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1、“十二五”国家科技计划项目答辩实验用小型猪重大疾病模型研发及其专门化品系培育项目申报单位：中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所报 告 人 ：李奎项目参加单位：项目参加单位：南方医科大学中国医学科学院北京协和医院中国人民解放军第三军医大学深圳华大基因研究院中国农业大学吉林大学提纲一、任务需求分析二、项目目标三、研究内容四、技术路线五、技术难点六、考核指标七、创新性八、科研条件一、任务需求分析1.小型猪是理想的疾病动物模型啮齿类动物模型和人类之间存在诸多差异啮齿类动物模型和人类之间存在诸多差异与小鼠等相比，小型猪在形态学、解剖学、生与小鼠等相比，小型猪在形态学、解剖学、生理学、内分泌学、基因组学等方
2、面与人类具有理学、内分泌学、基因组学等方面与人类具有很高的相似性很高的相似性小型猪作为糖尿病、心血管疾病、鼻咽癌等模小型猪作为糖尿病、心血管疾病、鼻咽癌等模型具有明显的优势型具有明显的优势世界各国加大了转基因猪疾病模型的研究力度世界各国加大了转基因猪疾病模型的研究力度一、任务需求分析2.建立小型猪人类重大疾病模型应用前景广阔代谢性疾病和癌症等非传染性疾病已成为危害代谢性疾病和癌症等非传染性疾病已成为危害人类健康的人类健康的“ “头号杀手头号杀手” ”建立动物疾病模型是研究疾病发生机理、药物建立动物疾病模型是研究疾病发生机理、药物动力学、新药安全及疗效评价等的关键动力学、新药安全及疗效评价等的关
3、键缺乏小型猪缺乏小型猪2 2型糖尿病、动脉粥样硬化、小型猪型糖尿病、动脉粥样硬化、小型猪乳腺癌和鼻咽癌模型乳腺癌和鼻咽癌模型一、任务需求分析3.重大疾病模型表型评价国际上，多个机构已开展了大规模疾病模国际上，多个机构已开展了大规模疾病模型的表型评价，这些机构已制定了小鼠表型的表型评价，这些机构已制定了小鼠表型评价的标准操作规程型评价的标准操作规程小型猪疾病模型表型评价也已积累了大量小型猪疾病模型表型评价也已积累了大量的基础数据的基础数据建立小型猪重大疾病模型表性评价的标准建立小型猪重大疾病模型表性评价的标准操作规程、数据库和共享平台十分必要操作规程、数据库和共享平台十分必要一、任务需求分析4.
4、专门化品系培育具有重大市场需求小型猪重大疾病模型专门化品系：指基于相关小型猪重大疾病模型专门化品系：指基于相关疾病自发性易感个体或转基因模型动物，经遗疾病自发性易感个体或转基因模型动物，经遗传和表型共同选育，繁育三代以上形成的健康传和表型共同选育，繁育三代以上形成的健康状况良好、生长发育正常、繁殖能力稳定，特状况良好、生长发育正常、繁殖能力稳定，特定阶段发生或可诱导发生某种人类疾病典型临定阶段发生或可诱导发生某种人类疾病典型临床特征的群体，群体内有效个体数不少于床特征的群体，群体内有效个体数不少于3030头头专门化品系能保证疾病动物模型的标准化和规专门化品系能保证疾病动物模型的标准化和规范化范
5、化一、任务需求分析4.专门化品系培育具有重大市场需求国际上已形成国际上已形成SinclairSinclairTM TM 、YucatanYucatanTMTM、HanfordHanfordTMTM等小型猪疾病模型品系等小型猪疾病模型品系我国还没有小型猪疾病模型品系我国还没有小型猪疾病模型品系我国拥有独特而又丰富的小型猪种质资源我国拥有独特而又丰富的小型猪种质资源, ,五指山小型猪近交系、巴马小型猪封闭群等五指山小型猪近交系、巴马小型猪封闭群等均历经二十多年的选育均历经二十多年的选育, ,为重大疾病模型专为重大疾病模型专门化品系培育奠定了重要基础门化品系培育奠定了重要基础二、项目目标1.1.以本
6、组以本组20082008年开始高脂、高糖和高胆固醇诱导小年开始高脂、高糖和高胆固醇诱导小型猪型猪2 2型糖尿病和动脉粥样硬化两个模型群体为基型糖尿病和动脉粥样硬化两个模型群体为基础，获得疾病易感个体，经系统选育，培育自发础，获得疾病易感个体，经系统选育，培育自发性模型品系性模型品系2.2.通过完善基因修饰技术，建立多基因时空特异性通过完善基因修饰技术，建立多基因时空特异性诱导五指山近交系等小型猪诱导五指山近交系等小型猪2 2型糖尿病、动脉粥样型糖尿病、动脉粥样硬化、乳腺癌和鼻咽癌疾病发生的模型，经系统硬化、乳腺癌和鼻咽癌疾病发生的模型，经系统选育建立专门化品系选育建立专门化品系3.3.建立小型
7、猪建立小型猪2 2型糖尿病、动脉粥样硬化、乳腺癌和型糖尿病、动脉粥样硬化、乳腺癌和鼻咽癌等模型表型分析标准和技术规范，以及多鼻咽癌等模型表型分析标准和技术规范，以及多层面比较分析数据库；对转基因疾病模型、自发层面比较分析数据库；对转基因疾病模型、自发性模型及专门化品系进行系统评价性模型及专门化品系进行系统评价三、研究内容课题1：转基因小型猪代谢性疾病模型制备完善多基因时空特异性表达调控方法完善多基因时空特异性表达调控方法制备小型猪制备小型猪 细细胞功能胞功能调调控模型：通控模型：通过对过对IAPPIAPP、GLUT2GLUT2等基因的等基因的诱导诱导表达或敲除表达或敲除制制备备小型猪胰小型猪胰
8、岛岛素抵抗糖尿病模型：通素抵抗糖尿病模型：通过过脂肪、脂肪、肌肉等肌肉等组织组织特异性敲除胰特异性敲除胰岛岛素促葡糖利用相关素促葡糖利用相关基因基因制制备备小型猪小型猪2 2型糖尿病多基因型糖尿病多基因协协同模型同模型制制备备小型猪小型猪动动脉粥脉粥样样硬化模型硬化模型三、研究内容课题2：转基因小型猪肿瘤模型制备制备过表达人制备过表达人p53p53突变体和突变体和EBEB病毒病毒LMP1LMP1基因基因细胞系，并获得鼻咽癌疾病模型细胞系，并获得鼻咽癌疾病模型制备组织特异性敲除制备组织特异性敲除p53p53基因小型猪基因小型猪制备同时组织特异性敲除制备同时组织特异性敲除p53p53基因和组织特异
9、基因和组织特异性表达性表达LMP1LMP1基因的转基因小型猪基因的转基因小型猪制备多基因共表达的转基因乳腺癌模型制备多基因共表达的转基因乳腺癌模型制备同时组织特异性敲除制备同时组织特异性敲除p53p53和和ERCA1ERCA1基因的基因的基因修饰猪基因修饰猪三、研究内容课题3：转基因代谢性疾病和肿瘤模型表性评价开展开展2 2型糖尿病模型相应指标的标准化检测技术体型糖尿病模型相应指标的标准化检测技术体系研究系研究开展动脉粥样硬化模型血脂指标、血管影像学和开展动脉粥样硬化模型血脂指标、血管影像学和病理学的标准化分析技术体系研究病理学的标准化分析技术体系研究开展肿瘤模型肿瘤发生、转移指标和肿瘤发生早
10、开展肿瘤模型肿瘤发生、转移指标和肿瘤发生早期标志分子等的检测和分析技术研究期标志分子等的检测和分析技术研究开展转基因和自发模型表型评价研究开展转基因和自发模型表型评价研究建立小型猪生理生化学、解剖学等数据库建立小型猪生理生化学、解剖学等数据库建立疾病模型制备用技术资料库建立疾病模型制备用技术资料库三、研究内容课题4：代谢性疾病和肿瘤等模型专门化品系培育确定影响疾病发生发展过程和病理组织学变化的基因确定影响疾病发生发展过程和病理组织学变化的基因对我国主要实验用小型猪进行大规模全基因组扫描和对我国主要实验用小型猪进行大规模全基因组扫描和表性评价表性评价培育具有自主知识产权的五指山小型猪培育具有自主
11、知识产权的五指山小型猪2 2型糖尿病和型糖尿病和动脉粥样硬化专门化品系动脉粥样硬化专门化品系2 2个以上个以上培育具有培育具有2 2型糖尿病、动脉粥样硬化、乳腺癌、鼻咽型糖尿病、动脉粥样硬化、乳腺癌、鼻咽癌等专门化品系癌等专门化品系3 3个以上个以上四、技术路线五、技术难点1.国际上小型猪自发性模型专门化品系稀少美国美国“ “Low KLow K” ”和和”“ ”“High KHigh K” ”品系由于缺乏标记品系由于缺乏标记基因选择及大动物近交发生衰退，分别只维持基因选择及大动物近交发生衰退，分别只维持了了5 5个世代和个世代和4 4个世代个世代中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、第三军中国农
12、业科学院北京畜牧兽医研究所、第三军医大学、中国农业大学已培育出优秀的小型猪医大学、中国农业大学已培育出优秀的小型猪近交系和封闭群，并结合大规模分子标记进行近交系和封闭群，并结合大规模分子标记进行系统选育，在小型猪实验动物化培育及管理方系统选育，在小型猪实验动物化培育及管理方面均积累了丰富经验面均积累了丰富经验五、技术难点2.小型猪转基因疾病模型制备技术难度较大已建立的技术：已建立的技术：已建立的技术：已建立的技术：锌指核酸酶和转座子技术锌指核酸酶和转座子技术大片段基因转移技术大片段基因转移技术组织特异性组织特异性Cre-loxpCre-loxp系统系统多肽多肽2A2A位点和复合基因转移技术位点
13、和复合基因转移技术Tet-on/Tet-offTet-on/Tet-off技术技术国际上转基因小鼠疾病模型制备已相当成熟国际上转基因小鼠疾病模型制备已相当成熟国际上转基因小鼠疾病模型制备已相当成熟国际上转基因小鼠疾病模型制备已相当成熟五、技术难点3.小型猪重大疾病模型评价平台缺少成熟的经验可借鉴已获得大量各种组织器官组织学切片已获得大量各种组织器官组织学切片在疾病模型及表型评价方面积累了丰富经验，在疾病模型及表型评价方面积累了丰富经验，并建立了相关领域的疾病检测和评价平台并建立了相关领域的疾病检测和评价平台通过收集、整理相关资料，集成标准化规范通过收集、整理相关资料，集成标准化规范化的重大疾病
14、模型评价平台化的重大疾病模型评价平台六、考核指标1.1.获得诱导模型重要候选功能基因筛选标记获得诱导模型重要候选功能基因筛选标记10-1510-15个；获得个；获得2 2型糖尿病和动脉粥样硬化疾病易感个体；型糖尿病和动脉粥样硬化疾病易感个体；建立自发性建立自发性2 2型糖尿病和动脉粥样硬化专门化品系型糖尿病和动脉粥样硬化专门化品系2 2个以上个以上2.2.建立小型猪建立小型猪 细细胞凋亡和胰胞凋亡和胰岛岛素分泌紊乱素分泌紊乱2 2型糖尿型糖尿病模型病模型5-85-8个；胰个；胰岛岛素抵抗引素抵抗引发发2 2型糖尿病模型型糖尿病模型8-8-1010个；猪个；猪 细细胞功能胞功能调调控和胰控和胰岛
15、岛素抵抗多基因素抵抗多基因协协同同2 2型糖尿病模型型糖尿病模型6-86-8个个六、考核指标3.3.建立小型猪基因敲除或建立小型猪基因敲除或RNARNA干扰动脉粥样硬化模干扰动脉粥样硬化模型型5-85-8个个4.4.建立小型猪乳腺癌模型建立小型猪乳腺癌模型3-53-5个；建立小型猪鼻咽个；建立小型猪鼻咽癌模型癌模型3-53-5个个5.5.建立转基因小型猪疾病模型专门化品系建立转基因小型猪疾病模型专门化品系3 3个以上个以上六、考核指标6.6.建立小型猪代谢性疾病和肿瘤等模型评价指标的建立小型猪代谢性疾病和肿瘤等模型评价指标的检测技术标准和规范检测技术标准和规范7.7.建立疾病模型相关基因信息及
16、生理生化等数据库；建立疾病模型相关基因信息及生理生化等数据库；完成完成3030个以上小型猪转基因模型及个以上小型猪转基因模型及5 5个以上转基个以上转基因和自发模型专门化品系的表型评价因和自发模型专门化品系的表型评价8.8.获得原创性成果获得原创性成果2 2项以上，建立相关技术规范和标项以上，建立相关技术规范和标准草案准草案5 5项以上项以上六、考核指标9.9.建立小型猪疾病模型研发与评价平台建立小型猪疾病模型研发与评价平台2 2个；申个；申请或获得专利请或获得专利3030项以上项以上10.10.发表科研论文发表科研论文6060篇以上，其中篇以上，其中IF5.0IF5.0的的1010篇以上篇以
17、上11.11.建立一支小型猪疾病模型研究和专门化品系建立一支小型猪疾病模型研究和专门化品系培育的技术队伍培育的技术队伍七、创新性1.在国际率先规模化的制备一批五指山小型猪多基因调控模型2.首次建立稳定的2型糖尿病和动脉粥样硬化自发性模型及其专门化品系3.在国际上首次制备三阴性乳腺癌模型4.在国际上率先建立相关疾病特征数据库及小型猪疾病模型评价技术平台八、科研条件n n中国农业科学院北京畜牧兽医研究所中国实验用小型猪种质资源中心中国实验用小型猪种质资源中心中国实验用小型猪种质资源中心中国实验用小型猪种质资源中心科技部规划实验动物领域八大种质资源中心之一科技部规划实验动物领域八大种质资源中心之一拥
18、有剖腹净化、仔猪隔离器饲养、遗传质量控制拥有剖腹净化、仔猪隔离器饲养、遗传质量控制室、环境质量监控室、生物学特性研究和实验用室、环境质量监控室、生物学特性研究和实验用小型猪信息管理系统等功能设施小型猪信息管理系统等功能设施具有年生产具有年生产SPFSPF猪猪200200头，清洁猪头，清洁猪300300头和普通级实头和普通级实验用猪验用猪15001500头的能力头的能力中心概貌中心概貌SPF 猪舍猪舍污水处理池污水处理池值班室值班室仔猪饲养间仔猪饲养间空调机组空调机组发电机发电机SPFSPF区猪舍区猪舍清洁区清洁区八、科研条件提出的实验动物国家标准提出的实验动物国家标准八、科研条件体重变化平均值
19、T检测个体进展程度八、科研条件腹脂腹脂内脏脂肪内脏脂肪试验组眼肌试验组眼肌对照组眼肌对照组眼肌试验组胰腺脂肪试验组胰腺脂肪实验组背膘实验组背膘试验组四头肌试验组四头肌试验组心脏试验组心脏八、科研条件n n中国农业科学院北京畜牧兽医研究所目前正在进行五指山近交系等小型猪目前正在进行五指山近交系等小型猪2 2型糖尿病及型糖尿病及动脉粥样硬化易感个体筛选、转基因制备疾病模型动脉粥样硬化易感个体筛选、转基因制备疾病模型等研究等研究建立了糖尿病血液生理生化检测、糖耐量分析、胰建立了糖尿病血液生理生化检测、糖耐量分析、胰岛素抗性评价、细胞因子评价等表型和评价体系岛素抗性评价、细胞因子评价等表型和评价体系建
20、立了动脉粥样硬化动物模型，制订小型猪动脉粥建立了动脉粥样硬化动物模型，制订小型猪动脉粥样硬化的血液学、血管照影等评价技术样硬化的血液学、血管照影等评价技术通过显微注射制备了转通过显微注射制备了转GH12GH12猪、生长激素基因猪猪、生长激素基因猪诱导载体诱导载体(Tet-on)(Tet-on)猪及条件表达猪及条件表达TRE-GHTRE-GH猪猪n n南方医科大学肿瘤研究所 所长姚开泰教授，博士生导师，中国科学院院士所长姚开泰教授，博士生导师，中国科学院院士 重大疾病的转录组与蛋白质组学教育部重点实验室重大疾病的转录组与蛋白质组学教育部重点实验室 构建了可视化的鼻咽癌转移治疗动物模型，开展了构建
21、了可视化的鼻咽癌转移治疗动物模型，开展了基于基因芯片、基于基因芯片、miRNAmiRNA芯片、甲基化芯片、蛋白细芯片、甲基化芯片、蛋白细胞增殖型等研究，均为新型鼻咽癌转基因动物模型胞增殖型等研究，均为新型鼻咽癌转基因动物模型的建立及后续表型分析打下坚实的基础。的建立及后续表型分析打下坚实的基础。 基础设施，相关研究工作进展，成果（待补充）基础设施，相关研究工作进展，成果（待补充）八、科研条件八、科研条件n n中国医学科学院北京协和医院中国医学科学院北京协和医院 设有国内领先的中心实验室、临床药理中心、实设有国内领先的中心实验室、临床药理中心、实验动物和卫生部内分泌重点实验室验动物和卫生部内分泌
22、重点实验室 设有糖尿病、肥胖症等设有糖尿病、肥胖症等8 8个研究中心或课题组个研究中心或课题组 拥有抗体制备及激素检测平台和内分泌与代谢疾拥有抗体制备及激素检测平台和内分泌与代谢疾病基因检测平台病基因检测平台 基础设施，相关研究工作进展，成果（待补充）基础设施，相关研究工作进展，成果（待补充）n n中国人民解放军第三军医大学中国人民解放军第三军医大学 国家重点学科、心血管药品临床试验基地国家重点学科、心血管药品临床试验基地 建立了国家小型猪医学生物学应用技术平台建立了国家小型猪医学生物学应用技术平台 建立了医用小型猪显微注射、转基因克隆等转基建立了医用小型猪显微注射、转基因克隆等转基因猪技术体
23、系因猪技术体系 建立了心血管典型药物洛伐他汀在巴马香猪体内建立了心血管典型药物洛伐他汀在巴马香猪体内的整套药物评价技术资料的整套药物评价技术资料 八、科研条件八、科研条件n n中国人民解放军第三军医大学中国人民解放军第三军医大学 建立了可视化遗传修饰小鼠疾病模型数据库建立了可视化遗传修饰小鼠疾病模型数据库 完成了世界首例完成了世界首例“ “数字化可视猪数字化可视猪” ”的研究的研究 建立了世界首例建立了世界首例“ “数字化猪数字化猪” ”的数据集的数据集 拥有表型分析的大型仪器设备和研究技术体系拥有表型分析的大型仪器设备和研究技术体系小型猪繁育与实验平台内部设施八、科研条件谢谢！请各位专家批评指正！
