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1、课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农被农作物作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才能被之后才能被植物利用。植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )脲酶脲酶+ H+ H2 2O O + CO+ CO2 2NHNH3 33 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分
2、解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。尿素。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌（一）筛选菌株（一）筛选菌株二、二、研究思路研究思路1 1、实例：、实例： DNA DNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是一种在体外将是一种在体外将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项技术要求使用的技术，此项技术要求
3、使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。启示：启示：寻找目的菌种时要寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。到相应的环境中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多数微生，淘汰了绝大多数微生物只有物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；包括营养、生理、生长条件等； 方法：方法：抑制大多数微生物不能生长；抑制大多数微生物不能生长；造成有造成有利于该菌生
4、长的环境，利于该菌生长的环境， 结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件( (包括营养、包括营养、温度、温度、pHpH等等) )，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHN
5、aH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物才的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受
6、到不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数： 利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。品中微生物的数量。（二）统计菌落数目：（二）统计菌落数目： 不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
7、个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法） 原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。即一个菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M 其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，数，V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所
8、用的稀释液的体积(ml)(ml)，M M代代表稀释倍数。表稀释倍数。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的的平板上进行计数。平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在释度中的第二个稀
9、释度所出现的平均菌落数在5050个左个左右为最好。右为最好。计数法计数法直接计数法直接计数法平板计数法平板计数法比浊法比浊法膜过滤法膜过滤法例题：例题：统计菌落数目的方法有（统计菌落数目的方法有（ ）A. B. A. B. C. D.C. D.D D涂布平板法涂布平板法 重量法重量法 直接计数法直接计数法比浊法比浊法 生理指标法生理指标法 膜过滤法膜过滤法 设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 实例：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目在做分解尿素的细菌的筛选
10、与统计菌落数目的实验时，的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基中筛选出倍稀释的培养基中筛选出大约大约150150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。 原因：原因：土样不同，土样不同，培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误( (或者或者是混入了其他的含氮物质是混入了其他的含氮物质) ) （三）设置对照：（三）设置对照： 小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。力，对照的设置是必不可少
11、的。 方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情况同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。染。 结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养基的同学存在操作失误或培养基的配制有问题。配制有问题。（一）土壤取样（一）土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中
12、取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。要灭菌。（二）制备培养基：（二）制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。三、实验的具体操作三、实验的具体操作 应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同
13、原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板（三）样品的稀释（三）样品的稀释 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 原因：原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性
14、厌氧细菌数约为性厌氧细菌数约为2 1852 185万，放线菌数约为万，放线菌数约为477477万，霉菌万，霉菌数约为数约为23.123.1万。万。 结论：结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。的条件。（四）取样涂布（四）取样涂布实验时要对培实验时要对培养皿作好标记。养皿作好标记。注明培养基类型、注明培养基类型、培养时间、稀释培养时间、稀释度、培养物等。度、培养物等。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在303030
15、0300的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。（五）微生物的培养与观察（五）微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微
16、生物往往需要不同培养温度。 细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的微生物的培养与观察培养与观察 1. 1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。 2. 2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个菌落的稀个菌落的稀
17、释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。验不精确。四、结果分析与评价四、结果分析与评价操作提示操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素明该细菌能够分解尿素。 测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积测定饮水中大肠杆菌数量的
18、方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。得出水样中大肠杆菌的数量。五、课外延伸五、课外延伸大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结: :1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B
19、. B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D. D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ( ) ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实实 践践 训训 练练A D3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ） A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。B
