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1、实验一细胞膜的渗透性1.细细胞膜在不断胞膜在不断胞膜在不断胞膜在不断变变化的化的化的化的环环境境境境中必中必中必中必须须保持自身的保持自身的保持自身的保持自身的稳稳定状定状定状定状态态才能生存。才能生存。才能生存。才能生存。细细胞膜允胞膜允胞膜允胞膜允许许一些物一些物一些物一些物质质通透，又能降低通透，又能降低通透，又能降低通透，又能降低甚至阻止另一些物甚至阻止另一些物甚至阻止另一些物甚至阻止另一些物质质的通的通的通的通透，所以透，所以透，所以透，所以细细胞膜具有胞膜具有胞膜具有胞膜具有选择选择通透性。通透性。通透性。通透性。二、二、二、二、实验实验原理原理原理原理未溶血未溶血溶血溶血2.血血
2、血血红红蛋白从蛋白从蛋白从蛋白从红细红细胞中逸出胞中逸出胞中逸出胞中逸出的的的的现现象称象称象称象称为为溶血溶血溶血溶血现现象象象象。1. 1.渗入渗入渗入渗入红细红细胞的溶胞的溶胞的溶胞的溶质质能提高能提高能提高能提高红细红细胞渗透胞渗透胞渗透胞渗透压压，使水，使水，使水，使水进进入入入入红细红细胞，引起溶血及胞，引起溶血及胞，引起溶血及胞，引起溶血及细细胞胞胞胞膜破裂。此膜破裂。此膜破裂。此膜破裂。此时时光光光光线较线较容易容易容易容易通通通通过过溶液，使溶液呈溶液，使溶液呈溶液，使溶液呈溶液，使溶液呈现现透透透透明即溶血。明即溶血。明即溶血。明即溶血。二、二、二、二、实验实验原理原理原理
3、原理二、二、实验原理原理3.在不同相在不同相在不同相在不同相对对分子量、脂溶性大小以及分子量、脂溶性大小以及分子量、脂溶性大小以及分子量、脂溶性大小以及电电解解解解质质和非和非和非和非电电解解解解质质等各种溶液中，等各种溶液中，等各种溶液中，等各种溶液中， 红细红细胞胞胞胞质质膜膜膜膜对对各各各各种溶种溶种溶种溶质质的渗透性不同。由于溶的渗透性不同。由于溶的渗透性不同。由于溶的渗透性不同。由于溶质质透入速度不透入速度不透入速度不透入速度不同，溶血同，溶血同，溶血同，溶血时间时间也不同。因此，通也不同。因此，通也不同。因此，通也不同。因此，通过观过观察察察察红细红细胞溶血胞溶血胞溶血胞溶血现现象
4、象象象时间时间的不同来的不同来的不同来的不同来记录记录渗入速度，从渗入速度，从渗入速度，从渗入速度，从而而而而测测量各种物量各种物量各种物量各种物质质通透性的差通透性的差通透性的差通透性的差别别。三、三、三、三、实验实验材料、材料、材料、材料、仪仪器和主要器和主要器和主要器和主要试剂试剂1. 1. 实验实验材料：材料：材料：材料：鸡鸡血血血血。2. 2. 实验实验器材：器材：器材：器材： 小小小小烧烧杯，杯，杯，杯，试试管，管，管，管，试试管架，刻度吸管，注射器，秒表等。管架，刻度吸管，注射器，秒表等。管架，刻度吸管，注射器，秒表等。管架，刻度吸管，注射器，秒表等。3. 3. 试剂试剂 0.9
5、%0.9%生理生理生理生理盐盐水；水；水；水； 2 2种低渗溶液：种低渗溶液：种低渗溶液：种低渗溶液：0.017mol/L0.017mol/L氯氯化化化化钠钠和和和和0.032mol/L0.032mol/L葡萄糖；葡萄糖；葡萄糖；葡萄糖； 1010种等渗溶液：种等渗溶液：种等渗溶液：种等渗溶液：0.17mol/L0.17mol/L氯氯化化化化钠钠、0.32mol/L0.32mol/L葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖、0.17mol/L0.17mol/L氯氯化化化化铵铵、0.17mol/L0.17mol/L醋酸醋酸醋酸醋酸铵铵、0.17mol/L0.17mol/L硝酸硝酸硝酸硝酸钠钠、0.12mo
6、l/L0.12mol/L草酸草酸草酸草酸铵铵、0.12mol/L0.12mol/L硫酸硫酸硫酸硫酸钠钠、0.32mol/L0.32mol/L甘油、甘油、甘油、甘油、0.32mol/L0.32mol/L乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、0.32mol/L0.32mol/L丙丙丙丙酮酮。1.50%50%兔兔兔兔红细红细胞胞胞胞悬悬液的制液的制液的制液的制备备（制（制（制（制备备流程如下）流程如下）流程如下）流程如下） ： 以无菌方法抽取以无菌方法抽取以无菌方法抽取以无菌方法抽取鸡鸡静脉血液（静脉血液（静脉血液（静脉血液（1 mL1 mL兔血加兔血加兔血加兔血加0.9%0.9%生理生理生理生理盐盐水水水水9
7、mL9 mL）混匀，离心（）混匀，离心（）混匀，离心（）混匀，离心（3000rpm3000rpm）5min5min 弃上清弃上清弃上清弃上清 取沉淀取沉淀取沉淀取沉淀 加加加加0.9%0.9%生理生理生理生理盐盐水，水，水，水， 离心（离心（离心（离心（3000rpm3000rpm）5min5min，重复，重复，重复，重复3 3次次次次 弃上清弃上清弃上清弃上清 取沉淀，用生理取沉淀，用生理取沉淀，用生理取沉淀，用生理盐盐水稀水稀水稀水稀释释， 制成制成制成制成50%50%鸡红细鸡红细胞胞胞胞悬悬液液液液备备用用用用四、四、实验方法与步方法与步骤四、四、四、四、实验实验方法与步方法与步方法与步
8、方法与步骤骤2.溶血溶血溶血溶血现现象的象的象的象的观观察：察：察：察： 取取取取试试管管管管2 2支，分支，分支，分支，分别别加入加入加入加入0.017mol/L0.017mol/L氯氯化化化化钠钠和和和和0.032mol/L0.032mol/L葡葡葡葡萄糖低渗溶液萄糖低渗溶液萄糖低渗溶液萄糖低渗溶液3ml 3ml ，再加入，再加入，再加入，再加入2 2滴制滴制滴制滴制备备好的好的好的好的50%50%鸡红细鸡红细胞胞胞胞悬悬液，注意液，注意液，注意液，注意观观察溶液察溶液察溶液察溶液颜颜色的色的色的色的变变化，由不透明的化，由不透明的化，由不透明的化，由不透明的红红色色色色悬悬液液液液变变成
9、透明的血成透明的血成透明的血成透明的血红红蛋白溶液（蛋白溶液（蛋白溶液（蛋白溶液（红细红细胞胞胞胞发发生破裂，造成生破裂，造成生破裂，造成生破裂，造成100%100%红细红细胞溶血，使光胞溶血，使光胞溶血，使光胞溶血，使光线线比比比比较较容易透容易透容易透容易透过过溶液）。溶液）。溶液）。溶液）。四、四、四、四、实验实验方法与步方法与步方法与步方法与步骤骤3.红细红细胞的渗透性胞的渗透性胞的渗透性胞的渗透性（1 1）取）取）取）取试试管一支，加入管一支，加入管一支，加入管一支，加入017mol/L017mol/L氯氯化化化化钠钠溶液溶液溶液溶液3ml3ml，再加，再加，再加，再加入入入入2 2
10、滴制滴制滴制滴制备备好的好的好的好的50%50%鸡红细鸡红细胞胞胞胞悬悬液，液，液，液，轻轻摇动轻轻摇动，混匀，混匀，混匀，混匀后静置于温室中，后静置于温室中，后静置于温室中，后静置于温室中，观观察察察察试试管中管中管中管中发发生溶血的生溶血的生溶血的生溶血的时间时间及其及其及其及其变变化。化。化。化。uu注意是否有注意是否有注意是否有注意是否有颜颜色色色色变变化？是否有溶血化？是否有溶血化？是否有溶血化？是否有溶血现现象？象？象？象？为为什么？什么？什么？什么？四、四、四、四、实验实验方法与步方法与步方法与步方法与步骤骤（2 2）分）分）分）分别别在下列几种等渗溶液中在下列几种等渗溶液中在下
11、列几种等渗溶液中在下列几种等渗溶液中进进行行行行实验实验，步，步，步，步骤骤同（同（同（同（1 1）。）。）。）。 0.32mol/L0.32mol/L葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖 0.17mol/L0.17mol/L氯氯化化化化铵铵 0.17mol/L 0.17mol/L醋酸醋酸醋酸醋酸铵铵 0.17mol/L0.17mol/L硝酸硝酸硝酸硝酸钠钠 0.12mol/L 0.12mol/L草酸草酸草酸草酸铵铵 0.12mol/L0.12mol/L硫酸硫酸硫酸硫酸钠钠 0.32mol/L 0.32mol/L甘油甘油甘油甘油 0.32mol/L0.32mol/L乙醇乙醇乙醇乙醇 0.32mol/L0.
12、32mol/L丙丙丙丙酮酮五、注意事五、注意事五、注意事五、注意事项项1. 1.试试管中有管中有管中有管中有红细红细胞和胞和胞和胞和测试测试溶液溶液溶液溶液时时，不，不，不，不应强应强力力力力摇摇晃，以免晃，以免晃，以免晃，以免造成人造成人造成人造成人为为的的的的红细红细胞破裂。胞破裂。胞破裂。胞破裂。2. 2.目目目目测测法判断法判断法判断法判断标标准：快速溶血：；慢速溶血：准：快速溶血：；慢速溶血：准：快速溶血：；慢速溶血：准：快速溶血：；慢速溶血：或；不溶血：。或；不溶血：。或；不溶血：。或；不溶血：。3. 3. 溶血溶血溶血溶血现现象可用一象可用一象可用一象可用一张张有字的白有字的白有
13、字的白有字的白纸纸来来来来辅辅助助助助识别识别，能，能，能，能够够清楚清楚清楚清楚地透地透地透地透过过溶液看到溶液后方溶液看到溶液后方溶液看到溶液后方溶液看到溶液后方纸纸上清晰的字迹上清晰的字迹上清晰的字迹上清晰的字迹时时，为为完全完全完全完全溶血。溶血。溶血。溶血。4. 4.因相因相因相因相对对分子分子分子分子质质量大小量大小量大小量大小对对膜通透性有影响，所以将溶血膜通透性有影响，所以将溶血膜通透性有影响，所以将溶血膜通透性有影响，所以将溶血时间时间适当地延适当地延适当地延适当地延长长至至至至15min15min，15min15min时时 仍然不溶即判断仍然不溶即判断仍然不溶即判断仍然不溶
14、即判断为为不溶血。不溶血。不溶血。不溶血。编号编号溶液种类溶液种类是否溶血是否溶血溶血所溶血所需时间需时间结果分析结果分析1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010六、作六、作六、作六、作业业记录观记录观察到的察到的察到的察到的现现象，并象，并象，并象，并对实验结对实验结果果果果进进行分析和比行分析和比行分析和比行分析和比较较。实验实验二二二二 鸡鸡血血血血细细胞的体外融合胞的体外融合胞的体外融合胞的体外融合试验试验一、一、一、一、实验实验目的与要求目的与要求目的与要求目的与要求1.掌握掌握掌握掌握PEGPEG体外体外体外体外诱导细诱导细胞融合的原理和基本方法。胞融合的原理
15、和基本方法。胞融合的原理和基本方法。胞融合的原理和基本方法。2.掌握在光学掌握在光学掌握在光学掌握在光学显显微微微微镜镜下融合下融合下融合下融合细细胞的形胞的形胞的形胞的形态态特征。特征。特征。特征。1. 1.细细胞融合是用人工的方法胞融合是用人工的方法胞融合是用人工的方法胞融合是用人工的方法使两个或以上的使两个或以上的使两个或以上的使两个或以上的细细胞融合胞融合胞融合胞融合成异核成异核成异核成异核细细胞。异核胞。异核胞。异核胞。异核细细胞可胞可胞可胞可进进入有入有入有入有丝丝分裂，使来自两分裂，使来自两分裂，使来自两分裂，使来自两个个个个亲亲本本本本细细胞的基因胞的基因胞的基因胞的基因组组合
16、在合在合在合在一起，形成只含一个一起，形成只含一个一起，形成只含一个一起，形成只含一个细细胞胞胞胞核的核的核的核的杂杂种种种种细细胞。胞。胞。胞。二、二、二、二、实验实验原理原理原理原理2. 2.PEGPEG溶液作溶液作溶液作溶液作为为助融助融助融助融剂剂可改可改可改可改变变各各各各类细类细胞的膜胞的膜胞的膜胞的膜结结构，使两构，使两构，使两构，使两细细胞接触胞接触胞接触胞接触点点点点处处脂脂脂脂类类分子分子分子分子发发生疏生疏生疏生疏散和重散和重散和重散和重组组，引起，引起，引起，引起细细胞胞胞胞融合。融合。融合。融合。二、二、二、二、实验实验原理原理原理原理3. 3.细细胞融合的胞融合的胞
17、融合的胞融合的频频率和活力与所用率和活力与所用率和活力与所用率和活力与所用 PEGPEG的分子的分子的分子的分子质质量、量、量、量、浓浓度、作用度、作用度、作用度、作用时间时间以及以及以及以及细细胞的生理状胞的生理状胞的生理状胞的生理状态态及密度等有及密度等有及密度等有及密度等有关。本方法用分子关。本方法用分子关。本方法用分子关。本方法用分子质质量量量量为为400400 60006000的的的的PEGPEG溶液溶液溶液溶液可引起可引起可引起可引起细细胞的聚集和粘胞的聚集和粘胞的聚集和粘胞的聚集和粘连连，产产生高生高生高生高频频率的率的率的率的细细胞融胞融胞融胞融合。合。合。合。二、二、二、二、
18、实验实验原理原理原理原理三、三、三、三、实验实验材料、材料、材料、材料、仪仪器和器和器和器和试剂试剂1. 1. 材料：成年家材料：成年家材料：成年家材料：成年家鸡鸡。2. 2. 主要主要主要主要仪仪器：器：器：器： 注射器、刻度离心管、离心机、血注射器、刻度离心管、离心机、血注射器、刻度离心管、离心机、血注射器、刻度离心管、离心机、血细细胞胞胞胞计计数板、水浴数板、水浴数板、水浴数板、水浴锅锅、滴管、滴管、滴管、滴管、显显微微微微镜镜、烧烧杯、容量瓶、凹面杯、容量瓶、凹面杯、容量瓶、凹面杯、容量瓶、凹面载载玻片、盖玻片、玻片、盖玻片、玻片、盖玻片、玻片、盖玻片、酒精灯等。酒精灯等。酒精灯等。酒
19、精灯等。3. 3. 主要主要主要主要试剂试剂： 0.85% NaCl 0.85% NaCl溶液、溶液、溶液、溶液、GKNGKN液、液、液、液、50%50%（W/VW/V）PEG400PEG400溶液、溶液、溶液、溶液、HanksHanks液、液、液、液、0.5%0.5%酚酚酚酚红红、Janus green Janus green 染液等。染液等。染液等。染液等。 1. 1. 鸡鸡血血血血细细胞胞胞胞悬悬液的制液的制液的制液的制备备 从家从家从家从家鸡鸡的翼根静脉采血制的翼根静脉采血制的翼根静脉采血制的翼根静脉采血制备备抗凝全血。抗凝全血。抗凝全血。抗凝全血。 加入加入加入加入4 4倍体倍体倍体
20、倍体积积的的的的0.85 %NaCl0.85 %NaCl溶液，制成溶液，制成溶液，制成溶液，制成红细红细胞胞胞胞储备储备液，保存于液，保存于液，保存于液，保存于44。取。取。取。取鸡鸡血血血血细细胞胞胞胞储备储备液液液液1ml1ml，加入，加入，加入，加入4ml 0.85 %NaCl4ml 0.85 %NaCl溶液，混匀溶液，混匀溶液，混匀溶液，混匀后，后，后，后，1200rpm1200rpm离心离心离心离心5min5min，弃去上清液，再加入，弃去上清液，再加入，弃去上清液，再加入，弃去上清液，再加入5ml 0.85 5ml 0.85 %NaCl%NaCl溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上
21、清液，溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，加入加入加入加入10ml10ml的的的的GKNGKN溶液制成溶液制成溶液制成溶液制成鸡鸡血血血血细细胞胞胞胞悬悬液。取液。取液。取液。取0.5ml0.5ml鸡鸡血血血血细细胞胞胞胞悬悬液，用液，用液，用液，用GKNGKN溶液稀溶液稀溶液稀溶液稀释释至至至至1X101X107 7个个个个/ml/ml，备备用。用。用。用。四、四、四、四、实验实验方法与步方法与步方法与步方法与步骤骤2. 2. 鸡鸡血血血血细细胞的收集胞的收集胞的收集胞的收集 吸取吸取吸取吸取1ml1m
22、l鸡鸡血血血血细细胞胞胞胞悬悬液放入离心管中，加入液放入离心管中，加入液放入离心管中，加入液放入离心管中，加入4mlHanks4mlHanks液液液液混匀，混匀，混匀，混匀，1000rpm1000rpm离心离心离心离心5min5min。弃去上清液，用手指。弃去上清液，用手指。弃去上清液，用手指。弃去上清液，用手指轻弹轻弹离离离离心管底部，使沉淀的血心管底部，使沉淀的血心管底部，使沉淀的血心管底部，使沉淀的血细细胞胞胞胞团块团块松散。松散。松散。松散。3. PEG3. PEG诱导细诱导细胞融合胞融合胞融合胞融合 吸取吸取吸取吸取0.5ml 370.5ml 37的的的的50%PEG50%PEG溶液
23、，慢慢沿着离心管壁逐溶液，慢慢沿着离心管壁逐溶液，慢慢沿着离心管壁逐溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，滴加入，滴加入，滴加入，边边加加加加边轻摇边轻摇离心管，使离心管，使离心管，使离心管，使PEGPEG与与与与细细胞混匀，然后胞混匀，然后胞混匀，然后胞混匀，然后在在在在3737水浴中静置水浴中静置水浴中静置水浴中静置2min2min。 四、四、四、四、实验实验方法与步方法与步方法与步方法与步骤骤4. 4. 终终止止止止PEGPEG作用作用作用作用 缓缓慢加入慢加入慢加入慢加入5ml Hanks5ml Hanks液，液，液，液，轻轻轻轻吹打混匀，于吹打混匀，于吹打混匀，于吹打混匀，于3737水浴中
24、水浴中水浴中水浴中静置静置静置静置5min5min。5. 5. 细细胞胞胞胞悬悬液的制液的制液的制液的制备备 用吸管用吸管用吸管用吸管轻轻轻轻吹打吹打吹打吹打细细胞胞胞胞团团数次使数次使数次使数次使细细胞胞胞胞团团分散，分散，分散，分散，1000rpm1000rpm离离离离心心心心5min5min，使，使，使，使细细胞完全沉降。弃去上清液，加胞完全沉降。弃去上清液，加胞完全沉降。弃去上清液，加胞完全沉降。弃去上清液，加HanksHanks液，液，液，液，再离心一次，弃多数上清，留少再离心一次，弃多数上清，留少再离心一次，弃多数上清，留少再离心一次，弃多数上清，留少许许溶液，混匀。溶液，混匀。溶
25、液，混匀。溶液，混匀。四、四、四、四、实验实验方法与步方法与步方法与步方法与步骤骤四、四、四、四、实验实验方法与步方法与步方法与步方法与步骤骤6. 6. 计计算算算算细细胞融合率胞融合率胞融合率胞融合率 细细胞融合率是指在胞融合率是指在胞融合率是指在胞融合率是指在显显微微微微镜镜的的的的视视野内，已野内，已野内，已野内，已发发生融合的生融合的生融合的生融合的细细胞胞胞胞其其其其细细胞核胞核胞核胞核总总数与数与数与数与该视该视野内所有野内所有野内所有野内所有细细胞的胞的胞的胞的细细胞核胞核胞核胞核总总数之百分数之百分数之百分数之百分比。比。比。比。 融合率融合率融合率融合率 = = 视视野内融合
26、野内融合野内融合野内融合细细胞的核数胞的核数胞的核数胞的核数/ /视视野内野内野内野内细细胞的胞的胞的胞的总总核数核数核数核数100100 7. 7. 染色和染色和染色和染色和镜检镜检 吸取吸取吸取吸取细细胞胞胞胞悬悬液，在凹面液，在凹面液，在凹面液，在凹面载载玻片上滴一滴，加入玻片上滴一滴，加入玻片上滴一滴，加入玻片上滴一滴，加入Janus Janus greengreen染液混匀，染色染液混匀，染色染液混匀，染色染液混匀，染色3min3min后盖上盖玻片，在后盖上盖玻片，在后盖上盖玻片，在后盖上盖玻片，在显显微微微微镜镜下下下下观观察察察察细细胞融合情况（注意区胞融合情况（注意区胞融合情况
27、（注意区胞融合情况（注意区分分分分细细胞融合与胞融合与胞融合与胞融合与细细胞重叠）。胞重叠）。胞重叠）。胞重叠）。四、四、四、四、实验实验方法与步方法与步方法与步方法与步骤骤五、注意事五、注意事五、注意事五、注意事项项1. 1. 高高高高CaCa2+2+浓浓度能度能度能度能够够提高提高提高提高细细胞融合率。有些抗凝胞融合率。有些抗凝胞融合率。有些抗凝胞融合率。有些抗凝剂剂中含有和中含有和中含有和中含有和CaCa2+2+结结合的化合物，与血液中的合的化合物，与血液中的合的化合物，与血液中的合的化合物，与血液中的CaCa2+2+形成形成形成形成难难解离的可溶解离的可溶解离的可溶解离的可溶性性性性络
28、络合物，合物，合物，合物，导导致血液中的致血液中的致血液中的致血液中的CaCa2+ 2+ 浓浓度降低，故起抗凝血作度降低，故起抗凝血作度降低，故起抗凝血作度降低，故起抗凝血作用，但同用，但同用，但同用，但同时时会造成会造成会造成会造成细细胞的融合率胞的融合率胞的融合率胞的融合率较较低。低。低。低。2. 2. 必必必必须严须严格控制格控制格控制格控制PEGPEG的作用的作用的作用的作用时间时间，通常，通常，通常，通常处处理理理理细细胞胞胞胞1 12min2min。PEGPEG和二甲基和二甲基和二甲基和二甲基亚砜亚砜（DMSODMSO）并用，可以提高）并用，可以提高）并用，可以提高）并用，可以提高
29、细细胞的融胞的融胞的融胞的融合率。合率。合率。合率。 3. 3. 融合融合融合融合细细胞胞胞胞继续继续培养就培养就培养就培养就变变成一个成一个成一个成一个杂杂种种种种细细胞，它的染色体数胞，它的染色体数胞，它的染色体数胞，它的染色体数不是两核的倍数，因不是两核的倍数，因不是两核的倍数，因不是两核的倍数，因为为一些染色体会逐一些染色体会逐一些染色体会逐一些染色体会逐渐渐消失。消失。消失。消失。 六、作六、作六、作六、作业业u绘细胞融合胞融合过程程图。实验实验三三三三 石蜡切片法石蜡切片法石蜡切片法石蜡切片法一一一一 、实验实验目的目的目的目的1.熟悉石蜡切片的制作熟悉石蜡切片的制作熟悉石蜡切片的
30、制作熟悉石蜡切片的制作过过程。程。程。程。2.掌握掌握掌握掌握HEHE染色的基本原理和染色方法。染色的基本原理和染色方法。染色的基本原理和染色方法。染色的基本原理和染色方法。 二、二、二、二、实验实验原理原理原理原理uu石蜡切片是最基本的切片技石蜡切片是最基本的切片技石蜡切片是最基本的切片技石蜡切片是最基本的切片技术术，冰，冰，冰，冰冻冻切片和超薄切片等都切片和超薄切片等都切片和超薄切片等都切片和超薄切片等都是在石蜡切片基是在石蜡切片基是在石蜡切片基是在石蜡切片基础础上上上上发发展起来的。展起来的。展起来的。展起来的。uu苏苏木素与伊木素与伊木素与伊木素与伊红对红对比染色法（比染色法（比染色法
31、（比染色法（简简称称称称H.E.H.E.对对染法）是染法）是染法）是染法）是组织组织切片切片切片切片最常用的染色方法。最常用的染色方法。最常用的染色方法。最常用的染色方法。这这种方法适用范种方法适用范种方法适用范种方法适用范围围广泛，广泛，广泛，广泛，对组织细对组织细胞胞胞胞的各种成分都可着色，便于全面的各种成分都可着色，便于全面的各种成分都可着色，便于全面的各种成分都可着色，便于全面观观察察察察组织组织构造，而且适用构造，而且适用构造，而且适用构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可于各种固定液固定
32、的材料，染色后不易褪色可长长期保存。期保存。期保存。期保存。经过经过HEHE染色，染色，染色，染色，细细胞核被胞核被胞核被胞核被苏苏木素染成木素染成木素染成木素染成蓝蓝紫色，紫色，紫色，紫色，细细胞胞胞胞质质被伊被伊被伊被伊红红染色呈粉染色呈粉染色呈粉染色呈粉红红色。色。色。色。 三三三三 、实验实验用品用品用品用品1. 1. 器材器材器材器材 切片机、水浴切片机、水浴切片机、水浴切片机、水浴锅锅、染色缸、玻片、染色缸、玻片、染色缸、玻片、染色缸、玻片、显显微微微微镜镜、试剂试剂瓶、剪刀、瓶、剪刀、瓶、剪刀、瓶、剪刀、镊镊子、烘箱、离心管或青霉素瓶子。子、烘箱、离心管或青霉素瓶子。子、烘箱、离
33、心管或青霉素瓶子。子、烘箱、离心管或青霉素瓶子。2. 2. 试剂试剂 苏苏木色精、伊木色精、伊木色精、伊木色精、伊红红、二甲苯、中性、二甲苯、中性、二甲苯、中性、二甲苯、中性树树胶、酒精、石蜡、氨水、胶、酒精、石蜡、氨水、胶、酒精、石蜡、氨水、胶、酒精、石蜡、氨水、盐盐酸、蛋清、甘油。酸、蛋清、甘油。酸、蛋清、甘油。酸、蛋清、甘油。3. 3. 试验试验材料材料材料材料 罗罗非非非非鱼鱼肝肝肝肝脏组织脏组织四、四、四、四、实验实验步步步步骤骤1 1、取材、取材、取材、取材2 2、固定、固定、固定、固定3 3、漂洗、漂洗、漂洗、漂洗4 4、脱水、脱水、脱水、脱水5 5、透明、透明、透明、透明6 6
34、、透蜡、透蜡、透蜡、透蜡7 7、包埋、包埋、包埋、包埋8 8、修、修、修、修块块9 9、切片、切片、切片、切片1010、染色、染色、染色、染色1. 1. 取材到切片取材到切片取材到切片取材到切片uu取材取材取材取材固定（固定（固定（固定（CannoysCannoys），材料厚度），材料厚度），材料厚度），材料厚度2mm2mm。uu100%100%酒精酒精酒精酒精100%100%酒精酒精酒精酒精二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯: :酒精（酒精（酒精（酒精（1:11:1）二二二二甲苯甲苯甲苯甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯: :石蜡（石蜡（石蜡（石蜡（65 1:165 1:1）石蜡石蜡
35、石蜡石蜡（6565）石蜡（石蜡（石蜡（石蜡（6565），以上），以上），以上），以上处处理各理各理各理各20min20min，最后一，最后一，最后一，最后一步石蜡也步石蜡也步石蜡也步石蜡也20min 20min 。uu包埋包埋包埋包埋修修修修块块切片切片切片切片贴贴片片片片2. 2. 脱蜡与复水脱蜡与复水脱蜡与复水脱蜡与复水uu二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯/ /无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇(1/1)(1/1)无水无水无水无水乙醇乙醇乙醇乙醇 无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇95%95%乙醇乙醇乙醇乙醇80%80%乙醇乙醇乙醇乙醇70%70%乙醇乙
36、醇乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇乙醇乙醇蒸蒸蒸蒸馏馏水。水。水。水。uu以上以上以上以上处处理各理各理各理各2-3min2-3min。3. 3. 染色与染色与染色与染色与观观察察察察uu1%1%苏苏木色精（木色精（木色精（木色精（5min5min）水洗水洗水洗水洗0.5%0.5%盐盐酸分色酸分色酸分色酸分色（数秒）（数秒）（数秒）（数秒）水洗水洗水洗水洗0.4%0.4%氨水氨水氨水氨水蓝蓝化化化化水洗（水洗（水洗（水洗（ 5min 5min ）70%70%酒精酒精酒精酒精80%80%酒精酒精酒精酒精1%1%伊伊伊伊红红（95%95%酒精酒精酒精酒精溶解）溶解）溶解）溶解）95%95%酒精酒精酒精
37、酒精95%95%酒精酒精酒精酒精100%100%酒精酒精酒精酒精100%100%酒精酒精酒精酒精酒精酒精酒精酒精/ /二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯中性中性中性中性树树胶封片。胶封片。胶封片。胶封片。uu未注明未注明未注明未注明时间时间的一律的一律的一律的一律处处理理理理2-3min2-3min。五、作五、作五、作五、作业业uu简简述石蜡切片述石蜡切片述石蜡切片述石蜡切片过过程，程，程，程，绘绘制你所制你所制你所制你所观观察到的察到的察到的察到的细细胞形胞形胞形胞形态态。uu提交一提交一提交一提交一张张你制作你制作你制作你制作较较好的玻片。好的玻片。好
38、的玻片。好的玻片。实验实验四四四四 植物植物植物植物细细胞骨架的胞骨架的胞骨架的胞骨架的观观察察察察一、一、一、一、实验实验目的目的目的目的1. 1.掌握考掌握考掌握考掌握考马马斯亮斯亮斯亮斯亮蓝蓝R250 R250 对对植物植物植物植物细细胞骨架染色的方法。胞骨架染色的方法。胞骨架染色的方法。胞骨架染色的方法。2. 2. 通通通通过对过对洋葱内皮洋葱内皮洋葱内皮洋葱内皮细细胞的胞的胞的胞的处处理，掌握植物理，掌握植物理，掌握植物理，掌握植物细细胞骨架的制胞骨架的制胞骨架的制胞骨架的制备备方法与方法与方法与方法与显显微形微形微形微形态观态观察。察。察。察。二、二、二、二、实验实验原理原理原理原
39、理uu细细胞骨架胞骨架胞骨架胞骨架(cytoskeleton)(cytoskeleton)，是，是，是，是细细胞内以蛋白胞内以蛋白胞内以蛋白胞内以蛋白质纤维为质纤维为主要主要主要主要成分的网成分的网成分的网成分的网络结络结构，根据蛋白构，根据蛋白构，根据蛋白构，根据蛋白质纤维质纤维的直径、的直径、的直径、的直径、组组成成分和成成分和成成分和成成分和组组装装装装结结构的不同可分构的不同可分构的不同可分构的不同可分为为微微微微丝丝、微管和中等、微管和中等、微管和中等、微管和中等纤维纤维。细细胞骨胞骨胞骨胞骨架架架架对对于于于于维维持持持持细细胞的形胞的形胞的形胞的形态结态结构及构及构及构及细细胞运
40、胞运胞运胞运动动、物、物、物、物质质运运运运输输、能、能、能、能量量量量转换转换、信号、信号、信号、信号传导传导和和和和细细胞分裂等有重要的作用。胞分裂等有重要的作用。胞分裂等有重要的作用。胞分裂等有重要的作用。uu本本本本试验试验采用去垢采用去垢采用去垢采用去垢剂剂TritonX-100 TritonX-100 的的的的缓缓冲液冲液冲液冲液处处理植物材料理植物材料理植物材料理植物材料时时，可将可将可将可将细细胞的膜胞的膜胞的膜胞的膜结结构和大部分蛋白构和大部分蛋白构和大部分蛋白构和大部分蛋白质质抽提掉，但抽提掉，但抽提掉，但抽提掉，但细细胞骨架胞骨架胞骨架胞骨架系系系系统统的蛋白却被保存下来
41、，后者用考的蛋白却被保存下来，后者用考的蛋白却被保存下来，后者用考的蛋白却被保存下来，后者用考马马斯亮斯亮斯亮斯亮蓝蓝R250 R250 染色，染色，染色，染色，在光学在光学在光学在光学显显微微微微镜镜下可下可下可下可见见一种网状一种网状一种网状一种网状结结构。构。构。构。三、三、三、三、实验实验用品用品用品用品1. 1. 试验试验材料材料材料材料 ： 洋葱洋葱洋葱洋葱2. 2. 器材：器材：器材：器材： 显显微微微微镜镜、载载玻片、滴管、擦玻片、滴管、擦玻片、滴管、擦玻片、滴管、擦镜纸镜纸、 PH PH 计计3. 3. 试剂试剂： 0.01mol/L 0.01mol/L 磷酸磷酸磷酸磷酸盐缓
42、盐缓冲生理冲生理冲生理冲生理盐盐水水水水(PBS)(PBS) 0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4 0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4缓缓冲液（冲液（冲液（冲液（PBPB，PH7.3PH7.3） 50ml50ml、0.15mol/L NaCl0.15mol/L NaCl、加双蒸、加双蒸、加双蒸、加双蒸馏馏水加至水加至水加至水加至1000ml1000mlPBPB 0.2mol/L Na2HPO4 77ml 0.2mol/L Na2HPO4 77ml 0.2mol/L NaH2PO4 23ml 0.2mol/L NaH2PO4 23mlM-M-缓缓冲液冲液冲液冲液 咪
43、咪咪咪唑唑(PH 6.7) 50mmol/L(PH 6.7) 50mmol/L KCl 50mmol/L KCl 50mmol/L MgC12 0.5mmol/L MgC12 0.5mmol/L EGTA 1mmol/L EGTA 1mmol/L EDTA 0.1mmol/L EDTA 0.1mmol/L 巯巯基乙醇基乙醇基乙醇基乙醇 1mmol/L1mmol/L 甘油甘油甘油甘油 4mmol/L4mmol/L 用用用用1mol/L HCl 1mol/L HCl 调调pH pH 至至至至7.27.2。1%1%的的的的Triton X-100/M-Triton X-100/M-缓缓冲液冲液冲液冲
44、液0.2%0.2%考考考考马马斯亮斯亮斯亮斯亮蓝蓝R250 R250 染液染液染液染液 甲醇甲醇甲醇甲醇 46.5ml46.5ml 冰醋酸冰醋酸冰醋酸冰醋酸 7ml7ml 蒸蒸蒸蒸馏馏水水水水 46.5ml46.5ml3%3%戊二戊二戊二戊二醛醛- PB - PB 溶液（溶液（溶液（溶液（pH7.3pH7.3） 四、四、四、四、实验实验步步步步骤骤 取洋葱内皮取洋葱内皮取洋葱内皮取洋葱内皮1cm 1cm 左右左右左右左右 置于含置于含置于含置于含PBS PBS 液的液的液的液的载载玻片上玻片上玻片上玻片上 湿湿湿湿润润后，吸去后，吸去后，吸去后，吸去PBSPBS 加加加加2 2 滴滴滴滴1%T
45、riton X-100/M-1%Triton X-100/M-缓缓冲液，冲液，冲液，冲液，5min5min 吸去吸去吸去吸去缓缓冲液，加冲液，加冲液，加冲液，加3%3%戊二戊二戊二戊二醛醛-PB -PB 溶液，固定溶液，固定溶液，固定溶液，固定30min30min 加加加加PBS PBS 洗洗洗洗2 2 次，共次，共次，共次，共3min3min 加加加加0.2%0.2%考考考考马马斯亮斯亮斯亮斯亮蓝蓝R250 R250 染色染色染色染色30min30min 用用用用PBS PBS 洗洗洗洗2 2 次，共次，共次，共次，共2min2min，吸干，吸干，吸干，吸干 镜检镜检并并并并绘图绘图五、注意
46、事五、注意事五、注意事五、注意事项项1.用去垢用去垢用去垢用去垢剂剂TritonX-100 TritonX-100 的的的的缓缓冲液冲液冲液冲液处处理材料理材料理材料理材料时时，应应控制在控制在控制在控制在30min 30min 左右。左右。左右。左右。2. 每一次加液或染色后，每一次加液或染色后，每一次加液或染色后，每一次加液或染色后，应应用用用用PBS PBS 洗洗洗洗2 2 次，次，次，次，并用并用并用并用滤纸滤纸吸干。吸干。吸干。吸干。六、作六、作六、作六、作业业1.画出画出画出画出实验实验所所所所观观察到的察到的察到的察到的细细胞骨架胞骨架胞骨架胞骨架图图，并注明放，并注明放，并注明放，并注明放大倍数。大倍数。大倍数。大倍数。2. 为为什么用什么用什么用什么用TritonX-100 TritonX-100 的的的的缓缓冲液冲液冲液冲液处处理材料？理材料？理材料？理材料？
