《单克隆抗体制备技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《单克隆抗体制备技术（43页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、单克隆抗体制备平台建立1基本概念n抗原决定镞（抗原表位）n细胞克隆n多克隆抗体n单克隆抗体2Antigenic determinantn是指抗原分子中决定抗原特异性的 特殊化学基团，又称表位(epitope).3n细胞克隆： 由一个细胞增殖而成的细胞集团4nPolyclonal antibody,PcAb：针对多种抗原决定簇的混合抗体nMonoclonal antibody,McAb:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体5Ab1Ab3Ab4单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原Ab1抗血清抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）普通抗血清（多克隆抗体）脾脾B
2、细细胞胞骨髓瘤小鼠骨髓瘤小鼠取腹水取腹水骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT培养，培养，稀释稀释单单克克隆隆抗抗体体和和多多克克隆隆抗抗体体产产生生区区别别示示意意图图杂交瘤细胞杂交瘤细胞+ PEG, 融合融合Ab26杂交瘤技术的理论基础n淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体n细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性n利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb7n当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。8细胞DNA合成途经1.替
3、代途径：次黄嘌呤（H） HGPRT2.主要途径：氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸谷 氨 酰 胺 （A-）尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）9HAT选择培养基的原理nHAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)10脾n抗原免疫的脾细胞(B细胞) 小鼠骨髓瘤细胞(B细胞恶性肿瘤)n1.抗体分秘(IgG+) 1.具永生性n2.HGPRT+在HAT生长 2. 8AG筛选出HGPTP-株n n PEG 融合 HAT筛选 n 脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） n （HGPRT+
4、、Ig+） 11融合的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞12 免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水） McAb 纯化及鉴定 13制备单克隆抗体的基本技术1 抗原提纯与动物免疫2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合4 抗体检测5 杂交瘤的克隆化和冻存6 McAB的制备7 单克隆抗体的纯化14n免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性
5、B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。n可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次)冲击免疫（融合前3天进行）n选用6-12周龄Balb/c小鼠15n颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 n可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 n目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。16n
6、骨髓瘤细胞系选择要点：n稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株n常用骨髓瘤细胞系：NS1、SP20、X63 等。n保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清）n融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 n融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中 n常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 n饲养细胞一般在融合前一天制备17n免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。n融合比例：n骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10n融合剂：
7、40%PEG（分子量1000-2000）n融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液2周后,改用一般培养液18n一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。n可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。19n克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。n克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次n克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法n阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染20n单抗生产的方法：n动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后
8、腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。21单抗纯化方法：n盐析n凝胶过滤n离子交换层析n亲和层析法n辛酸沉淀法22n单克隆抗体特性n理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备27单克隆抗体在医学中的应用n检验医学诊断试剂n（1）病原微生物抗原抗体的检测n（2）肿瘤抗原的检测n（3）免疫细胞及其亚群的检测n（4）激素测定n（5）细胞因子的测定n蛋白质的提纯n肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术28基因工程抗体与抗体库技术n单抗体内应用和疗效受限原因：n1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性n2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少
9、n3.生产成本高,难于普及应用29n人杂交瘤技术未获真正突破原因:n融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫n基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。n抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。30单克隆抗体药物概况n单克隆抗体（MAB）是近年来复合年增长率最大的一蛋白类药物，2001年全球销售额增长了57.3%，接近30亿美元。在这类产品中开发主要集中在癌症治疗药物方面。预计到2010年用于癌症治疗的单克隆抗体将占其销售总额的54.7%。据预
10、测，单克隆抗体将会以复合年增长率16.3%的速度增长，到2010年达到121.39亿美元的市场规模。其中，治疗癌症的单克隆抗体市场规模将达66.36亿美元。31 抗体的人源化技术进展抗体的人源化技术进展: : 单克隆抗体在世界生物工程制药业的支柱产品之一。单克隆抗体在世界生物工程制药业的支柱产品之一。 单抗将发展成为一大类独立医药产品。单抗将发展成为一大类独立医药产品。 鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代: : 原因：原因：1.1.鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低，鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低， 2.CDC2.CDC作用相应较弱，对
11、肿瘤细胞的杀伤能力较弱；作用相应较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱； 3.3.与与NKNK等免疫细胞表面等免疫细胞表面FcFc受体亲和力弱，介导的受体亲和力弱，介导的ADCCADCC作用较弱；作用较弱； 4.4.鼠源抗体半衰期短，发挥鼠源抗体半衰期短，发挥ADCCADCC与与CDCCDC作用的时间较短；作用的时间较短； 5.5.鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起过敏反应。鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起过敏反应。32鼠抗体人源化的构建方法鼠抗体人源化的构建方法: :嵌嵌合合抗抗体体：利利用用DNADNA重重组组技技术术将将鼠鼠单单抗抗的的轻轻、重重链链可可变变区区基基因因
12、插插入入含含有有人人抗抗体体恒恒定定区区的的表表达达载载体体中中，转转化化哺哺乳乳动动物物细细胞胞表表达达出出人人鼠鼠嵌嵌合合抗抗体体，其其人人源源化化程程度度达达到到70%70%左左右右，完完整整地地保保留留了了异异源源单单抗抗的的可可变变区区，最最大大限限度度地地保保持持了了其其亲亲和和活活性性，降降低低了了免免疫疫原原性性。但但由由于于人人鼠鼠嵌嵌合合抗抗体体仍仍然然保保留留了了30%30%的的鼠鼠源源性性，可可诱诱发发人人抗抗小小鼠鼠反应反应HAMAHAMA。表表面面重重塑塑抗抗体体：对对鼠鼠抗抗体体表表面面氨氨基基酸酸残残基基进进行行人人源源化化改改造造。该该方方法法的的原原则则是是
13、仅仅替替换换与与人人抗抗体体SARSAR差差别别明明显显的的区区域域，在在维维持持抗抗体体活活性性并并兼兼顾顾减减少少异异源源性性基基础础上上选选用用与与人人抗抗体体表表面面残残基基相相似似的的氨氨基基酸酸替替换换: :互互补补决决定定区区（CDRCDR）构构象象的的残残基基尽尽量量不不替替换。换。重重构构抗抗体体：由由异异源源抗抗体体中中与与抗抗原原结结合合相相关关的的残残基基与与人人抗抗体体重重新新拼拼接接构构建建的的，包包括括CDRCDR区移植，部分区移植，部分CDRCDR移植和特定决定区（移植和特定决定区（SDRSDR）转移。）转移。33全人源化抗体全人源化抗体完完全全人人抗抗体体的的
14、形形成成始始于于二二十十世世纪纪九九十十年年代代，目目前前获获得得全全人人源源化化抗抗体体方方法法有有抗抗体体库库筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。2.1 2.1 抗体库筛选技术抗体库筛选技术: :抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。噬噬菌菌体体抗抗体体库库技技术术：从从免免疫疫或或未未被被免免疫疫的的B细细胞胞中中分分离离抗抗体体可可变变区区基基因因；PCR 扩扩增增抗抗体体全全套套基基因因片片段段(如如VH、VL)，将将体体外外扩扩增增的的VH、VL 基基因因片
15、片段段随随机机克克隆隆入入相相应应载载体体，形形成成组组合合文文库库；将将基基因因组组合合文文库库插插入入噬噬菌菌体体编编码码膜膜蛋蛋白白的的基基因因(g3) 或或基基因因(g8) 的的先先导导系系列列的的紧紧靠靠下下游游，使使外外源源基基因因表表达达的的多多肽肽以以融融合合蛋蛋白白的的形形式式展展示示在在外外壳壳蛋蛋白白gp 或或gp 的的N N 端端。用用固固相相化化抗抗原原经经“亲亲和和结结合合洗洗脱脱扩扩增增”数数个个循循环环直直接接、方方便便、简简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。34 基因工程小鼠制备全人抗体
16、基因工程小鼠制备全人抗体全全人人抗抗体体的的基基因因工工程程小小鼠鼠包包括括人人外外周周血血淋淋巴巴细细胞胞- -严严重重联联合合免免疫疫缺缺陷陷小小鼠鼠（hu-PBL-SCIDhu-PBL-SCID小鼠）、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。小鼠）、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。Hu-PBL-SCIDHu-PBL-SCID小小鼠鼠是是将将已已产产生生一一定定免免疫疫反反应应的的供供者者或或癌癌症症患患者者的的人人的的外外周周血血淋淋巴巴细细胞胞移移植植于于严严重重联联合合免免疫疫缺缺陷陷小小鼠鼠(SCID)(SCID)，经经抗抗原原免免疫疫后后可可获获得得人人源抗体。源抗体。转
17、转基基因因小小鼠鼠：将将人人抗抗体体生生产产基基因因转转入入小小鼠鼠，以以替替换换小小鼠鼠的的抗抗体体生生成成基基因因。转转基基因因小小鼠鼠制制备备人人抗抗体体的的优优点点是是，其其功功效效优优于于其其它它生生产产抗抗人人体体蛋蛋白白单单抗抗技技术术。不不足足之之处处：(1)(1)转转基基因因通通常常有有体体细细胞胞突突变变和和其其它它独独特特的的序序列列，导导致致不不十十分分完完全全的的人人序序列列；(2)(2)由由于于抗抗体体是是在在小小鼠鼠体体内内装装配配，因因而而产产生生的的单单抗抗具具有有鼠鼠糖糖基基化化模模式式，所所以以这这些些单单抗抗最最终终并并不不是是全全人人的的；(3)(3)
18、转转基基因因小小鼠鼠表表达达的人的人IgIg多样性较少，而且在同一小鼠中不能够产生多样性较少，而且在同一小鼠中不能够产生IgGIgG各亚类。各亚类。35转转染染色色体体小小鼠鼠：通通过过微微细细胞胞介介导导法法（MMCTMMCT方方法法）将将人人1414号号染染色色体体上上产产生生IgH IgH 的的胚胚系系片片段段和和2 2号号染染色色体体上上5 550 50 Mb Mb 的的轻轻链链片片段段转转染染到到ESES细细胞胞，获获得得小小鼠鼠经经人人血血清清白白蛋蛋白白免免疫疫之之后后，可可产产生生抗抗人人血血清清白白蛋蛋白白的的人人IgIg，再再次次免免疫疫后后IgMIgM产产生生。由由转转染
19、染色色体体技技术术得得到到的的小小鼠鼠，表表达达的的人人IgGIgG各各亚亚类类的的量量与与人人血血清清中中表表达达的的IgGIgG各各亚亚类类类类同同，且且可可同同时时在在一一个个转转基基因因小小鼠鼠内内表表达达；但但是是，转转染染色色体体小小鼠鼠导导入入的的人人Ig Ig 片片断断虽虽然然比比较较大大，但但其其表表达达的的人人IgIg量却比较低。量却比较低。36转染色体牛转染色体牛: :产生人产生人Ig 转染色体牛的构建过程仍旧利用转染色体牛的构建过程仍旧利用MMCT法，将构建的含有人法，将构建的含有人Ig 轻重链基因片段的人人工染色体轻重链基因片段的人人工染色体(HAC)，导入牛胚胎成纤
20、维细胞，进一步，导入牛胚胎成纤维细胞，进一步发育成转染色体牛。发育成转染色体牛。产生人产生人Ig 转染色体牛的构建特点在于：转染色体牛的构建特点在于：(1)由于牛胚胎干细胞不能成功建系，由于牛胚胎干细胞不能成功建系， 因此将人人工染色体导入牛胚胎成因此将人人工染色体导入牛胚胎成纤维细胞；纤维细胞；(2)转染色体牛用核移植的方法来建立；转染色体牛用核移植的方法来建立；(3)由于牛胚胎成纤维细胞仅能够存活由于牛胚胎成纤维细胞仅能够存活35代，含有人代，含有人HAC 的微细胞与牛胚的微细胞与牛胚胎成纤维细胞融合后，牛胎儿成纤维细胞只能再存活胎成纤维细胞融合后，牛胎儿成纤维细胞只能再存活7d，因此必须经过，因此必须经过2次筛选，确保次筛选，确保HAC在转染色体牛体内的高存留率。转染色体牛生产人多抗，在转染色体牛体内的高存留率。转染色体牛生产人多抗，可以在短时间内大量获得，所以，转染色体牛获得的人多抗可以在一定程可以在短时间内大量获得，所以，转染色体牛获得的人多抗可以在一定程度上弥补转染色体小鼠的不足，应付突发事件的发生。度上弥补转染色体小鼠的不足，应付突发事件的发生。 373839404142Thanks for attention Thanks Dec.5.2007摄于新疆喀纳斯湖2005.8.1843
