度）致死剂量或致死浓度(LD，lethal dose or LC，lethal concentration) 绝对致死剂量或浓度绝对致死剂

20、量或浓度 （LD100，Absolute lethal dose or LC100 ，Absolute lethal concentration） 指一群动物全部死亡的最低剂量或浓度。指一群动物全部死亡的最低剂量或浓度。 半致死剂量或浓度（半致死剂量或浓度（LD50，Median lethal dose or LC50， Median lethal concentration） 指能引起一群动物死亡指能引起一群动物死亡50%的最低剂量或浓度。的最低剂量或浓度。 22 最小致死剂量或浓度（最小致死剂量或浓度（MLD，Minimum lethal dose，MLC，Minimum lethal c

21、oncentration）：）： 能使一群动物仅个能使一群动物仅个别死亡的最高剂量或浓度。别死亡的最高剂量或浓度。 (2)最大耐受剂量和最大无作用剂量最大耐受剂量和最大无作用剂量 最大耐受剂量或浓度（最大耐受剂量或浓度（MTD0，Maximum tolerance dose or MTC0，Maximum tolerance concentration） 能使一群动物虽然发生严重中毒，但全部存活无一死亡的能使一群动物虽然发生严重中毒，但全部存活无一死亡的最高剂量或浓度。最高剂量或浓度。23 最大无作用剂量（最大无作用剂量（Maximum no effect dose） 污染物对生物产生效应随污

22、染物浓度或剂量的降低而减污染物对生物产生效应随污染物浓度或剂量的降低而减弱，当外来化学物剂量弱，当外来化学物剂量减到一定量减到一定量时，生物学变化已达到时，生物学变化已达到0，不能观察到任何损害作用的最高剂量不能观察到任何损害作用的最高剂量称最大无作用剂量。称最大无作用剂量。 其是制订其是制订人体每日容许摄入量人体每日容许摄入量、最高容许浓度最高容许浓度和评定污和评定污染物毒性作用的主要依据。染物毒性作用的主要依据。24 最小有作用剂量（最小有作用剂量（Minimal effect level） 指能使有机体发生某种异常变化所需的最小剂量。其一般指能使有机体发生某种异常变化所需的最小剂量。其一

23、般大于最大无作用剂量，因此又称中毒阈剂量。大于最大无作用剂量，因此又称中毒阈剂量。 半数效应浓度半数效应浓度(EC50, Median effect concentration) 指能引起指能引起50%受试生物的某种效应变化的浓度。受试生物的某种效应变化的浓度。 半数抑制浓度半数抑制浓度(IC50, Median inhibition concentration) 指能引起受试生物的某种效应指能引起受试生物的某种效应50%抑制的浓度。抑制的浓度。25（3）毒作用带（）毒作用带（Toxic effect zone）：是恒量污染物：是恒量污染物危险危险性性大小的一个指标。大小的一个指标。 急性毒性

24、作用带急性毒性作用带：为半致死量与急性毒性最小有作为半致死量与急性毒性最小有作用剂量的比值。用剂量的比值。 此值愈大，污染物危险性愈小，反之危此值愈大，污染物危险性愈小，反之危险性愈大。险性愈大。26 慢性毒性作用带慢性毒性作用带： 是恒量毒物急、慢性毒性的一个指标，急性毒性最是恒量毒物急、慢性毒性的一个指标，急性毒性最小有作用剂量与慢性毒性最小有作用剂量之比。小有作用剂量与慢性毒性最小有作用剂量之比。 比值愈小，表明引起急性中毒的危险性相对较大。反比值愈小，表明引起急性中毒的危险性相对较大。反之，引起慢性毒性中毒的可能性愈大。之，引起慢性毒性中毒的可能性愈大。272、毒物单位与分级、毒物单位

25、与分级 （1）毒物单位（浓度）：）毒物单位（浓度）：毒物在空气中的浓度以毒物在空气中的浓度以mg/m3或或mg/L表示；表示； 哺乳动物以哺乳动物以mg/Kg或或ml/kg体重表示；水环境中体重表示；水环境中的毒物以的毒物以mg/L或或g/L表示。表示。 （2）毒物分级）毒物分级：毒物：毒物毒性的大小与半数致死量成反比毒性的大小与半数致死量成反比，但，但不同化合物之间毒性差别很大，可达百万甚至几千万倍。不同化合物之间毒性差别很大，可达百万甚至几千万倍。 为了加强毒物在生产、运输、使用和贮存方面的管理；为了加强毒物在生产、运输、使用和贮存方面的管理；便于制订和比较环境质量标准；在发生意外时便于制

26、订和比较环境质量标准；在发生意外时, 采取相应的采取相应的保护措施，必须对毒物进行分级。保护措施，必须对毒物进行分级。 28 1）我国工业毒物急性毒性分级）我国工业毒物急性毒性分级 29 2）我国农药急性毒性分级）我国农药急性毒性分级 30 3）水生生物评价体系）水生生物评价体系 31二、毒性试验二、毒性试验（一）急性毒性试验（一）急性毒性试验 指研究化学物质大剂量指研究化学物质大剂量一次染毒一次染毒或者说或者说24h内多次染毒内多次染毒，动物所引起的毒性试验。动物所引起的毒性试验。 目的：为了在短期内了解某物质的目的：为了在短期内了解某物质的毒性大小毒性大小，需做急，需做急性毒性试验性毒性试

27、验(Acute toxicity test) 。 有哺乳动物急性毒性试验、水生生物急性毒性试验和有哺乳动物急性毒性试验、水生生物急性毒性试验和蚯蚓急性毒性试验。蚯蚓急性毒性试验。321、哺乳动物急性毒性试验、哺乳动物急性毒性试验： （1）实验材料：小鼠和大鼠，若）实验材料：小鼠和大鼠，若进进行毒物皮试实验，还可行毒物皮试实验，还可用家兔和豚鼠。用家兔和豚鼠。（2）确定动物全活和全致死量）确定动物全活和全致死量 查阅文献中与受试物的类似物的查阅文献中与受试物的类似物的LD50 (LC50)，一般以，一般以3倍之差配制三个剂量组进行预试验（倍之差配制三个剂量组进行预试验（1/3 LD50 ， LD

28、50 ,3 LD50 ），每组），每组3只动物，求出全致死量和全活剂量。只动物，求出全致死量和全活剂量。3334 （3）在预试验的全活量和全致死量之间，以各组间距）在预试验的全活量和全致死量之间，以各组间距1.2 1.5的的“等比级数等比级数”，计设，计设56个剂量组，进行染毒。观察个剂量组，进行染毒。观察2周内的死亡情况。周内的死亡情况。 （4）病理解剖检查：剖检死亡或濒死动物及部分存活的动）病理解剖检查：剖检死亡或濒死动物及部分存活的动物，物， 计算计算LD50或或LC50。 （5）依急性毒性分级标准，根据）依急性毒性分级标准，根据LD50或或LC50，评定毒物的，评定毒物的毒性，毒性，

29、LD50值愈小，毒性愈大。值愈小，毒性愈大。352、水生生物急性毒性试验、水生生物急性毒性试验 根据试验对象，可分为鱼类、水蚤类和藻类毒性试验。根据试验对象，可分为鱼类、水蚤类和藻类毒性试验。 （1）实验用鱼）实验用鱼：选择有区域代表性、便于实验饲养、对物质敏：选择有区域代表性、便于实验饲养、对物质敏感的鱼苗，如青、草、鲢及鳙四大淡水鱼。体长一般小于感的鱼苗，如青、草、鲢及鳙四大淡水鱼。体长一般小于7 cm为宜。有时还可用体长小于为宜。有时还可用体长小于3 cm的金鱼。的金鱼。 （2）实验条件）实验条件：采用玻璃缸或白搪瓷桶。盛水量以每条：采用玻璃缸或白搪瓷桶。盛水量以每条2 3L水为宜，水为

30、宜，pH6.7 8.5， 冷水温度冷水温度12 18 ，温水温度，温水温度20 28 ，水温变化，水温变化 2 ，水中溶解氧不能低于，水中溶解氧不能低于4 mg/L，可用清洁河水、，可用清洁河水、湖水或放置湖水或放置3天的自来水。天的自来水。3637（3）LC50测定测定 1）确定鱼全活和全致死量：）确定鱼全活和全致死量： 方法同哺乳动物，也从文献方法同哺乳动物，也从文献中查阅与受试物的类似物的中查阅与受试物的类似物的LD50 (LC50)，做预试验，确定全，做预试验，确定全致死量和全活剂量。致死量和全活剂量。 2）以此浓度范围，按）以此浓度范围，按“等对数间距等对数间距”确定确定57个浓度组

31、。个浓度组。每组每组1020尾鱼，染毒尾鱼，染毒4896 h。染毒刚开始。染毒刚开始8 h内经常观察，内经常观察，以后作以后作24、48、72和和96小时定期观察，记录中毒反应和死亡小时定期观察，记录中毒反应和死亡时间。时间。 （实验期间注意保持水体溶解氧、（实验期间注意保持水体溶解氧、pH、水温的稳定，、水温的稳定，并立即取出死鱼）。并立即取出死鱼）。 3）根据）根据24、48和和96 h 各组鱼的死亡数，计算各组鱼的死亡数，计算LC50。38（二）亚慢性毒性试验（二）亚慢性毒性试验（Subchronic toxicity test） 人类接触的环境污染物水平通人类接触的环境污染物水平通常低

32、于急性中毒剂量常低于急性中毒剂量或浓或浓度，为了得到更接近实际情况的毒作用资料，需进行亚慢性度，为了得到更接近实际情况的毒作用资料，需进行亚慢性和慢性毒性试验。和慢性毒性试验。 在较长时期内（约动物生命周期的在较长时期内（约动物生命周期的1/301/20），使动物），使动物每日或反复多次染毒每日或反复多次染毒所进行的实验。所进行的实验。 目的是为对毒物的目的是为对毒物的毒作用机理、靶器官毒作用机理、靶器官和和最大无作用剂量最大无作用剂量或中毒阈值或中毒阈值作出估计。作出估计。 391、动物选择、动物选择 （1）一般选用对毒物敏感的动物种和品系，且应与慢性）一般选用对毒物敏感的动物种和品系，且应

33、与慢性毒性作用试验中预计使用的动物相同。毒性作用试验中预计使用的动物相同。 （2）要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种，）要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种，啮齿动物常用鼠和兔，非啮齿常用狗和猫。这样可更全面啮齿动物常用鼠和兔，非啮齿常用狗和猫。这样可更全面了解受试物的毒草效应。了解受试物的毒草效应。40（3）动物大小、只数和雌雄）动物大小、只数和雌雄 选用健康、年幼的动物。小鼠约选用健康、年幼的动物。小鼠约1417g，大鼠，大鼠5080g，家兔和猫体重约家兔和猫体重约12 kg，狗体重为，狗体重为58 Kg。各动物体重不。各动物体重不应超过组平均体重的应超过组平均体重的20

34、%。 大鼠各组不少于大鼠各组不少于20只，兔、猫和狗较大动物不少于只，兔、猫和狗较大动物不少于46只。只。 雌雄各半。雌雄各半。 412、染毒剂量和实验期限、染毒剂量和实验期限 （1）染毒剂量）染毒剂量:一般用一般用LD50或或LC50的的1/80 1/50作为亚慢作为亚慢性试验剂量，也设三个剂量组。性试验剂量，也设三个剂量组。1）高剂量组：能引起明）高剂量组：能引起明显的中毒反应，但又不引起很多动物死亡为高剂量组。显的中毒反应，但又不引起很多动物死亡为高剂量组。2）低剂量组：不引起任何中毒反应为低剂量组。）低剂量组：不引起任何中毒反应为低剂量组。3）中间）中间剂量组：介于二者之间。剂量组：介

35、于二者之间。 （2）实验期限）实验期限:试验期限随目的和要求或动物大小而异。试验期限随目的和要求或动物大小而异。大鼠可大鼠可90天，较大动物可天，较大动物可46月。月。42 3、染毒途径、染毒途径 主要经胃肠道、呼吸道和皮肤接触。注意：染毒途径主要经胃肠道、呼吸道和皮肤接触。注意：染毒途径应与预期进行的慢性毒性作用试验相一致。应与预期进行的慢性毒性作用试验相一致。 4、指标观察与检查、指标观察与检查： 3个个 （1）综合指标观察：）综合指标观察：1）观察动物的一般活动、症状和）观察动物的一般活动、症状和死亡情况。死亡情况。 2）每周称重一次，记录饲料或饮水量，计算）每周称重一次，记录饲料或饮水

36、量，计算生长率（各组每周摄入食量与体重增加量之比）。生长率（各组每周摄入食量与体重增加量之比）。3）各）各脏器鲜重与单位体重的比重（脏器系数）。脏器鲜重与单位体重的比重（脏器系数）。43 （2）血液及生化检查：）血液及生化检查： 主要指血清、肝和肾功能检验。主要指血清、肝和肾功能检验。 常规项目包括血红蛋白、红、白细胞数、血小板数、常规项目包括血红蛋白、红、白细胞数、血小板数、谷草转氨酶、血清尿素氮等。谷草转氨酶、血清尿素氮等。 （3）病理组织学检查：）病理组织学检查： 尸检死亡和濒死的动物，以及尸检死亡和濒死的动物，以及实验结束后的被处死的动物。主要对肝、肾、睾丸等实验结束后的被处死的动物。

37、主要对肝、肾、睾丸等器官进行检查。必要时还需进行组织化学和电镜检查。器官进行检查。必要时还需进行组织化学和电镜检查。44 5、试验评价、试验评价 对受试物的主要毒作用、靶器官和最大无作用剂量及中对受试物的主要毒作用、靶器官和最大无作用剂量及中毒阈剂量作出初步估价，并为进一步开展慢性毒性试验毒阈剂量作出初步估价，并为进一步开展慢性毒性试验提供依据。提供依据。 45（三）慢性毒性试验（三）慢性毒性试验(哺乳动物哺乳动物)（Chronic toxicity test） 以以低剂量低剂量外来化合物，外来化合物，长期长期与试验动物接触，观察其与试验动物接触，观察其对试验动物所产生的生物学效应的试验。对试

38、验动物所产生的生物学效应的试验。 目的是确定目的是确定最大无作用剂量，最大无作用剂量，为制订人体每日允许摄为制订人体每日允许摄入量入量(ADI，Allowable daily intake)和和最高容许浓度最高容许浓度(MAC，Maximum allowable concentration)提供毒理学依据。提供毒理学依据。 有哺乳动物、水生生物慢性毒性试验。有哺乳动物、水生生物慢性毒性试验。 461、试验动物和分组、试验动物和分组 1）试验动物的年龄应低于亚慢性试验。）试验动物的年龄应低于亚慢性试验。 一般选用断奶动物，如出生后一般选用断奶动物，如出生后3周的小鼠，体重约周的小鼠，体重约10

39、12g，出生后，出生后34周的大鼠，体重周的大鼠，体重5070g。 2）试验动物雌雄各半。）试验动物雌雄各半。 其它与亚慢性试验相同。其它与亚慢性试验相同。47 2、染毒剂量和实验期限、染毒剂量和实验期限 根据亚慢性试验，取其最低中毒剂量的根据亚慢性试验，取其最低中毒剂量的1/10、1/20和和1/50或或LD50的的1/1001/20中取中取34个剂量作为慢性试验剂量。个剂量作为慢性试验剂量。 （1）高剂量组：能引起明显的中毒反应为高剂量组。）高剂量组：能引起明显的中毒反应为高剂量组。 （2）低剂量组：不引起中毒反应为低剂量组。）低剂量组：不引起中毒反应为低剂量组。 （3）中间剂量组：介于二

40、者之间。）中间剂量组：介于二者之间。 试验期限：一般试验期限：一般112月，若是致癌实验则需月，若是致癌实验则需18 24月。月。483、染毒途径、染毒途径 经胃肠道、呼吸道和皮肤接触同亚慢性试验经胃肠道、呼吸道和皮肤接触同亚慢性试验4、观察指标、观察指标 基本同亚慢性试验，此外：基本同亚慢性试验，此外： （1）在试验的第）在试验的第1个月，每周称体重一次，在个月，每周称体重一次，在46个月期间，个月期间，每每2周称体重一次，以后每周称体重一次，以后每4周称体重一次。周称体重一次。 （2）每）每2月进行一次血液及其它生长指标月进行一次血液及其它生长指标(生长率、脏器系生长率、脏器系数数)测定。

41、测定。 （3）对病理检查作半定量评定，即随染毒时间的延长，器）对病理检查作半定量评定，即随染毒时间的延长，器官形态结构会发生变化，需根据病变程度加以分级评分。官形态结构会发生变化，需根据病变程度加以分级评分。 49505、试验评价、试验评价:评价受试物在低剂量长时间接触有机体时所评价受试物在低剂量长时间接触有机体时所引起的毒性作用。有引起的毒性作用。有2个方面：个方面： 1）依据敏感观察指标，出现异常的最小阈剂量，找出该）依据敏感观察指标，出现异常的最小阈剂量，找出该受试物的慢性毒作用的最大无作用剂量，为受试物能否可受试物的慢性毒作用的最大无作用剂量，为受试物能否可被应用或为制订其在环境中的卫

42、生标准，提供依据。被应用或为制订其在环境中的卫生标准，提供依据。 2）通过对动物的一般观察及其对各脏器的病理学检查，）通过对动物的一般观察及其对各脏器的病理学检查，对受试物的致癌性评定提供依据。对受试物的致癌性评定提供依据。51（四）蓄积毒性试验（四）蓄积毒性试验 1、 低于中毒阈剂量低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次地与机体持的外来化合物，反复多次地与机体持续接触，经续接触，经一定时间一定时间后使机体出现明显的中毒表现，即为后使机体出现明显的中毒表现，即为蓄蓄积毒性作用积毒性作用(Cumulative toxicity action)。 （1）物质蓄积）物质蓄积：环境污染物不断进入有机体，

43、若吸收量：环境污染物不断进入有机体，若吸收量大于排出量，使其在体内的量逐渐积累增多。大于排出量，使其在体内的量逐渐积累增多。 （2）功能蓄积）功能蓄积：不断进入有机体的污染物反复作用于机：不断进入有机体的污染物反复作用于机体，引起机体一定结构或功能的变化，并逐渐累积加重，最体，引起机体一定结构或功能的变化，并逐渐累积加重，最后导致出现损害作用。后导致出现损害作用。522、试验方法、试验方法（1）蓄积系数法）蓄积系数法（Cumulative Coefficient method） 蓄积系数蓄积系数（Cumulative Coefficient）：指多次给受试物）：指多次给受试物后，引起后，引起5

44、0%受试动物出现某种毒效应的总剂量受试动物出现某种毒效应的总剂量 ( ) ，与一次给受试物后引起与一次给受试物后引起50%受试动物出现受试动物出现同一毒效应同一毒效应的剂的剂量（量（ ）的比值。）的比值。 比值愈大，说明引起比值愈大，说明引起50%动物出现某种毒效应的使用剂动物出现某种毒效应的使用剂量较大，药物代谢作用强，而蓄积作用较小，反之，表示量较大，药物代谢作用强，而蓄积作用较小，反之，表示蓄积作用愈强。蓄积作用愈强。53 54有两种实验方法测定有两种实验方法测定K1）固定剂量每天连续染毒法）固定剂量每天连续染毒法 对受试动物以对受试动物以1/101/20 LD50的固定剂量，每天进行染

45、毒的固定剂量，每天进行染毒一次，观察记录动物死亡情况。一次，观察记录动物死亡情况。 当染毒累计达当染毒累计达5个个LD50以上时，若受试动物死亡数未超以上时，若受试动物死亡数未超过半数，此时的蓄积系数已大于过半数，此时的蓄积系数已大于5，表明该受试动物的蓄积，表明该受试动物的蓄积作用不明显。作用不明显。 552）剂量定期递增染毒法）剂量定期递增染毒法 取一组受试动物，每天染毒一次，以取一组受试动物，每天染毒一次，以4天为一期天为一期，开始，开始的第一期每天染毒剂量为的第一期每天染毒剂量为1/10 LD50,随后染毒剂量每隔随后染毒剂量每隔4天天按按1.5倍倍递增一次。递增一次。 56 每天记录

46、动物的死亡情况，若连续染毒已达每天记录动物的死亡情况，若连续染毒已达20天，此时天，此时,每天的染毒剂量每天的染毒剂量0.5 LD50(=1.54LD50/10)，累计总剂量达，累计总剂量达(1+1.5+1.52+1.53+1.54) 4 LD50/10 = 5.30LD50。 如果受试动物死亡未达到如果受试动物死亡未达到50%,则表示该受试物的蓄积作则表示该受试物的蓄积作用不明显，试验可停止。如果受试动物出现死亡达用不明显，试验可停止。如果受试动物出现死亡达50%，就可算出染毒系数就可算出染毒系数K。57 （2）20天蓄积试验法天蓄积试验法 按的按的LD50 的的1/20、1/10、1/5、

47、1/2和和0随机分成随机分成5组，每天组，每天对动物进行染毒，连续对动物进行染毒，连续20天，各组总剂量分别为天，各组总剂量分别为0、1、2、4、10 LD50。观察停药。观察停药7天内的死亡情况。天内的死亡情况。 1）如）如1/2 LD50组有死亡，且各剂量组呈剂量组有死亡，且各剂量组呈剂量-反应关系，反应关系，则受试动物有较强的蓄积作用。则受试动物有较强的蓄积作用。 2）若）若1/20 LD50组有死亡，且各剂量组呈剂量组有死亡，且各剂量组呈剂量-反应关系，反应关系，则为中等蓄积作用。则为中等蓄积作用。 3）若）若1/20 LD50组无死亡，且各剂量组无剂量组无死亡，且各剂量组无剂量-反应

48、关系，反应关系，则为无明显蓄积作用。则为无明显蓄积作用。 58（3）受试物生物半减期测定法）受试物生物半减期测定法 生物半减期（生物半减期（T 1/2）：）：指一种外来化合物在体内的量或指一种外来化合物在体内的量或浓度下降到原来浓度或量的一半所需的时间。浓度下降到原来浓度或量的一半所需的时间。T 1/2越大，越大，表明在体内存留时间越长，蓄积作用越大。表明在体内存留时间越长，蓄积作用越大。 测定方法：机体接触污染物后，在间隔一定时间内分别测定方法：机体接触污染物后，在间隔一定时间内分别测定血液、尿液、器官组织中该物质的浓度，然后求出测定血液、尿液、器官组织中该物质的浓度，然后求出T 。 （y1

49、和和y2分别是分别是t1和和t2时间测得该物质的浓度）时间测得该物质的浓度）59 第三节第三节 生物致突变、致畸和致癌效应检测生物致突变、致畸和致癌效应检测一、生物致突变一、生物致突变 1、突变、突变：生物体的遗传物质发生了基因结构的改变称为：生物体的遗传物质发生了基因结构的改变称为突变（突变（mutation）。）。 可分为可分为基因突变基因突变和和染色体突变染色体突变两大类，此两类突变本质两大类，此两类突变本质上无差异，只是染色体突变可凭光学显微镜观察。上无差异，只是染色体突变可凭光学显微镜观察。 602、突变意义、突变意义 （1）农业作物育种：在农业生产中，农作物就是通过定向）农业作物育

50、种：在农业生产中，农作物就是通过定向突变筛选获得优良品种。突变筛选获得优良品种。 （2）从理论上讲，突变可能会出现有益的后果，但由于）从理论上讲，突变可能会出现有益的后果，但由于概率极小，且无法鉴别和控制，所以，外来化学物对人类概率极小，且无法鉴别和控制，所以，外来化学物对人类引起的致突变可能有很大的引起的致突变可能有很大的潜在危险潜在危险。 所以，从毒理学角所以，从毒理学角度，突变一般认为是外来化合物度，突变一般认为是外来化合物毒性作用的表现毒性作用的表现。61 3、致突变试验试验方法、致突变试验试验方法 致突变试验：可分致突变试验：可分基因点突变试验、染色体畸变试验基因点突变试验、染色体畸

51、变试验和和DNA损伤试验损伤试验等，可在活体或体外进行。等，可在活体或体外进行。 有（有（1）体外基因突变试验，（）体外基因突变试验，（2）细胞遗传学实验，）细胞遗传学实验，（3）体内基因突变试验，（）体内基因突变试验，（4）DNA损伤试验等。损伤试验等。 62（一）体外基因突变试验（一）体外基因突变试验（In vitro mutation test） 1、鼠伤寒沙门氏菌试验法、鼠伤寒沙门氏菌试验法 （1）基本原理）基本原理 将一种营养缺陷型如将一种营养缺陷型如不能合成不能合成组氨酸组氨酸的鼠伤寒沙门氏的鼠伤寒沙门氏菌和化学致突变物接触，若此化合物是致突变性的，则可菌和化学致突变物接触，若此化

52、合物是致突变性的，则可使此突变微生物发生使此突变微生物发生回复突变回复突变，重新成为野生型，而能在，重新成为野生型，而能在不含或少含不含或少含His的培养基中生长。据此鉴定化合物的致突的培养基中生长。据此鉴定化合物的致突变作用。变作用。 为使受试物在体外测试中获得同为使受试物在体外测试中获得同活体类似的代谢活性活体类似的代谢活性，在培养基中常加入哺乳动物肝细胞的在培养基中常加入哺乳动物肝细胞的微粒体微粒体和和受氢系统受氢系统。63（2）方法优缺点）方法优缺点 优点：方法简单；快速，一般在优点：方法简单；快速，一般在48 h内可得出结论；费用内可得出结论；费用低；灵敏，检测结果与动物致癌性相符率

53、达低；灵敏，检测结果与动物致癌性相符率达90%。 缺点：缺点：1）微生物的遗传信息含量低，仅为哺乳动物的微生物的遗传信息含量低，仅为哺乳动物的1/6。2）微生物）微生物DNA修复系统没有哺乳动物复杂而精巧。修复系统没有哺乳动物复杂而精巧。3）微生物无免疫功能。微生物无免疫功能。4）对于不在肝脏代谢转化的化合物，）对于不在肝脏代谢转化的化合物，如苏铁素，不能检测其突变性。如苏铁素，不能检测其突变性。642、哺乳动物体细胞株突变试验、哺乳动物体细胞株突变试验 基本原理：有些哺乳动物基本原理：有些哺乳动物突变细胞株系突变细胞株系，当与化学致，当与化学致突变物接触后会发生回复突变，代谢发生改变，依此确

54、定突变物接触后会发生回复突变，代谢发生改变，依此确定毒物的致突变性。毒物的致突变性。 常用细胞突变系：中国地鼠肺细胞常用细胞突变系：中国地鼠肺细胞V79、中国地鼠卵巢、中国地鼠卵巢细胞株细胞株CHO和小鼠淋巴瘤和小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株等。细胞株等。65（1）肺细胞）肺细胞V79和卵巢细胞株和卵巢细胞株CHO细胞突变株系细胞突变株系 由于嘌呤碱类似物如由于嘌呤碱类似物如6-巯基嘌呤可抑制巯基嘌呤可抑制DNA的合成，的合成，正常细胞株系生长会受到抑制。而正常细胞株系生长会受到抑制。而 V79和和CHO细胞突变细胞突变株系由于缺乏株系由于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖

55、基转移酶(HGPRT)，当在培养基中加入某些嘌呤碱类似物如，当在培养基中加入某些嘌呤碱类似物如6-巯巯基嘌呤等时，它们仍能生长。基嘌呤等时，它们仍能生长。 当当V79和和CHO细胞突变系与这些嘌呤碱类似物接触细胞突变系与这些嘌呤碱类似物接触后，会发生后，会发生回复突变回复突变成正常株，成正常株， 生长受到抑制，说明发生长受到抑制，说明发生了致突变。生了致突变。 66 （2）小鼠淋巴瘤）小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株细胞株 此此细胞株系缺乏细胞株系缺乏胸苷激酶胸苷激酶(TK), 如在培养基中加入细胞如在培养基中加入细胞毒素毒素5-溴脱氧尿苷溴脱氧尿苷，仍能生长。，仍能生长。 但当此种细胞系与致突变

56、物接触后会发生但当此种细胞系与致突变物接触后会发生回复突变回复突变，又转化为正常细胞，而恢复对此毒素的利用，而抑制其生又转化为正常细胞，而恢复对此毒素的利用，而抑制其生长。说明发生了致突变。长。说明发生了致突变。67（二）（二）细胞遗传学实验细胞遗传学实验 (Cytogenetics Test) 1、 染色体染色体畸变试验畸变试验(Chromosome aberration test) 利用光学显微镜直接观察生物体细胞在受致突变物作用利用光学显微镜直接观察生物体细胞在受致突变物作用后后,染色体数目和结构染色体数目和结构的变化。的变化。 (1)离体试验离体试验：常用：常用中国地鼠卵巢细胞株中国地

57、鼠卵巢细胞株CHO （缺乏次（缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)和和人类外周血人类外周血（指进入血（指进入血液循环的血液，即液循环的血液，即平时所采血平时所采血），检测），检测卵巢细胞株卵巢细胞株CHO和和人类淋巴细胞人类淋巴细胞的染色体变化。的染色体变化。 (2)体内试验体内试验：常检查骨髓细胞、胸腺、脾、精原细胞的：常检查骨髓细胞、胸腺、脾、精原细胞的染色体的畸变。染色体的畸变。 68CHO细胞系或人类淋巴细胞染色体畸变分析细胞系或人类淋巴细胞染色体畸变分析 1）选用细胞培养液如）选用细胞培养液如DMEM、RPM或或1640任一种，加任一种，加入化学致突变物，

58、在入化学致突变物，在3下，培养下，培养CHO（缺乏次黄嘌呤鸟嘌（缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶呤磷酸核糖基转移酶)细胞细胞24 h或人类淋巴细胞为或人类淋巴细胞为72 h。 2）在收获细胞前）在收获细胞前2 h，向培养液中加入，向培养液中加入秋水仙碱秋水仙碱，以终止，以终止细胞分裂，使细胞分裂同步于分裂中期。细胞分裂，使细胞分裂同步于分裂中期。 3）离心得到沉淀细胞，然后制片）离心得到沉淀细胞，然后制片镜检有无染色体畸变镜检有无染色体畸变。 4）观察染色体有）观察染色体有无断裂、缺失、易位、形成环状结构无断裂、缺失、易位、形成环状结构等等畸变，畸变， 以及出现多处断裂的百分率。以及出现多处

59、断裂的百分率。6970染色体畸变结果评定染色体畸变结果评定 确定受试物能否引起染色体确定受试物能否引起染色体损伤或数目的改变损伤或数目的改变，以及要确，以及要确定有这些改变的细胞能否存活定有这些改变的细胞能否存活一个细胞周期以上一个细胞周期以上。 1）一些小缺失和相互易位的畸变，因其可能长期存在而比）一些小缺失和相互易位的畸变，因其可能长期存在而比大缺失有更大的危险性。大缺失有更大的危险性。 2）染色体断裂、缺失、易位、形成环状结构等是）染色体断裂、缺失、易位、形成环状结构等是染色体开染色体开放性断裂放性断裂的结果，但也可能是的结果，但也可能是断裂后修复断裂后修复的结果。的结果。 3） 有些化

60、合物只作用于有些化合物只作用于细胞分裂某一时期细胞分裂某一时期，故试验时要注，故试验时要注意收获时间。意收获时间。 712、微核试验（、微核试验（Micronucleus test） （1）微核形成）微核形成 核膜受损核膜受损：在受化学致突变作用下，若核膜受损，核物质：在受化学致突变作用下，若核膜受损，核物质会向外突出延伸，形成一个或几个规则圆形或椭圆形小体，会向外突出延伸，形成一个或几个规则圆形或椭圆形小体，称微核。称微核。 纺锤体受伤纺锤体受伤：由于：由于纺锤体受伤纺锤体受伤或染色体的或染色体的无着丝点断裂无着丝点断裂，受伤染色体在分裂后期受伤染色体在分裂后期仍停留在细胞质仍停留在细胞质，

61、而形成微核结构。，而形成微核结构。 有有动物细胞微核率试验动物细胞微核率试验、细胞培养微核试验细胞培养微核试验和和蚕豆根尖蚕豆根尖微核试验微核试验等。等。7273 （2）动物细胞微核率试验）动物细胞微核率试验 1）骨髓嗜多染红细胞微核试验）骨髓嗜多染红细胞微核试验 以颈椎以颈椎脱臼脱臼处死动物，用处死动物，用小牛血清小牛血清将将骨髓细胞骨髓细胞冲洗入离冲洗入离心管。离心，弃去上清液，留少量血清悬浮细胞后进行涂片。心管。离心，弃去上清液，留少量血清悬浮细胞后进行涂片。甲醇固定、甲醇固定、Giemsa染色（染色（核染色核染色）后进行观察。）后进行观察。 每只动物要求观察计数每只动物要求观察计数10

62、00个嗜多染红细胞个嗜多染红细胞，求出出现，求出出现微核细胞的频率。微核细胞的频率。742）外周血淋巴细胞微核试验）外周血淋巴细胞微核试验 取人或动物的外周血取人或动物的外周血23滴滴(骨髓外血），于盛有骨髓外血），于盛有1.5 ml Tris-NH4Cl缓冲液的离心管中，混匀后置于缓冲液的离心管中，混匀后置于37 下保温下保温5 h，使使红细胞溶解红细胞溶解。 取取5滴溶解液，混匀后离心，弃上清液，于沉淀物中再加滴溶解液，混匀后离心，弃上清液，于沉淀物中再加 5 ml固定液，放置固定液，放置10 min后离心，弃上清液，取沉淀物涂片，后离心，弃上清液，取沉淀物涂片，镜检。镜检。 75二、致畸

63、效应二、致畸效应（一）基本概念（一）基本概念1、致畸作用、致畸作用（Teratogenesis） 胚胎的细胞分化和器官形成不正常胚胎的细胞分化和器官形成不正常，而造成组织器官上，而造成组织器官上的缺陷，并出现肉眼可见的形态结构异常称的缺陷，并出现肉眼可见的形态结构异常称畸形畸形。致畸物。致畸物通过母体作用于胚胎，引起胎儿畸形的现象称通过母体作用于胚胎，引起胎儿畸形的现象称致畸作用。致畸作用。 目前已知目前已知1000多种环境因素可引起动物及人的畸胎。多种环境因素可引起动物及人的畸胎。60年代初，孕妇因服用年代初，孕妇因服用“反应停反应停”而导致近万名畸形儿。而导致近万名畸形儿。 许多国家对一些

64、药物、农药、食品添加剂、防腐剂以及许多国家对一些药物、农药、食品添加剂、防腐剂以及工业化学品规定应经过致畸试验。工业化学品规定应经过致畸试验。 7677 2、致畸作用的毒理学特点、致畸作用的毒理学特点 (1) 不同发育阶段的胚胎对致畸物有不同的敏感性，一般不同发育阶段的胚胎对致畸物有不同的敏感性，一般在胚胎形成早期，对致畸物最敏感。致畸物在接触胚胎时，在胚胎形成早期，对致畸物最敏感。致畸物在接触胚胎时，可因胚胎处于不同发育阶段而引起不同的畸形。可因胚胎处于不同发育阶段而引起不同的畸形。 (2) 不同种系的动物，由于代谢和胎盘结构的不同，对致不同种系的动物，由于代谢和胎盘结构的不同，对致畸物呈现

65、不同的敏感性。畸物呈现不同的敏感性。 （3）致畸作用剂量）致畸作用剂量-反应曲线很陡，最大无作用剂量与引反应曲线很陡，最大无作用剂量与引起胚胎死亡最低剂量仅相差起胚胎死亡最低剂量仅相差23倍。倍。 783、化学致畸作用机理、化学致畸作用机理 (1) 母体正常代谢过程受到破坏母体正常代谢过程受到破坏 致畸物使母体正常代谢过程受到破坏，使子代细胞在生物致畸物使母体正常代谢过程受到破坏，使子代细胞在生物合成过程中合成过程中缺乏必需的物质缺乏必需的物质，而影响胚胎的正常发育。，而影响胚胎的正常发育。(2)生殖细胞分裂过程的障碍生殖细胞分裂过程的障碍 致畸物可干扰细胞的分裂过程致畸物可干扰细胞的分裂过程

66、,引起引起生殖细胞减数分裂生殖细胞减数分裂或或合子的细胞合子的细胞有丝分裂过程有丝分裂过程的障碍的障碍,导致细胞死亡导致细胞死亡,胚胎出现畸胚胎出现畸形。形。 79 (3)突变引起胚胎体细胞发育异常突变引起胚胎体细胞发育异常 致畸物可使致畸物可使胚胎的体细胞胚胎的体细胞发生突变发生突变, 有时还可引起酶有时还可引起酶分子的氨基酸组成发生改变分子的氨基酸组成发生改变,而引起代谢功能的缺陷而引起代谢功能的缺陷, 胚胚胎致畸。胎致畸。 (4)通过抑制或破坏重要代谢酶的活性起作用通过抑制或破坏重要代谢酶的活性起作用 这些致畸物虽不影响生殖细胞减数分裂或细胞有丝分这些致畸物虽不影响生殖细胞减数分裂或细胞

67、有丝分裂或诱发染色体突变，但可通过抑制或破坏对细胞生长裂或诱发染色体突变，但可通过抑制或破坏对细胞生长分化较为重要的酶的活性分化较为重要的酶的活性,如如DNA聚合酶、核糖核苷酸还聚合酶、核糖核苷酸还原酶等原酶等活性，而影响胚胎的正常发育。活性，而影响胚胎的正常发育。80（二）试验方法（二）试验方法 致畸试验：是检测某些环境污染物能否通过妊娠母体致畸试验：是检测某些环境污染物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形的一种动物试验法。引起胚胎畸形的一种动物试验法。 1、动物选择要求、动物选择要求： (1) 选择与人类代谢相似的动物，并具与选择与人类代谢相似的动物，并具与人类相似人类相似的的胎胎盘结构盘结构，如

68、胎盘层数和厚度。，如胎盘层数和厚度。 (2)妊娠期短妊娠期短, 利于观察。利于观察。 (3) 产仔多产仔多, 以获得足够的标本。以获得足够的标本。(4)此外此外,还应符合试验还应符合试验动物的一般要求动物的一般要求,如体型小、易驯服、繁殖以及价廉。如体型小、易驯服、繁殖以及价廉。 一般选择大鼠和小鼠和家兔。一般选择大鼠和小鼠和家兔。812、剂量设定、剂量设定 (1) 受试物剂量的大小，应根据试验时给予受试物的次数受试物剂量的大小，应根据试验时给予受试物的次数及连续时间的长短而定，若试验期间只给一次，此时剂量及连续时间的长短而定，若试验期间只给一次，此时剂量稍大，反之则小。稍大，反之则小。 （2

69、）高剂量组，以不使母体产生明显中毒而导致流产为）高剂量组，以不使母体产生明显中毒而导致流产为限度。一般可以限度。一般可以LD50的的1/31/2为最高剂量组，为最高剂量组，LD50的的1/30 1/100为低剂量组。为低剂量组。 （3）试验动物数：均以经交配确定已受精的雌性动物为）试验动物数：均以经交配确定已受精的雌性动物为计数对象，每组不少于计数对象，每组不少于15 20只，家兔只，家兔7 8只。只。823、受试动物的处理、受试动物的处理 （1）动物受孕：选择一批性成熟，未交配过的雌鼠和）动物受孕：选择一批性成熟，未交配过的雌鼠和雄鼠，以一雄一雌或二雌一雄比例，同笼过夜，次日清晨雄鼠，以一雄

70、一雌或二雌一雄比例，同笼过夜，次日清晨检查雌鼠是否受孕。查到日为孕期检查雌鼠是否受孕。查到日为孕期0天，次日为第一天，天，次日为第一天，孕期约孕期约1月月。 （2）药物处理方法和时间：一般多采用）药物处理方法和时间：一般多采用灌胃灌胃方法，在方法，在胚胚胎敏感期胎敏感期给药。给药。 若若过早过早给予可影响受精卵着床，给予可影响受精卵着床，过迟过迟则则对发育成熟的胚胎往往不能显示致畸作用。对发育成熟的胚胎往往不能显示致畸作用。834、试验动物的解剖、试验动物的解剖（1）解剖时间：预计自然分娩前）解剖时间：预计自然分娩前12天为宜，天为宜， 以防止胎仔以防止胎仔自然分娩后被吃或被咬伤。可留自然分娩

71、后被吃或被咬伤。可留1/4的动物待其的动物待其自然分娩自然分娩，并将并将胎仔喂养到断奶胎仔喂养到断奶，进行仔细观察和检查。，进行仔细观察和检查。（2）解剖检查）解剖检查 1）胎仔外部检查：如活胎数、早、晚期死胎数和吸收胎）胎仔外部检查：如活胎数、早、晚期死胎数和吸收胎数；对活胎要检查性别、体重、身长、尾长及全窝胎盘总重数；对活胎要检查性别、体重、身长、尾长及全窝胎盘总重量等。量等。84 2）胎仔的骨骼检查）胎仔的骨骼检查 先用先用75%90%乙醇乙醇-1%KOH固定至固定至肌肉透明肌肉透明; 再用再用茜素茜素红红染色染色25d，至，至骨骼染成桃或紫红色骨骼染成桃或紫红色; 再经透明处理后，检再

72、经透明处理后，检查骨骼的形态、大小、数量有无异常及骨化程度。查骨骼的形态、大小、数量有无异常及骨化程度。 3）胎仔内脏检查）胎仔内脏检查 经外观检查后的活胎仔，按随机法，将胎仔数的经外观检查后的活胎仔，按随机法，将胎仔数的1/21/3置置于于Bouin氏液中氏液中固定固定12周后，取周后，取内脏和软组织如腭裂、肾等，内脏和软组织如腭裂、肾等，用徒手切片法制片用徒手切片法制片，观察结构变化。，观察结构变化。 P126，表，表3-11（外观畸形）；表（外观畸形）；表3-12（骨骼畸形）；表（骨骼畸形）；表3-13（脏器畸形）。（脏器畸形）。85 5、致畸作用的评价、致畸作用的评价 为科学的评价受试

73、物有无致畸作用。应注意：为科学的评价受试物有无致畸作用。应注意： (1) 试验结果中出现的畸形率高低试验结果中出现的畸形率高低, 须从出现须从出现畸胎的孕仔畸胎的孕仔率、胎仔发生畸形率、单项畸形率、总畸形率率、胎仔发生畸形率、单项畸形率、总畸形率等多方面进等多方面进行统计综合分析；比较试验组行统计综合分析；比较试验组与对照组有无差异与对照组有无差异；有；有无剂无剂量量-反应关系反应关系；而后才能作用评定。；而后才能作用评定。 (2) 同种动物重复试验和同种动物重复试验和多种动物试验多种动物试验的结果一致的结果一致,才能才能得出一致的结论。得出一致的结论。 86 (3)生物在正常情况下也有变异，

74、有时难以区分。但一般生物在正常情况下也有变异，有时难以区分。但一般致畸率高、有特异性、且有剂量致畸率高、有特异性、且有剂量-效应或反应关系，应作致效应或反应关系，应作致畸论。畸论。 (4)不同种系的动物对同种致畸物的致畸作用可能有差异。不同种系的动物对同种致畸物的致畸作用可能有差异。当在当在其它动物其它动物上试验的结果，和从上试验的结果，和从临床观察、流行病学调临床观察、流行病学调查等查等如果如果也获得同样的结果也获得同样的结果，才能下正确的结论。，才能下正确的结论。 87三、致癌效应三、致癌效应（一）基本概念（一）基本概念 目前的中国癌症诊断率目前的中国癌症诊断率6人人/min，其中有，其中

75、有1 人得肺癌。据人得肺癌。据估计人类肿瘤有估计人类肿瘤有80%90%与环境因素有关，其中化学因素与环境因素有关，其中化学因素有关者占有关者占80%85%，因此，化学致癌作用极其重要。，因此，化学致癌作用极其重要。 化学物质（有机、无机、合成）引起肿瘤的过程称化学化学物质（有机、无机、合成）引起肿瘤的过程称化学致癌作用。能诱发肿瘤的化学物质称致癌作用。能诱发肿瘤的化学物质称化学化学致癌物致癌物。88癌细胞的主要特征癌细胞的主要特征 1、丧失细胞、丧失细胞接触性接触性生长生长抑制抑制特性，恶性增长特性，恶性增长不死细胞不死细胞。 2、形态显著改变的、形态显著改变的变态细胞变态细胞。 3、细胞膜上

76、的糖蛋白减少，易在体内分散和转移。为细胞膜上的糖蛋白减少，易在体内分散和转移。为粘粘着性降低的着性降低的扩散细胞扩散细胞。 89癌变诱发因子：癌变诱发因子： 1、物理致癌因子：紫外线、物理致癌因子：紫外线、X射线、辐射等。射线、辐射等。 2、化学致癌因子：、化学致癌因子：1）无机物：砷化物、铬化物、镉化物、）无机物：砷化物、铬化物、镉化物、石棉等。石棉等。2）有机物：联苯胺、烯环烃、亚硝胺、黄曲霉）有机物：联苯胺、烯环烃、亚硝胺、黄曲霉毒素等。毒素等。 3、病毒致癌因子：、病毒致癌因子： 肝炎病毒：肝癌，肝炎病毒：肝癌， Rous肉瘤病毒肉瘤病毒 90 世界卫生组织下属的世界卫生组织下属的“国

77、际癌症研究中心国际癌症研究中心”对对900900多个因多个因素进行评估，素进行评估，公布公布116116种明确致癌物种明确致癌物和和6666种可能致癌物种可能致癌物（20162016年搜狐网）年搜狐网）。其中，明确致癌物中有：其中，明确致癌物中有： （1 1）食品类）食品类：酒精、烟草、发霉谷物或坚果（黄曲霉素）：酒精、烟草、发霉谷物或坚果（黄曲霉素）、槟榔果、槟榔果、烤熏食品烤熏食品（苯并芘）、（苯并芘）、火腿、培根火腿、培根等加工类肉食、等加工类肉食、自来水中的亚硝基二甲胺。自来水中的亚硝基二甲胺。 （2 2）环境类）环境类：空气污染（：空气污染（PM2.5) PM2.5) 、电离辐射、紫

78、外辐射、电离辐射、紫外辐射、劣质装修建材：苯和甲醛劣质装修建材：苯和甲醛 （3 3）致病菌）致病菌：肝炎病毒、幽门螺杆菌、人类乳头瘤病：肝炎病毒、幽门螺杆菌、人类乳头瘤病毒、华支睾吸虫（生鱼、螺）。毒、华支睾吸虫（生鱼、螺）。1、细胞癌变学说、细胞癌变学说 （1）体细胞突变说）体细胞突变说（Somatic mutation theory） 认为致癌因素作用于认为致癌因素作用于体细胞的遗传物质体细胞的遗传物质DNA，使其，使其发生突变，致使细胞功能发生异常，而致癌。发生突变，致使细胞功能发生异常，而致癌。92（2）分化障碍学说）分化障碍学说（Differentiatioin obstacle t

79、heory） 认为细胞癌变不一定需要体细胞认为细胞癌变不一定需要体细胞遗传物质发生突变遗传物质发生突变，而，而只是只是细胞分化细胞分化过程中过程中有关有关基因调控过程基因调控过程受到受到致癌因素的干扰，致癌因素的干扰，因而使因而使细胞分化和增殖发生紊乱细胞分化和增殖发生紊乱而出现癌变。而出现癌变。（3）癌基因学说）癌基因学说(Oncogene theory) 认为所有细胞都有癌基因认为所有细胞都有癌基因(oncogene)。在正常情况下这。在正常情况下这种癌基因处于阻遏状态，只有当细胞内有关调节机制遭到破种癌基因处于阻遏状态，只有当细胞内有关调节机制遭到破坏的时，癌基因才表达，而导致细胞发生癌

80、变。坏的时，癌基因才表达，而导致细胞发生癌变。933、癌变过程、癌变过程 一般经一般经3个阶段个阶段（1）引发阶段）引发阶段：即正常细胞转化为癌细胞的过程。：即正常细胞转化为癌细胞的过程。 当致癌物与细胞接触时，致癌物与当致癌物与细胞接触时，致癌物与DNA结合发生反应，结合发生反应，使细胞内遗传物质染色体或基因发生突变，也可能与蛋白质使细胞内遗传物质染色体或基因发生突变，也可能与蛋白质发生反应，使细胞中的基因控制过程发生改变，并出现代谢发生反应，使细胞中的基因控制过程发生改变，并出现代谢障碍，而形成癌变，为不可逆过程。障碍，而形成癌变，为不可逆过程。 94（2）促长阶段）促长阶段 癌变细胞不断

81、增殖直到形成一个临床上可被检出的肿块癌变细胞不断增殖直到形成一个临床上可被检出的肿块的过程。此过程需较长的时间，是一个可逆过程。的过程。此过程需较长的时间，是一个可逆过程。（3）浸润和转移阶段）浸润和转移阶段 已形成的癌肿块不断发展，逐渐侵害周围正常组织，经已形成的癌肿块不断发展，逐渐侵害周围正常组织，经血液循环或淋巴系统，扩散到其它较远的部位。血液循环或淋巴系统，扩散到其它较远的部位。96（二）试验方法（二）试验方法 致癌试验致癌试验：是检验受试物及其代谢产物，是否具有致：是检验受试物及其代谢产物，是否具有致癌作用或诱发肿瘤作用的慢性试验方法。癌作用或诱发肿瘤作用的慢性试验方法。 有有短期快

82、速筛选的试验方法短期快速筛选的试验方法和和长期动物诱癌试验长期动物诱癌试验。 971、短期筛检方法、短期筛检方法:（哺乳动物细胞体外转化法筛选）（哺乳动物细胞体外转化法筛选） 常用常用“原代叙利亚仓鼠胚胎细胞原代叙利亚仓鼠胚胎细胞”和和“小鼠小鼠C3H/10T1/2和和BALB/C-2T3细胞系细胞系”，当它们与各种化学或物理致癌物，当它们与各种化学或物理致癌物接触后，会发生表型如接触后，会发生表型如形态、核型、生长特性形态、核型、生长特性等改变，通等改变，通过增殖，可形成与正常细胞不同的集落，即过增殖，可形成与正常细胞不同的集落，即转化集落转化集落。 通过通过转化集落转化集落的的存在存在和和

83、形成率形成率，以及转化细胞，以及转化细胞接种到裸接种到裸鼠鼠中发生肿瘤，来评价化学物的致癌性。中发生肿瘤，来评价化学物的致癌性。9899 2、长期动物诱癌试验、长期动物诱癌试验 当经当经短期试验证明短期试验证明一种化学物质具一种化学物质具有潜在致癌性有潜在致癌性，或其化，或其化学学结构与某种已知致癌物十分近似结构与某种已知致癌物十分近似，又在人类社会中有实际，又在人类社会中有实际应用价值时，应进行长期动物诱癌试验。应用价值时，应进行长期动物诱癌试验。（1）试验动物及饲料要求）试验动物及饲料要求 1）应选用抗病力强，容易饲养、肿瘤自发率低、对受试物）应选用抗病力强，容易饲养、肿瘤自发率低、对受试

84、物敏感的动物。首选动物为刚断奶或敏感的动物。首选动物为刚断奶或68周龄的小鼠或大鼠。周龄的小鼠或大鼠。 2）饲料及饮水中污染物不应超过容许浓度。）饲料及饮水中污染物不应超过容许浓度。 3）每组雌雄）每组雌雄各各74只动物，每组动物体重变化不应超过平均体重的只动物，每组动物体重变化不应超过平均体重的20%。100（2）剂量分组及染毒途径和期限）剂量分组及染毒途径和期限 1）剂量分组：可设对照、最大耐受剂量和两个中间剂量，）剂量分组：可设对照、最大耐受剂量和两个中间剂量，或设对照、最大耐受剂量和半数最大耐受剂量或设对照、最大耐受剂量和半数最大耐受剂量3个组。个组。 2）染毒途径：最好模拟人的接触途

85、径，可以经消化道、呼）染毒途径：最好模拟人的接触途径，可以经消化道、呼吸道和皮肤进行。吸道和皮肤进行。 3）实验期限：通过喂食或饮水染毒时，每周给）实验期限：通过喂食或饮水染毒时，每周给7天；通过天；通过吸入、灌胃或皮肤染毒时，每周给吸入、灌胃或皮肤染毒时，每周给5天。实验期限为二年。天。实验期限为二年。101（3）观察指标）观察指标 1）了解一般情况）了解一般情况：实验头：实验头3个月要求每周称一次体重，个月要求每周称一次体重，以后每两周称一次；若采用消化道染毒，应计算食物和饮以后每两周称一次；若采用消化道染毒，应计算食物和饮水消耗量；每天观察动物两次，发现死亡、垂死的和临床水消耗量；每天观

86、察动物两次，发现死亡、垂死的和临床异常的动物应记载；实验异常的动物应记载；实验15个月时每组雌雄动物各处死个月时每组雌雄动物各处死10只，其只，其尸检和病理检查尸检和病理检查余在第余在第24月处死，作详细，同时进月处死，作详细，同时进行行血液生化检查血液生化检查。 2）肿瘤发生检查）肿瘤发生检查：记录肿瘤出现时间、部位、大小、：记录肿瘤出现时间、部位、大小、数目、外形、硬度和发展情况，并计算数目、外形、硬度和发展情况，并计算肿肿瘤发生率，脏器瘤发生率，脏器的平均肿瘤数的平均肿瘤数。 102 3）病病理理学学检检查查 对对肿肿瘤瘤组组织织、可可疑疑肿肿瘤瘤组组织织及及肉肉眼眼不不能能判判断断性性质质的的其其它它病病变变组组织织均均需需做做病病理理学学检检查查。 如如肿肿瘤瘤、可可疑疑肿肿瘤瘤所所在在脏脏器器的的部部位位、大大小小、数数目目、外外形形、硬硬度度，与与正正常常组组织织界界限限，以以及及肿肿瘤瘤组组织织本本身身有有无无出出血血、坏坏死死等等。 4）肿肿瘤瘤潜潜伏伏期期：以以各各实实验验组组第第一一例例肿肿瘤瘤发发现现的的时时间间作作为为潜潜伏伏期期。