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1、四章中药制剂含量测定Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望v样品处理的目的样品处理的目的第一节第一节 样品处理样品处理1. 释放被测组分，制成稳定试样释放被测组分，制成稳定试样2. 除去杂质，纯化除去杂质，纯化3. 浓缩或衍生化浓缩或衍生化4. 试样形式符合测定的要求试样形式符合测定的要求使其符合所选定的分析方法的要求使其符合所选定的分析方法的要求v一、样品的粉碎一、样品的粉碎 目的目的取样均匀，提取完全取样均匀，提取完全粉碎设备粉碎设备粉碎机、研钵、匀浆机粉碎机、研钵、匀
2、浆机注意：粒度大小合适注意：粒度大小合适 防止污染或损失防止污染或损失溶剂的选择溶剂的选择v水、酸水、碱水水、酸水、碱水v亲水性的有机溶剂：乙醇（酒精）、甲亲水性的有机溶剂：乙醇（酒精）、甲醇（木精）、丙酮醇（木精）、丙酮v亲脂性的有机溶剂：石油醚、苯、氯仿、亲脂性的有机溶剂：石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷v二、样品的提取二、样品的提取关键关键提取完全提取完全1.1.浸泡提取法浸泡提取法冷浸法冷浸法 v优点：操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少优点：操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少v缺点：费时（缺点：费时（12-24 h）、费溶剂（）、费溶剂
3、（10-50倍）倍）放置或指定放置或指定25温浸（温浸（4050 ） 热水浸泡（热水浸泡（7080 ） 部分测定法部分测定法等量测定法等量测定法全部测定法全部测定法总量测定法总量测定法灵宝护心丹（牛黄、麝香等）中胆酸的含量测定灵宝护心丹（牛黄、麝香等）中胆酸的含量测定 取本品适量，研细，取约取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚（60-90）4ml，浸泡，浸泡1小时，滤过，滤渣及滤纸挥去溶剂，放回锥形小时，滤过，滤渣及滤纸挥去溶剂，放回锥形瓶中，精密加入冰醋酸无水乙醇溶液（瓶中，精密加入冰醋酸无水乙醇溶液（1 10）15ml，摇匀
4、，密塞，摇匀，密塞，称定重量，浸泡称定重量，浸泡12小时，再称定重量，用冰醋酸无水乙醇溶液（小时，再称定重量，用冰醋酸无水乙醇溶液（1 10）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。1.1.浸泡提取法浸泡提取法2.2.回流提取法回流提取法加快溶出速度，省时加快溶出速度，省时（每次提取时间（每次提取时间0.52h，提取次数，提取次数13次）次）适宜受热稳定的药物适宜受热稳定的药物适宜较难溶出的组分适宜较难溶出的组分特点特点采用回流装置，用单一溶剂或混合溶剂采用回流装置，用单一溶剂或混合溶剂于水浴上加热回流提取于水浴上加热回流提取万应
5、胶囊（黄连等）中盐酸小檗碱测定万应胶囊（黄连等）中盐酸小檗碱测定+HCl-70%乙醇溶液，加热回流1h3.3.连续回流提取法连续回流提取法特点特点样品置于样品置于索氏提取器索氏提取器中，利用低沸点的中，利用低沸点的有机溶剂进行连续回流提取有机溶剂进行连续回流提取保和丸（陈皮等）中橙皮甙测定保和丸（陈皮等）中橙皮甙测定+甲醇，加热回流至提取液无色为止甲醇，加热回流至提取液无色为止节省溶剂，提高提取效率节省溶剂，提高提取效率适宜受热稳定的药物适宜受热稳定的药物费时费时4.4.超声提取法超声提取法利用超声波的助溶作用进行提取。利用超声波的助溶作用进行提取。超声波振荡器（超声波清洗器）超声波振荡器（超
6、声波清洗器）简便简便 省时省时 提取率高提取率高保济丸（厚朴等）中厚朴酚测定保济丸（厚朴等）中厚朴酚测定+石油醚（石油醚（30-60），超声处理（功率，超声处理（功率500W，频率，频率33kHz）2次，每次次，每次30min5.5.超临界流体萃取法超临界流体萃取法（SFE）以超临界流体（常用以超临界流体（常用CO2）作溶剂的样品提取新技术。）作溶剂的样品提取新技术。当压力和温度超过气体的临界点时所形成的单一相态当压力和温度超过气体的临界点时所形成的单一相态超临界流体超临界流体特殊的物质状态特殊的物质状态密度密度 d 液体液体 溶解能力强溶解能力强粘度粘度 气体气体 传质快，有利于待测组分的扩
7、散传质快，有利于待测组分的扩散表面张力几乎为表面张力几乎为 0 浸润性能好浸润性能好密度受压力、温度的影响大密度受压力、温度的影响大 改变对溶质的溶改变对溶质的溶解能力，加入甲醇、氯仿、苯等改变极性解能力，加入甲醇、氯仿、苯等改变极性 提提取不同极性的成分取不同极性的成分优点：速度快、萃取效率高、方法准确度高、选择优点：速度快、萃取效率高、方法准确度高、选择性较高性较高1.沉淀法沉淀法v二、样品的分离净化二、样品的分离净化关键关键保留有效成分保留有效成分复方益母草口服液中水复方益母草口服液中水苏碱的含量碱的含量测定定利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质中可与大部利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）
8、作沉淀剂，在酸性介质中可与大部分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。 2.蒸馏法蒸馏法w适用于具挥发性的待测组分，如挥发油、适用于具挥发性的待测组分，如挥发油、小分子的生物碱、丹皮酚等小分子的生物碱、丹皮酚等3. 液液液萃取法液萃取法v直接萃取法直接萃取法萃取剂的选择萃取剂的选择 亲脂性有机溶脂性有机溶剂，如苯、，如苯、氯仿或乙仿或乙醚 弱弱亲脂性的溶脂性的溶剂，如乙酸乙，如乙酸乙酯、正正丁醇等丁醇等多次萃取（多次萃取（3-43-4次）次）调整水相酸度，提取有机酸、有机碱调整水相酸度，提取有机酸、有机碱利用盐析作用，提高提取率利用盐析作用，提高
9、提取率BH+（水相）+ In-(水相) BH+In-（水相） BH+In- （有机相） 适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取 水相酸度的控制 离子对试剂的选择v离子对萃取法离子对萃取法v分离的原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换分离的原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、色谱、 凝胶色谱凝胶色谱v按操作方式：柱色谱、薄层色谱、纸色谱按操作方式：柱色谱、薄层色谱、纸色谱v装柱方法：湿法装柱、干法装柱装柱方法：湿法装柱、干法装柱v微柱色谱（固相萃取）微柱色谱（固相萃取）柱的大小：长柱的大小：长515cm，内径，内径0.51cm 柱填料：硅胶、氧化铝、活性炭、
10、聚酰胺、大孔柱填料：硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、大孔树脂、硅藻土、离子交换树脂、键合相硅胶树脂、硅藻土、离子交换树脂、键合相硅胶C8、C18等等 4. 色谱法（层析法）色谱法（层析法）v制剂中所选制剂中所选被测成分被测成分主要是：主要是： 化学结构已经明确的有效成分；化学结构已经明确的有效成分； 能大致明确的某类主要活性物质；能大致明确的某类主要活性物质； 能反映某味主要药物特征的指标性成分；能反映某味主要药物特征的指标性成分； 剧毒性成分或贵重药材的成分。剧毒性成分或贵重药材的成分。第二节第二节 常用含量测定方法常用含量测定方法v常用方法：常用方法： 高效液相色谱法高效液相色谱法； 气相色
11、谱法；气相色谱法； 薄层色谱法；薄层色谱法； 紫外可见分光光度法；紫外可见分光光度法； 化学分析法化学分析法 重量分析法重量分析法 容量分析法容量分析法第三节第三节 含量测定方法验证含量测定方法验证分析方法验证的目的分析方法验证的目的 是证明采用的方法适合于相应的检测要求。是证明采用的方法适合于相应的检测要求。需验证的分析项目需验证的分析项目 鉴别试验、杂质检查、原料药及制剂中有效成分含鉴别试验、杂质检查、原料药及制剂中有效成分含量测定及其它成分测定量测定及其它成分测定验证内容验证内容 准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性范围
12、和耐用性 准确度是指测得结果与真实值或参考值接准确度是指测得结果与真实值或参考值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。近的程度，表示分析方法测量的正确性。 准确度准确度（ccuracyccuracy） 由于由于“真实值真实值”无法准确知道，因此，通无法准确知道，因此，通常采用常采用回收率回收率（% %）来表示。）来表示。 长春中医药大学要求至少测定要求至少测定高、中、低三个浓度高、中、低三个浓度，每个浓度测定，每个浓度测定三次三次，共提供共提供9个数据进行评价。个数据进行评价。中药制剂含量中药制剂含量回收率回收率一般为一般为95%105%，RSD一般应为一般应为2以内。以内。 用已知纯度的对照
13、品做加样回收测定，即于已知被测成分用已知纯度的对照品做加样回收测定，即于已知被测成分含量的供试品中再加入已知纯度的被测成分对照品。含量的供试品中再加入已知纯度的被测成分对照品。回收率计算公式为回收率计算公式为：回收率回收率%=C-AB100%A 供试品所含被测成分量供试品所含被测成分量B 加入对照品量加入对照品量C 实测值实测值长春中医药大学系指在规定测试条件下，系指在规定测试条件下，同一均匀同一均匀供试品，经供试品，经多样取样测定所的结果之间接近的程度。多样取样测定所的结果之间接近的程度。精密度精密度（precisionprecision）在药物分析中，常用相对偏差在药物分析中，常用相对偏差
14、(RD)(RD)、标准偏差、标准偏差（S S）和）和相对标准差（相对标准差（RSDRSD）表示。表示。至少至少 6 6 次结果进行评价次结果进行评价精密度是考察分析方法在不同的时间、操作人精密度是考察分析方法在不同的时间、操作人员、实验室，所获得结果之间的重现性和重复员、实验室，所获得结果之间的重现性和重复性。性。长春中医药大学1.1.重复性重复性 在较短时间间隔内，在相同的操作条件下由在较短时间间隔内，在相同的操作条件下由同一分析人员测定所得结果的精密度。同一分析人员测定所得结果的精密度。精密度验证内容包括重复性、中间精密度精密度验证内容包括重复性、中间精密度和重现性和重现性2.2.中间精密
15、度中间精密度 在同一实验室，由于实验室内部条件的在同一实验室，由于实验室内部条件的改变，如不同时间由不同分析人员用不同设备测定所得改变，如不同时间由不同分析人员用不同设备测定所得结果的精密度。结果的精密度。3.3.重现性重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。密度。长春中医药大学是指在样品介质中有其他组分（如杂质、降解是指在样品介质中有其他组分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能准产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。确测定出被测物的特性。专属性专属性（specificityspecificity）长春中
16、医药大学检测限检测限（limit of detection, LODlimit of detection, LOD）试样试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。中被测物能被检测出的最低浓度或量。长春中医药大学定量限定量限（limit of quantitation, LOQlimit of quantitation, LOQ）是指在保证具有是指在保证具有一定一定准确度和精密度准确度和精密度的前提的前提下，分析方法能够测定出的样品中药物的最下，分析方法能够测定出的样品中药物的最低量。低量。长春中医药大学线性线性（linearitylinearity）在设计的范围内，测试结果与样品中供试物在设计的范
17、围内，测试结果与样品中供试物浓度成正比关系的程度。浓度成正比关系的程度。范围范围（rangerange）范围指能达到一定精密度、准确度和线性，范围指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。测试方法适用的高低限浓度或量的区间。表示：表示：mg/Lmg/L长春中医药大学耐用性耐用性（robustnessrobustness）指在测定条件有小变动时，测定结果不受影指在测定条件有小变动时，测定结果不受影响的承受程度。响的承受程度。v高效液相色谱法高效液相色谱法v双黄连口服液的含量测定（反相双黄连口服液的含量测定（反相HPLC外标一点法）外标一点法）v 含量测定含量测定 黄芩
18、黄芩 照高效液相色谱法（附录VI D）测定。v 色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸（50:50:1）为流动相；检测波长为274nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于1500。v 对照品溶液的制备对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。v 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20分钟，放置至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。v 测定法测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5ul，注入液相色谱仪，测定，即得。v 本品每1ml含黄芩按黄芩苷（C21H18O11）计，不得少于8.0mg。v 金银花金银花 照高效液相色谱法（附录VI D）测定。
