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1、蛋白质化学总复习蛋白质化学总复习课程内容课程内容第二章第二章 蛋白质的合成、转运、加工与修饰蛋白质的合成、转运、加工与修饰第三章第三章 蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能第四章第四章 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化第五章第五章 蛋白质定性定量检测蛋白质定性定量检测第六章第六章 蛋白质的生物信息学蛋白质的生物信息学第七章第七章 蛋白质组学理论与进展蛋白质组学理论与进展第八章第八章 蛋白质芯片理论与进展蛋白质芯片理论与进展第二章第二章 蛋白质的合成、转运、加蛋白质的合成、转运、加工与修饰工与修饰基本概念基本概念lSD序列序列/核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBS）l信号肽信号肽l分子伴侣分子
2、伴侣回答问题：回答问题：l1蛋白质在生物体内合成时所涉及的几个重要元素蛋白质在生物体内合成时所涉及的几个重要元素是什么？它们的结构特征及其在蛋白质生物合成中的是什么？它们的结构特征及其在蛋白质生物合成中的作用如何？作用如何？l2原核生物中蛋白质合成过程分哪几个阶段？对每原核生物中蛋白质合成过程分哪几个阶段？对每个阶段的过程描述；每个阶段所涉及的辅助因子及其个阶段的过程描述；每个阶段所涉及的辅助因子及其功能？功能？l3. 原核细胞与真核细胞的核糖体理化性质比较原核细胞与真核细胞的核糖体理化性质比较l4蛋白质在细胞内跨膜位移过程中所涉及的重要元蛋白质在细胞内跨膜位移过程中所涉及的重要元素有哪些？它
3、们的结构特征及其在蛋白跨膜机制中的素有哪些？它们的结构特征及其在蛋白跨膜机制中的作用如何？（简述分泌性蛋白质跨膜移位的信号假说）作用如何？（简述分泌性蛋白质跨膜移位的信号假说）l5蛋白质合成后一级结构上和高级结构上的修饰有蛋白质合成后一级结构上和高级结构上的修饰有哪些？理解分子伴侣的概念及其在蛋白折叠中的作用。哪些？理解分子伴侣的概念及其在蛋白折叠中的作用。（蛋白质合成后的加工与修饰）（蛋白质合成后的加工与修饰）第二章第二章 主要内容主要内容1蛋白质在生物体内合成时所涉及蛋白质在生物体内合成时所涉及的几个重要元素的几个重要元素2原核生物中蛋白质合成过程原核生物中蛋白质合成过程3蛋白质在细胞内跨
4、膜位移过程蛋白质在细胞内跨膜位移过程4. 蛋白质合成后的修饰蛋白质合成后的修饰1蛋白质在生物体内合成时所涉蛋白质在生物体内合成时所涉及的几个重要元素及的几个重要元素（1）信使）信使RNA（messenger RNA, mRNA）（2）遗传密码）遗传密码（3）核糖体）核糖体（4）转运）转运RNA（transfer RNA, tRNA）（1）信使）信使RNA（messenger RNA, mRNA）SD序列序列/核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBS）：原核细胞：原核细胞mRNA的翻译起的翻译起始密码子始密码子AUG的上游相距的上游相距813个核苷酸处有一段由个核苷酸处有一段由68个核个核苷酸组成
5、的富含嘌呤的序列，以苷酸组成的富含嘌呤的序列，以5-AGGAGG-3为核心，它与为核心，它与核糖体小亚基上的核糖体小亚基上的16S-rRNA 的近的近3末端处的一段短序列互补。末端处的一段短序列互补。（2）遗传密码）遗传密码三联体密码（三联体密码（triplet code）/密码子（密码子（codon）：mRNA采用每三个相邻碱基编码一个氨基酸。采用每三个相邻碱基编码一个氨基酸。61个密码分别代表各种氨基酸（个密码分别代表各种氨基酸（amino acid，aa）。）。一种一种aa少的只有少的只有1个密码（色氨酸和蛋氨酸），多的可个密码（色氨酸和蛋氨酸），多的可有有6个，但以个，但以2个和个和4
6、个居多。个居多。终止密码子终止密码子：UAA、UGA和和UAG。起始密码子起始密码子/蛋氨酸密码子蛋氨酸密码子：AUG（91）/GUG（8）。遗传密码的特点遗传密码的特点：遗传密码的连续性、通用性、简并：遗传密码的连续性、通用性、简并性、摆动性、不重叠性性、摆动性、不重叠性（3）核糖体）核糖体核糖体上的核糖体上的4个活性部位个活性部位：l受位受位/A位位：氨酰基位点。即接受氨酰：氨酰基位点。即接受氨酰-tRNA的部位。的部位。l供位供位/P位位：肽酰基位点。肽基：肽酰基位点。肽基-tRNA移交肽链后，移交肽链后，tRNA被释被释放的部位。放的部位。l肽基转移酶肽基转移酶/转肽酶位转肽酶位：肽链
7、合成过程中催化形成肽键的酶活：肽链合成过程中催化形成肽键的酶活性部位。性部位。lGTP酶位酶位：可水解：可水解GTP，为催化肽基，为催化肽基-tRNA由由A位转到位转到P位提位提供能量的酶活性部位。供能量的酶活性部位。核糖体的存在形式：核糖体的存在形式：l核糖体单体核糖体单体无蛋白合成功能无蛋白合成功能l多聚核糖体：与多聚核糖体：与mRNA结合结合具有蛋白合成功能具有蛋白合成功能游离核糖体游离核糖体结合核糖体（与内质网膜结合）结合核糖体（与内质网膜结合）原核细胞与真核细胞的核糖体理化性质比较（见课件）原核细胞与真核细胞的核糖体理化性质比较（见课件）（4）转运）转运RNA（transfer RN
8、A, tRNA）特点特点：分子量较小，沉降系数约为分子量较小，沉降系数约为4S，约占细胞中，约占细胞中RNA总含总含量的量的1015，在蛋白质合成时起搬运氨基酸的作用。它对，在蛋白质合成时起搬运氨基酸的作用。它对不同的氨基酸有特异性，一种不同的氨基酸有特异性，一种tRNA只能搬运一种氨基酸只能搬运一种氨基酸。与蛋白质合成有关的位点与蛋白质合成有关的位点l氨基酸（氨基酸（aa）结合位点）结合位点l反密码子位点反密码子位点l识别识别aa-tRNA合成酶的位点。合成酶的位点。翻译过程中行使翻译过程中行使“起动起动”作用的作用的tRNA：能特异地识别起：能特异地识别起始密码子始密码子AUG蛋氨酰蛋氨酰
9、-tRNA（真核细胞）；甲酰（真核细胞）；甲酰蛋氨酰蛋氨酰-tRNA（原核细胞或线粒体）（原核细胞或线粒体）氨酰氨酰-tRNA合成酶的专一性合成酶的专一性：l对对aa有极高的专一性，每种有极高的专一性，每种aa都有一个专一的酶。都有一个专一的酶。l只作用于只作用于L-氨基酸，不作用于氨基酸，不作用于D-氨基酸。氨基酸。l有的酶对有的酶对aa的专一性并不很高，但对的专一性并不很高，但对tRNA却有极高的专一性。却有极高的专一性。2原核生物中蛋白质合成过程原核生物中蛋白质合成过程（1）起始过程）起始过程（2）肽链延伸）肽链延伸（3）肽链合成的终止与释放）肽链合成的终止与释放（4）原核生物中蛋白质合
10、成过程所涉及）原核生物中蛋白质合成过程所涉及的蛋白因子的蛋白因子（1）起始过程）起始过程大小亚基分开（在大小亚基分开（在IF-3作用下）；作用下）；mRNA与小亚基结合与小亚基结合形成形成30S起始复合物：起始复合物：在在IF-2作用下，作用下，fMet-tRNAt与与mRNA分子中的分子中的AUG相结合（在相结合（在P位上），即位上），即密码子与反密码子密码子与反密码子配对，配对，形成形成30S起始复合物）起始复合物）大小亚基结合，形成有生物学功能的大小亚基结合，形成有生物学功能的70S起始复合物。起始复合物。此时核糖体的位被此时核糖体的位被fMet-tRNA和占据；和占据；而而A位则位则空
11、着空着，有待于对应，有待于对应mRNA中第二个密码的相应氨基酰中第二个密码的相应氨基酰tRNA进入，从而进入延伸阶段。进入，从而进入延伸阶段。（2）肽链延伸）肽链延伸进位：进位：Tu-GTP与与aa2- tRNA2结合成复合物；结合成复合物；aa2- tRNA2与与A位位点上点上mRNA密码子结合；重新生成密码子结合；重新生成Tu-GTP。肽键形成：肽键形成：在转肽酶作用下，形成肽键，成在转肽酶作用下，形成肽键，成2肽；肽；P位点上位点上fMet与与tRNA脱离；此时，脱离；此时，P位空出。位空出。移位：移位：在移位酶在移位酶(G)作用下，消耗作用下，消耗1个个GTP,核糖体沿核糖体沿mRNA
12、 53移动了移动了1个密码子的距离个密码子的距离.；A位上的肽酰位上的肽酰- tRNA到到P位，原位，原来来P位上无负载的位上无负载的tRNA离开核糖体。离开核糖体。(此时核糖体的此时核糖体的A位空着位空着， 有有待于接受下一个待于接受下一个aan- tRNAn)重复至肽链必需长度。重复至肽链必需长度。（3）肽链合成的终止与释放）肽链合成的终止与释放RF与与mRNA终止信号结合，激活转肽酶；终止信号结合，激活转肽酶；水解肽链和水解肽链和 tRNA间的键，新合成肽链、间的键，新合成肽链、tRNA、mRNA离开核糖体，后者即解离成大、小亚基，进入离开核糖体，后者即解离成大、小亚基，进入下一轮反应。
13、下一轮反应。（4 4）原核生物中蛋白质合成过程所涉）原核生物中蛋白质合成过程所涉及的蛋白因子及的蛋白因子起始因子（起始因子（IF1、IF2、IF3）lIF1：无专门功能，协助：无专门功能，协助IF2和和IF3的作用。的作用。lIF2：IF2先与先与GTP结合，再结合结合，再结合fmet-tRNA，形成，形成fmet-tRNA-IF2-GTP复合物，同时推动复合物，同时推动mRNA在在30S亚基上移动，使亚基上移动，使fmet-tRNA到到达达P位。位。lIF3：翻译起始时结合于核糖体：翻译起始时结合于核糖体30S亚基靠近亚基靠近50S亚基的边界，使大亚基的边界，使大小亚基拆离。小亚基拆离。延长
14、因子（延长因子（EF）lEF-Tu：按：按mRNA编码序列携带氨酰编码序列携带氨酰-tRNA进入进入A位。位。lEF-Ts：使：使EF-Tu和和GTP再生，参与肽链延长。再生，参与肽链延长。lEFG：具有转位酶活性。使肽酰：具有转位酶活性。使肽酰-tRNA从从A位转移到位转移到P位。位。释放因子（释放因子（RF，RR）lRF：辨认终止密码子和促进肽链：辨认终止密码子和促进肽链C端与端与tRNA 3-OH酯键的水解，使酯键的水解，使肽链从翻译中的核糖体上释放下来。肽链从翻译中的核糖体上释放下来。RF1：辨认：辨认UAA和和UAG，进入，进入A位。位。RF2：辨认：辨认UAA和和UGA，进入，进入
15、A位。位。RF3：激活核糖体上的转肽酶。转肽酶受：激活核糖体上的转肽酶。转肽酶受RF3作用后发生变构，表现出酯酶作用后发生变构，表现出酯酶的水解活性，水解肽酰的水解活性，水解肽酰-tRNA之间的酯键，使之间的酯键，使P位上的肽与位上的肽与tRNA分离。分离。lRR：使：使tRNA、mRNA及及RF均从核糖体脱落。均从核糖体脱落。3蛋白质在细胞内跨膜位移过程蛋白质在细胞内跨膜位移过程（1）信号假说中涉及的）信号假说中涉及的几个重要元素几个重要元素l信号肽信号肽 l信号识别颗粒（信号识别颗粒（SRP）l SRP受体（受体（SRP-R） l移位子（易位子）移位子（易位子）（2）蛋白质跨膜位移的机制蛋
16、白质跨膜位移的机制l l信号肽与信号肽与信号肽与信号肽与SRPSRP结合结合结合结合肽链延伸暂时终止肽链延伸暂时终止肽链延伸暂时终止肽链延伸暂时终止SRPSRP与与与与受体结合受体结合受体结合受体结合SRPSRP脱离信号肽脱离信号肽脱离信号肽脱离信号肽肽链在内质网上继肽链在内质网上继肽链在内质网上继肽链在内质网上继续合成，同时信号肽引导新生肽链进入内质网腔续合成，同时信号肽引导新生肽链进入内质网腔续合成，同时信号肽引导新生肽链进入内质网腔续合成，同时信号肽引导新生肽链进入内质网腔信号肽切除信号肽切除信号肽切除信号肽切除肽链延伸至终止。肽链延伸至终止。肽链延伸至终止。肽链延伸至终止。4. 蛋白质
17、合成后的蛋白质合成后的加工与加工与修饰修饰（1 1）一级结构的加工与修饰）一级结构的加工与修饰-共价修饰共价修饰l蛋白质前体的剪切。包括信号肽、前导肽或插入肽的剪切。蛋白质前体的剪切。包括信号肽、前导肽或插入肽的剪切。l氨基酸侧链的共价修饰。糖基化、羧基化、磷酸化、乙酰化、氨基酸侧链的共价修饰。糖基化、羧基化、磷酸化、乙酰化、甲基化、二硫键的形成（多肽链内或链间）和脂基化等。甲基化、二硫键的形成（多肽链内或链间）和脂基化等。l去除去除N-N-甲酰基或甲酰基或N-N-蛋氨酸。蛋氨酸。l水解修饰。指一条多肽链经翻译后加工产生多种不同活性的水解修饰。指一条多肽链经翻译后加工产生多种不同活性的蛋白质或
18、肽。蛋白质或肽。（2 2）高级结构的加工与修饰）高级结构的加工与修饰l蛋白质亚基的聚合蛋白质亚基的聚合具有四级结构的蛋白质由两条以上的具有四级结构的蛋白质由两条以上的肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体蛋白质。肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体蛋白质。l辅基链接辅基链接形成结合蛋白质。形成结合蛋白质。l分子伴侣（分子伴侣（molecular chaperones molecular chaperones ）：）：一类参与蛋白质的转一类参与蛋白质的转运、折叠、聚合和解聚、错误折叠后的重新折叠、水解以及运、折叠、聚合和解聚、错误折叠后的重新折叠、水解以及原始蛋白质活性的调控等一系列功能的保守蛋白质家族。
19、原始蛋白质活性的调控等一系列功能的保守蛋白质家族。第三章第三章 蛋白质的结构和功能蛋白质的结构和功能基本概念基本概念l氨基酸（氨基酸（ aa）的结构）的结构l物质的构型和构象物质的构型和构象l肽键与异肽键肽键与异肽键l肽单元肽单元/肽键平面肽键平面l蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构l蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构l蛋白质的超二级结构蛋白质的超二级结构l蛋白质的结构域蛋白质的结构域l蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构l蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构l结构生物学结构生物学l蛋白质工程蛋白质工程回答问题：回答问题：l1蛋白质的各种结构层次的基本概念和特点？蛋白质的各种结构层次的基本概念和特点？l2
20、. 肽键和异肽键的区别？肽键的结构特征。肽键和异肽键的区别？肽键的结构特征。l3. 二级结构的分类及其形成的内在原因？二级结构的分类及其形成的内在原因？-螺旋的螺旋的结构特点结构特点?-折叠折叠/-片层的结构特点片层的结构特点?-转角的结构转角的结构特点特点?l4. 蛋白质的超二级结构及其组合方式蛋白质的超二级结构及其组合方式 ；超二级结构；超二级结构和结构域的区别与联系。和结构域的区别与联系。l5. 维系蛋白三级结构的主要作用力有哪些？什么情维系蛋白三级结构的主要作用力有哪些？什么情况下蛋白质存在四级结构？况下蛋白质存在四级结构？l6 6蛋白质的生物学功能有哪些？蛋白质的生物学功能有哪些？蛋
21、白质的生物学功能有哪些？蛋白质的生物学功能有哪些？l l7 7结构生物学的基本概念？蛋白质工程的基本概念结构生物学的基本概念？蛋白质工程的基本概念？蛋白质工程与基因工程的区别与联系？蛋白质工程与基因工程的区别与联系？第三章第三章 主要内容主要内容1蛋白质的各种结构层次蛋白质的各种结构层次2蛋白质的生物学功能蛋白质的生物学功能3结构生物学结构生物学1蛋白质的各种结构层次蛋白质的各种结构层次蛋白质的基本结构单位蛋白质的基本结构单位 氨基酸和肽键氨基酸和肽键 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 蛋白质的超二级结构：蛋白质的超二级结构：在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构
22、常在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构组合常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构组合体。它们可直接作为三级结构的体。它们可直接作为三级结构的“建筑块建筑块”或结构域的组成单位，或结构域的组成单位，是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次，故称超二是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次，故称超二级结构。级结构。l目前发现的超二级结构有三种组合方式目前发现的超二级结构有三种组合方式：-螺旋组合螺旋组合()；-折折叠组合叠组合()和和-螺旋螺旋-折叠组合折叠组合()，其中以，其中以组合最为常组合最为常见。见。 蛋白质的结
23、构域蛋白质的结构域 ：是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级一个层次。在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的区域。一般每个结构域约由质亚基结构的区域。一般每个结构域约由100100200200个氨基酸残基个氨基酸残基组成，各有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。组成，各有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。 蛋白质的蛋白质的三级结构三级结构三级结构三级结构 蛋白质
24、的蛋白质的四级结构四级结构四级结构四级结构 2 2蛋白质的生物学功能蛋白质的生物学功能 酶的催化酶的催化机械支持机械支持运输和储存运输和储存协调动作协调动作免疫保护免疫保护生长和分化的控制生长和分化的控制神经冲动的传递神经冲动的传递细胞内信号转导细胞内信号转导跨膜运输跨膜运输电子传递电子传递3 3结构生物学结构生物学结构生物学：结构生物学：以分子生物物理学为基础，结合化学和分子生以分子生物物理学为基础，结合化学和分子生物学方法测定生物大分子复合体的空间结构、精细结构以及物学方法测定生物大分子复合体的空间结构、精细结构以及结构的运动，阐明其相互作用的规律和发挥生物功能的机制，结构的运动，阐明其相
25、互作用的规律和发挥生物功能的机制，从而揭示生命现象本质的科学从而揭示生命现象本质的科学 。蛋白质的结构生物学的研究方法蛋白质的结构生物学的研究方法l借助现代分析手段（借助现代分析手段（X X线晶体学、核磁共振及电子晶体学等）直接得线晶体学、核磁共振及电子晶体学等）直接得到蛋白质三维构象的信息；到蛋白质三维构象的信息；l借助数学模型、计算机软件等工具，根据蛋白质的一级结构来预测借助数学模型、计算机软件等工具，根据蛋白质的一级结构来预测其空间结构。其空间结构。l利用蛋白质工程的技术手段，得到非天然存在的蛋白质。利用蛋白质工程的技术手段，得到非天然存在的蛋白质。蛋白质工程蛋白质工程是指通过蛋白质化学
26、、蛋白质晶体学和蛋白质动是指通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学等研究获取关于蛋白质结构和物化性质等方面的信息，力学等研究获取关于蛋白质结构和物化性质等方面的信息，在此基础上对编码该蛋白的基因进行有目的的设计改造，并在此基础上对编码该蛋白的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终将其投通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终将其投入实际应用。它以现有蛋白质的结构与功能为入实际应用。它以现有蛋白质的结构与功能为基础基础，以制造，以制造具有新性能的新型蛋白质为最终目的。具有新性能的新型蛋白质为最终目的。第四章第四章 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化基本
27、概念基本概念l蛋白质的等电点蛋白质的等电点l蛋白质的变性、蛋白质的复性蛋白质的变性、蛋白质的复性l蛋白质的沉淀、盐析法蛋白质的沉淀、盐析法l蛋白质的结絮作用、蛋白质的凝固蛋白质的结絮作用、蛋白质的凝固l蛋白质的紫外吸收、蛋白质的呈色反应蛋白质的紫外吸收、蛋白质的呈色反应l差速离心、密度梯度离心差速离心、密度梯度离心l聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、）、SDS-PAGEl梯度胶电泳梯度胶电泳l等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（IEF）lIEF/SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2-DE） l毛细管电泳毛细管电泳l 回答问题：回答问题：l1蛋白质有哪些理
28、化性质？等电点、酸性蛋白、碱性蛋白质有哪些理化性质？等电点、酸性蛋白、碱性蛋白的概念？可逆沉淀和不可逆沉淀、可逆变性和不蛋白的概念？可逆沉淀和不可逆沉淀、可逆变性和不可逆变性的概念？可逆变性的概念？l2蛋白质分离纯化的常用方法有哪些？理解每种方法蛋白质分离纯化的常用方法有哪些？理解每种方法的基本原理和分类的基本原理和分类分离纯化蛋白质样品的常用沉分离纯化蛋白质样品的常用沉淀法有哪几种？膜分离法的分类。淀法有哪几种？膜分离法的分类。l l3 3电泳技术的基本原理和分类？常用的几种电泳技术电泳技术的基本原理和分类？常用的几种电泳技术电泳技术的基本原理和分类？常用的几种电泳技术电泳技术的基本原理和分
29、类？常用的几种电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳及毛细管电泳的基本原理和特点。聚丙烯酰胺凝胶电及毛细管电泳的基本原理和特点。聚丙烯酰胺凝胶电及毛细管电泳的基本原理和特点。聚丙烯酰胺凝胶电及毛细管电泳的基本原理和特点。聚丙烯酰胺凝胶电泳（泳（泳（泳（PAGEPAGE）中制备凝胶所涉及的组分及其作用；蛋白）中制备凝胶所涉及的组分及其作用；蛋白）中制备凝胶所涉及的组分及其作用；蛋白）中制备凝胶所涉及的组分及其作用；蛋白质被质被质被质被PAGEPAGE电泳所分离
30、主要基于的效应；电泳所分离主要基于的效应；电泳所分离主要基于的效应；电泳所分离主要基于的效应；SDS-PAGESDS-PAGE的的的的原理原理原理原理/ / SDS在在SDS-PAGE中的主要作用。中的主要作用。l4. IEF/SDS-PAGE与其单相电泳具体操作的差别；电与其单相电泳具体操作的差别；电泳后蛋白质的回收方法。泳后蛋白质的回收方法。第四章第四章 主要内容主要内容1. 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质2. 蛋白质分离纯化的常用方法蛋白质分离纯化的常用方法3. 电泳技术电泳技术1蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质 （1）蛋白质的两性电离特性）蛋白质的两性电离特性 （2）蛋白质的胶体性质
31、）蛋白质的胶体性质 （3）蛋白质的沉淀特性）蛋白质的沉淀特性 （4）蛋白质的变性）蛋白质的变性 （5）蛋白质的紫外吸收特性）蛋白质的紫外吸收特性 （6）蛋白质的显色反应）蛋白质的显色反应 （1）蛋白质的两性电离特性）蛋白质的两性电离特性蛋白质的等电点：当蛋白质溶液处于某一蛋白质的等电点：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。值称为蛋白质的等电点。酸性蛋白（酸性蛋白（pI7） 当蛋白质溶液的当蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋大于等电
32、点时，该蛋白质带负电荷，反之则带正电荷。白质带负电荷，反之则带正电荷。（2）蛋白质的胶体性质）蛋白质的胶体性质 由于蛋白质属高分子物质（分子量范围由于蛋白质属高分子物质（分子量范围101000 kDa），它在水中的颗粒大小约），它在水中的颗粒大小约1100nm，能够形成胶体溶液。，能够形成胶体溶液。蛋白质形成亲水胶体溶液的稳定因素：分子蛋白质形成亲水胶体溶液的稳定因素：分子表面的水化层和电荷层。表面的水化层和电荷层。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如扩蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如扩散慢、黏度大、不能透过半透膜等散慢、黏度大、不能透过半透膜等应用：由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半应用：
33、由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。子杂质除去。（3）蛋白质的沉淀特性）蛋白质的沉淀特性蛋白质的沉淀：蛋白质的沉淀：蛋白质分子凝聚而从溶液中析出蛋白质分子凝聚而从溶液中析出的现象。的现象。l 可逆沉淀：在沉淀过程中，结构和性质都没有发可逆沉淀：在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀（或可逆沉液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀（或可逆沉淀）。淀）。l不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋不可逆沉淀：在强
34、烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。质的变化，所以又称为变性沉淀。（4）蛋白质的变性）蛋白质的变性蛋白质的变性：蛋白质的变性：在某些物理或化学因素作用下，蛋白质的空间构象破在某些物理或化学因素作用下，蛋白质的空间构象破坏（不包括肽链的断裂等一级结构变化），导致蛋白质若干理化性质坏（不包括肽链的断裂等一级结构变化），导致蛋白质若
35、干理化性质和生物学活性的改变。和生物学活性的改变。l可逆变性：蛋白质在变性后，除去变性因素仍可恢复其活性，称为可逆变性：蛋白质在变性后，除去变性因素仍可恢复其活性，称为可逆变性（可逆变性也是蛋白纯化中常用的一种手段）。可逆变性（可逆变性也是蛋白纯化中常用的一种手段）。l不可逆变性：蛋白质变性时其空间结构严重破坏，除去变性因素后不可逆变性：蛋白质变性时其空间结构严重破坏，除去变性因素后不能恢复其生物学活性，称为不可逆变性。不能恢复其生物学活性，称为不可逆变性。蛋白质变性的因素：蛋白质变性的因素：l物理因素：高温、高压、紫外线、物理因素：高温、高压、紫外线、X射线照射、超声波、剧烈震荡和射线照射、
36、超声波、剧烈震荡和剧烈搅拌等。剧烈搅拌等。l化学因素：强酸、强碱、重金属盐、有机溶剂、尿素和十二烷基磺化学因素：强酸、强碱、重金属盐、有机溶剂、尿素和十二烷基磺酸钠（酸钠（SDS）等。）等。生物学活性的丧失并不一定完全是变性的结果，如蛋白质肽链水解断生物学活性的丧失并不一定完全是变性的结果，如蛋白质肽链水解断裂、去除辅基和应用抑制剂等，均可导致蛋白质失活。裂、去除辅基和应用抑制剂等，均可导致蛋白质失活。蛋白质的复性蛋白质的复性：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原来的构象及功能。质仍可恢复或部分恢复其原来的构象及
37、功能。蛋白质变性的发展蛋白质变性的发展l结絮作用：结絮作用：通过强酸通过强酸/强碱变性后的蛋白，当溶液的强碱变性后的蛋白，当溶液的pH调到其等电点调到其等电点时，蛋白质会形成絮状的不溶物，称为蛋白质的结絮作用。时，蛋白质会形成絮状的不溶物，称为蛋白质的结絮作用。l凝固作用：凝固作用：结絮后的蛋白进行加热后会变为比较坚固的凝块，称为结絮后的蛋白进行加热后会变为比较坚固的凝块，称为蛋白质的凝固作用。如：煮熟的鸡蛋、豆腐的形成等。蛋白质的凝固作用。如：煮熟的鸡蛋、豆腐的形成等。（5）蛋白质的紫外吸收特性）蛋白质的紫外吸收特性蛋白质分子中有含有蛋白质分子中有含有共轭双健共轭双健的酪氨酸、色的酪氨酸、色
38、氨酸等残基在氨酸等残基在280nm波长下具有最大光吸收。波长下具有最大光吸收。因此因此280nm的光吸收度是蛋白质的一种普遍的光吸收度是蛋白质的一种普遍性质。在一定波长范围内，蛋白质溶液在性质。在一定波长范围内，蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可作定量吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定。测定。（6）蛋白质的显色反应）蛋白质的显色反应 茚三酮反应：茚三酮反应：还原型的茚三酮可与氨基还原型的茚三酮可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再于另一分酸加热分解产生的氨结合，再于另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色的化合物。此子茚三酮缩合成为蓝紫色的化合物。此化合物的最大吸收峰在化合物的最大吸收峰在57
39、0 nm波长处。波长处。由于此吸收峰值的大小与氨基酸释放出由于此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比，因此可作为氨基酸定量的氨量成正比，因此可作为氨基酸定量分析方法。分析方法。双缩脲反应：双缩脲反应：蛋白质和多肽分子在碱性蛋白质和多肽分子在碱性溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，称为双缩脲反应。称为双缩脲反应。2蛋白质分离纯化的常用方法蛋白质分离纯化的常用方法（1）离心法）离心法（2）沉淀法）沉淀法 （3）膜分离法）膜分离法 （1）离心法）离心法沉降速度法沉降速度法/差速离心：差速离心：如果两种蛋白质的沉降系数相差一个如果两种蛋白质的沉降系数相差一个数量
40、级以上，可用差速离心，反复多次达到分离效果。开始数量级以上，可用差速离心，反复多次达到分离效果。开始在一个较低的速度下离心，使沉降系数大的物质沉淀，其他在一个较低的速度下离心，使沉降系数大的物质沉淀，其他物质仍保留在溶液中。取上清，在更大的离心场中再离心，物质仍保留在溶液中。取上清，在更大的离心场中再离心，又会获得一些沉淀物质，如此反复多次，便可使混合物逐级又会获得一些沉淀物质，如此反复多次，便可使混合物逐级被分开。被分开。密度梯度离心：密度梯度离心：如果两种蛋白质的沉降系数相差不到一个数如果两种蛋白质的沉降系数相差不到一个数量级，用差速离心很难奏效，若改用密度梯度离心，便可获量级，用差速离心
41、很难奏效，若改用密度梯度离心，便可获得比较满意的分离效果。在离心管中造成一个梯度密度环境，得比较满意的分离效果。在离心管中造成一个梯度密度环境，使介质的最大密度大于分离物的最大密度。而后加入待分离使介质的最大密度大于分离物的最大密度。而后加入待分离物，在离心力的作用下，当分离物的密度与介质密度相等时，物，在离心力的作用下，当分离物的密度与介质密度相等时，分离物即停留在与其密度相同的区域，从而达到分离目的。分离物即停留在与其密度相同的区域，从而达到分离目的。l离心时离心管中的介质是不均一的，从近中心到远中心密度离心时离心管中的介质是不均一的，从近中心到远中心密度不断增加，形成梯度。常用的梯度介质
42、有甘油、蔗糖、溴化不断增加，形成梯度。常用的梯度介质有甘油、蔗糖、溴化钾、氯化铯。钾、氯化铯。（2）沉淀法）沉淀法等电点沉淀法：等电点沉淀法：蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。有机溶剂沉淀蛋白质：有机溶剂沉淀蛋白质：可与水混合的有机溶剂，如酒精、可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇和丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗甲醇和丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。盐析法：盐析法：在蛋白质溶液中
43、加入大量的中性盐以破坏蛋白在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出。常用的中性盐有硫酸铵、质的胶体稳定性而使其析出。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。硫酸钠、氯化钠等。有机聚合物沉淀法：有机聚合物沉淀法：有机聚合物沉淀法：有机聚合物沉淀法：有机有机聚合物聚合物聚合物聚合物沉淀剂与水分子通过氢沉淀剂与水分子通过氢键结合，使溶质溶解度降低，从而得到沉淀。沉淀剂键结合，使溶质溶解度降低，从而得到沉淀。沉淀剂为非离子聚合物，如：为非离子聚合物，如：PEGPEG聚乙二醇（聚乙二醇（PEG2000PEG2000、 PEG4000PEG4000和和PEG6000PEG6000）
44、、PVPPVP及葡聚糖等。及葡聚糖等。（3）膜分离法）膜分离法定义定义 分类分类根据推动力不同，可分为：根据推动力不同，可分为：透析法透析法（Dialysis，DS） （以膜两侧（以膜两侧的浓度差为推动力）的浓度差为推动力）膜过滤法膜过滤法（以膜两侧的压力差为推动力）（以膜两侧的压力差为推动力）根据膜孔径大小不同，膜过滤法可分为：根据膜孔径大小不同，膜过滤法可分为：微过滤微过滤（Microfiltration，MF）超滤超滤（Ultrafiltration，UF） 反渗透法反渗透法（Reverse osmosis，RO）纳滤法纳滤法(Nanofiltration， NF) 3电泳技术电泳技术（
45、1）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳（2）等电聚焦电泳）等电聚焦电泳（3）双向凝胶电泳）双向凝胶电泳（4）毛细管电泳）毛细管电泳（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶的形成原理：聚丙烯酰胺凝胶的形成原理：是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）和交联剂）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylamide，Bis），在加速剂四甲基乙二胺），在加速剂四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫酸铵（）和催化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。三维网状结构的凝胶。蛋白质被蛋白质被PAGE电泳所分
46、离，主要基于电泳所分离，主要基于电荷效应电荷效应和和分子筛效分子筛效应应。如果缓冲液系统为不连续系统，还要加上。如果缓冲液系统为不连续系统，还要加上浓缩效应浓缩效应（凝（凝胶浓度的不连续性、离子成分及胶浓度的不连续性、离子成分及pH的不连续性、电位梯度的不连续性、电位梯度的不连续性）。的不连续性）。当所分离的蛋白成分复杂、分子质量范围较大时，使用当所分离的蛋白成分复杂、分子质量范围较大时，使用浓度浓度梯度梯度PAGE进行分离效果更好。进行分离效果更好。l浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳是指随着凝胶浓度逐渐增高，凝是指随着凝胶浓度逐渐增高，凝胶孔径逐渐减小，不同大小蛋白质分子
47、的移动就会在不同的区胶孔径逐渐减小，不同大小蛋白质分子的移动就会在不同的区域受阻，形成较窄的区带。域受阻，形成较窄的区带。SDS-PAGE的原理的原理 SDS在在SDS-PAGE中的作用是什么？中的作用是什么？（2）等电聚焦电泳）等电聚焦电泳等电聚焦（等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）聚）聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理：丙烯酰胺凝胶电泳的原理：等电聚焦就是在等电聚焦就是在电解槽中放入载体两性电解质，当通以直流电解槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，即电时，即形成一个由阳极到阴极逐步增加的形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度梯度。蛋白质在此体系中因解离而带不同。蛋白质在此体
48、系中因解离而带不同的电荷，其泳动率也不同。各蛋白质分子泳的电荷，其泳动率也不同。各蛋白质分子泳动到各自的等电点时即停止移动，形成很窄动到各自的等电点时即停止移动，形成很窄的一个区带，彼此得以分离。的一个区带，彼此得以分离。（3）双向凝胶电泳）双向凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2-DE2-DE）的第一向）的第一向是等电聚焦电泳，第二向是是等电聚焦电泳，第二向是SDS-PAGESDS-PAGE。uIEF/SDS-PAGE的的第第一一相相常常用用柱柱状状电电泳泳，第二相常用第二相常用板状电泳板状电泳。u虽虽然然IEF/SDS-PAGE的的原原理理与与IEF-PAGE、SDS
49、-PAGE单单相相电电泳泳的的原原理理基基本本相相同同，但但在具体操作上却有较大的差别。在具体操作上却有较大的差别。u第一相的电泳分离系统与第一相的电泳分离系统与IEF-PAGE不同不同u第二相的加样操作与第二相的加样操作与SDS-PAGE不同不同第一相的电泳分离系统与第一相的电泳分离系统与IEF-PAGE不同不同u第第一一向向相相电电泳泳系系统统中中的的样样品品处处理理液液中中加加入入高高浓浓度度的的尿尿素素和和适适量量的的非非离离子子型型去去垢垢剂剂NP-40，还还需需加加入入二二硫硫苏苏糖糖醇醇（dithiothreitol，DTT）。）。u这这些些试试剂剂可可破破坏坏蛋蛋白白质质分分子
50、子内内的的二二硫硫键键，使使蛋蛋白白质质变变性性，有利于第二相中有利于第二相中蛋白质与蛋白质与SDS充分结合充分结合；u这这些些试试剂剂本本身身并并不不带带电电荷荷，不不会会影影响响蛋蛋白白质质原原有有的的电电荷荷量量和等电点。和等电点。l第一向电泳的环境温度保持在第一向电泳的环境温度保持在20203535。尿素在低温时容易析出，。尿素在低温时容易析出，在高温时容易分解。在高温时容易分解。第二相的加样操作与第二相的加样操作与SDS-PAGE不同不同第一向电泳结束后，凝胶柱用去离子水洗第一向电泳结束后，凝胶柱用去离子水洗3 3次，次，再放入第二向再放入第二向SDS-PAGESDS-PAGE的浓缩
51、胶缓冲液含的浓缩胶缓冲液含-巯基乙醇（巯基乙醇（-ME-ME）和）和SDSSDS中震荡平衡。中震荡平衡。使凝胶柱内原有的第一相电泳分离系统被第使凝胶柱内原有的第一相电泳分离系统被第二相的电泳分离系统所取代。二相的电泳分离系统所取代。-ME-ME使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，以便蛋白质与以便蛋白质与SDSSDS充分结合，从而完成第二向充分结合，从而完成第二向的样品处理。的样品处理。经平衡处理后的凝胶柱包埋在第二相的凝胶经平衡处理后的凝胶柱包埋在第二相的凝胶板上端，完成第二相电泳的加样。板上端，完成第二相电泳的加样。（4）毛细管电泳）毛细管电泳毛细管电泳（
52、毛细管电泳（CE）是在内径为）是在内径为25100 m的石英毛的石英毛细管中进行电泳。它的分离原理是被分离物质差速细管中进行电泳。它的分离原理是被分离物质差速运动的结果。运动的结果。在毛细管电泳中，物质主要有两种运动：在毛细管电泳中，物质主要有两种运动：电泳和电泳和电渗电渗。（理解电渗现象的基本概念）。（理解电渗现象的基本概念）物质粒子在毛细管中的运动速度是这两种运动速物质粒子在毛细管中的运动速度是这两种运动速度之和。通常电渗流的速度是电泳流速度的度之和。通常电渗流的速度是电泳流速度的57倍，因而粒子的速度主要由电渗速度决定，因而倍，因而粒子的速度主要由电渗速度决定，因而可以实现所有的样品组分
53、向同一方向泳动及正负可以实现所有的样品组分向同一方向泳动及正负离子的同时分离。离子的同时分离。正离子的泳动方向与电渗方向相同，最先流出；正离子的泳动方向与电渗方向相同，最先流出；中性离子的泳动速度为零，在正离子后流出；负中性离子的泳动速度为零，在正离子后流出；负离子的泳动方向与电渗方向相反，最后流出。离子的泳动方向与电渗方向相反，最后流出。第五章第五章 蛋白质的定性定量检测蛋白质的定性定量检测基本概念基本概念l免疫组织化学免疫组织化学lABC法法l l酶联免疫吸附实验（酶联免疫吸附实验（酶联免疫吸附实验（酶联免疫吸附实验（ELISAELISA）lWestern blotting/免疫印迹免疫印
54、迹回答问题：回答问题：l l1 1免疫组织化学基本概念和操作过程、显色免疫组织化学基本概念和操作过程、显色免疫组织化学基本概念和操作过程、显色免疫组织化学基本概念和操作过程、显色反应反应反应反应ABCABC法的基本原理及其操作过程。法的基本原理及其操作过程。法的基本原理及其操作过程。法的基本原理及其操作过程。l l2 2免疫组织化学的具体应用免疫组织化学的具体应用免疫组织化学的具体应用免疫组织化学的具体应用酶联免疫吸酶联免疫吸酶联免疫吸酶联免疫吸附实验（附实验（附实验（附实验（ELISAELISA）的基本原理和几种不同的实）的基本原理和几种不同的实）的基本原理和几种不同的实）的基本原理和几种不
55、同的实验方法；叙述使用双抗体夹心法验方法；叙述使用双抗体夹心法验方法；叙述使用双抗体夹心法验方法；叙述使用双抗体夹心法/ /三明治法检三明治法检三明治法检三明治法检测某种蛋白质的简要步骤。测某种蛋白质的简要步骤。测某种蛋白质的简要步骤。测某种蛋白质的简要步骤。l l3 3免疫印迹法的基本原理和实验过程；叙述免疫印迹法的基本原理和实验过程；叙述免疫印迹法的基本原理和实验过程；叙述免疫印迹法的基本原理和实验过程；叙述使用使用使用使用Western blot/Western blot/免疫印迹法检测某种蛋白免疫印迹法检测某种蛋白免疫印迹法检测某种蛋白免疫印迹法检测某种蛋白质的简要步骤质的简要步骤质的
56、简要步骤质的简要步骤l l4 4叙述各种蛋白质的定量检测方法的实验原叙述各种蛋白质的定量检测方法的实验原叙述各种蛋白质的定量检测方法的实验原叙述各种蛋白质的定量检测方法的实验原理。理。理。理。第五章第五章 主要内容主要内容1. 免疫组织化学免疫组织化学2. 酶联免疫吸附实验（酶联免疫吸附实验（ELISA）3. 免疫印迹法（免疫印迹法（ Western blotting ）4. 各种蛋白质的定量检测方法各种蛋白质的定量检测方法1. 免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学：免疫组织化学：免疫学与组织化学相结合的一个分支学科。以免疫学的免疫学与组织化学相结合的一个分支学科。以免疫学的抗原抗原- -抗体
57、反应为基础的理论，其可作为蛋白质定位、定性及半定量检抗体反应为基础的理论，其可作为蛋白质定位、定性及半定量检测的方法之一。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合测的方法之一。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜和电子显微镜等）的显像和放大作起来，借助显微镜（包括荧光显微镜和电子显微镜等）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），也可在原位显示相应的基因和基因表达产物。素、病原体以及受体等），也可在原位显示相应的基因和基因表
58、达产物。免疫组织化学的简要步骤包括：免疫组织化学的简要步骤包括：（1 1）抗体的制备。）抗体的制备。l1 1）抗原的提取和纯化。）抗原的提取和纯化。l2 2）免疫动物制备多克隆抗体或细胞融合制备单克隆抗体。）免疫动物制备多克隆抗体或细胞融合制备单克隆抗体。l3 3）抗体效价检测和纯化。）抗体效价检测和纯化。l4 4）标记复合物的制备。）标记复合物的制备。（2 2）抗原的检测。）抗原的检测。l1 1）细胞或组织切片的制备。）细胞或组织切片的制备。l2 2）免疫组织化学反应和显色。）免疫组织化学反应和显色。（3 3）结果观察和记录。）结果观察和记录。ABC法（法（avidin-biotin-enz
59、yme complex，ABC）：美籍华人：美籍华人Hsu于于1981年首次报道。它是以卵白素作为桥，把生物素化的抗体（二抗）与年首次报道。它是以卵白素作为桥，把生物素化的抗体（二抗）与生物素结合酶（如生物素标记的生物素结合酶（如生物素标记的HRP）连接起来，形成）连接起来，形成avidinbiotinenzyme complex，即，即ABC。ABC法的操作过程法的操作过程2. 酶联免疫吸附实验（酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理：基本原理：先将已知抗体或抗原结合在某种先将已知抗体或抗原结合在某种固体载体上，并保持其免疫活性；利用标记固体载体上，并保持其免疫活性；利用标记技术，将酶标记到
60、抗体（或抗原）上。测定技术，将酶标记到抗体（或抗原）上。测定时，将待测样本和酶标抗体或抗原按不同步时，将待测样本和酶标抗体或抗原按不同步骤与固体载体表面吸附的抗体或抗原发生反骤与固体载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，形成抗体应，形成抗体- -抗原复合物；加入酶反应底物，抗原复合物；加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度值根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度值的大小进行定性或定量分析。的大小进行定性或定量分析。实验方法（分类）实验方法（分类）l间接法（用于测定抗体的常用方法）间接法（用于测定抗体的常用方法） l双抗体夹心法（用于测定抗原的常用方法）双抗体夹心法（用于测定抗原的常用方
61、法）/桥连桥连ABC-ELISA夹心法夹心法l竞争法（用于测定抗原、半抗原及抗体）竞争法（用于测定抗原、半抗原及抗体）使用双抗体夹心法使用双抗体夹心法/三明治法检测某种蛋白质三明治法检测某种蛋白质向微孔板内加入单克隆抗体进行包被，向微孔板内加入单克隆抗体进行包被，4C4C反应反应24-24-36 h36 h。用用PBSTPBST洗涤洗涤3 3次。次。加入封闭液，加入封闭液，37C37C封闭反应封闭反应2 h2 h或或4C4C反应过夜。反应过夜。向微孔板内加入待侧样品，向微孔板内加入待侧样品，37C37C反应反应45-60 min45-60 min。用用PBSTPBST洗涤洗涤3 3次。次。向微
62、孔板内加入酶标抗体，向微孔板内加入酶标抗体，37C37C反应反应45-60 min45-60 min。用用PBSTPBST洗涤洗涤5 5次。次。显色反应。室温避光反应显色反应。室温避光反应15 min15 min。酶标议检测。酶标议检测。结果分析。结果分析。3免疫印迹法免疫印迹法Western blotting/免疫印迹：免疫印迹：蛋白样品经蛋白样品经过过SDS-PAGE分离后，转移到膜上，然后分离后，转移到膜上，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。它是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的它是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法，也可以作为确定
63、同一种蛋白的定性方法，也可以作为确定同一种蛋白在不同细胞或同一种细胞在不同条件蛋白在不同细胞或同一种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法。下的相对含量的半定量方法。应用：应用：使用使用Western blotting/免疫印迹法免疫印迹法检测某种蛋白质。检测某种蛋白质。使用免疫印迹法检测某种蛋白质使用免疫印迹法检测某种蛋白质用纯化的蛋白免疫小鼠，得到某种蛋白特异性的抗血用纯化的蛋白免疫小鼠，得到某种蛋白特异性的抗血清。清。制备样品，用制备样品，用SDS-PAGESDS-PAGE电泳分离。电泳分离。用半干式电转移法将蛋白转至用半干式电转移法将蛋白转至PVDFPVDF膜或膜或NCNC膜上。膜上。
64、将膜在封闭液中室温反应将膜在封闭液中室温反应45-60 min45-60 min。转移膜至用封闭液稀释的蛋白特异性的抗血清（一抗转移膜至用封闭液稀释的蛋白特异性的抗血清（一抗工作液）中，室温反应工作液）中，室温反应45-60 min45-60 min。TBSTTBST漂洗漂洗3 10 min3 10 min。转移膜至用封闭液稀释的碱性磷酸酶（转移膜至用封闭液稀释的碱性磷酸酶（APAP）偶联的羊）偶联的羊抗鼠抗鼠IgGIgG（二抗工作液）中，室温反应（二抗工作液）中，室温反应45-60 min45-60 min。TBSTTBST漂洗漂洗3 10 min3 10 min。显色反应。将膜浸泡在显色反
65、应。将膜浸泡在NBT/BCIPNBT/BCIP显色液中，避光静置，显色液中，避光静置，待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。4各种蛋白质的定量检测方法各种蛋白质的定量检测方法凯氏定氮法。凯氏定氮法。双缩脲法。双缩脲法。Folin-酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）。法）。紫外紫外-分光光度法。分光光度法。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250染色法。染色法。BCA法法。第六章第六章 蛋白质的生物信息学蛋白质的生物信息学理论理论基本概念基本概念l序列对比序列对比l序列的相似性（序列的相似性（similarity） l序列的同源性（序列的同源性（hom
66、ology） 直系同源直系同源旁系同源旁系同源l局部和整体相似性序列对比局部和整体相似性序列对比回答问题：回答问题：l l1 1蛋白质的生物信息学的概念及内容。蛋白质的生物信息学的概念及内容。蛋白质的生物信息学的概念及内容。蛋白质的生物信息学的概念及内容。l l2 2国际上最著名的三大国际上最著名的三大国际上最著名的三大国际上最著名的三大DNADNA数据库是什么？数据库是什么？数据库是什么？数据库是什么？ 3. 3. 世界上第一个专门从事蛋白质序列、结构、世界上第一个专门从事蛋白质序列、结构、世界上第一个专门从事蛋白质序列、结构、世界上第一个专门从事蛋白质序列、结构、功能和蛋白质功能和蛋白质功
67、能和蛋白质功能和蛋白质2D-PAGE2D-PAGE图谱等的分析网站是什图谱等的分析网站是什图谱等的分析网站是什图谱等的分析网站是什么？么？么？么？l l4 4序列对比和数据库搜索的基本概念：同源性序列对比和数据库搜索的基本概念：同源性序列对比和数据库搜索的基本概念：同源性序列对比和数据库搜索的基本概念：同源性和相似性的区别，数据库搜索和数据库查询的和相似性的区别，数据库搜索和数据库查询的和相似性的区别，数据库搜索和数据库查询的和相似性的区别，数据库搜索和数据库查询的区别。区别。区别。区别。l l5. 5. 简述序列对比的理论基础。简述序列对比的理论基础。简述序列对比的理论基础。简述序列对比的理
68、论基础。l l4 4较广泛的序列相似性搜索工具有那些？较广泛的序列相似性搜索工具有那些？较广泛的序列相似性搜索工具有那些？较广泛的序列相似性搜索工具有那些？第六章第六章 主要内容主要内容1蛋白质的生物信息学的概念及内蛋白质的生物信息学的概念及内容容2常用的几个常用的几个DNA数据库数据库3序列对比和数据库搜索序列对比和数据库搜索4生物信息学研究的主要工具生物信息学研究的主要工具1蛋白质的生物信息学的概念及内容蛋白质的生物信息学的概念及内容生物信息学的基本概念生物信息学的基本概念l广义上讲，生物信息学是对生物信息的获取、加工、储存、发布、广义上讲，生物信息学是对生物信息的获取、加工、储存、发布、
69、分析和解释，并综合运用数学、计算机科学和生物学等工具，以达分析和解释，并综合运用数学、计算机科学和生物学等工具，以达到理解数据中的生物学含义的目标。是生物与信息技术的结合。到理解数据中的生物学含义的目标。是生物与信息技术的结合。l狭义上讲，生物信息学是把基因组狭义上讲，生物信息学是把基因组DNA序列分析作为源头，找到基序列分析作为源头，找到基因组序列中代表蛋白质和因组序列中代表蛋白质和RNA基因的编码区，阐明非编码区的信息基因的编码区，阐明非编码区的信息实质，破译隐藏在实质，破译隐藏在DNA序列中的遗传规律；同时，在此基础上，归序列中的遗传规律；同时，在此基础上，归纳、整理与基因组遗传信息释放
70、及其调控相关的转录谱和蛋白质谱纳、整理与基因组遗传信息释放及其调控相关的转录谱和蛋白质谱的数据，从而揭示生命体的生长、发育、代谢和进化的规律。的数据，从而揭示生命体的生长、发育、代谢和进化的规律。生物信息学的研究内容生物信息学的研究内容l建立可以存放和管理大量生物信息学数据集建立可以存放和管理大量生物信息学数据集l开发确定大数据集中各成员关系的算法和统计方法，并设计一些相开发确定大数据集中各成员关系的算法和统计方法，并设计一些相应的工具软件。应的工具软件。l使用这些工具来分析和解释不同类型的生物数据，包括使用这些工具来分析和解释不同类型的生物数据，包括DNA、RNA和蛋白质序列、蛋白质结构、基
71、因表达及生化途径。和蛋白质序列、蛋白质结构、基因表达及生化途径。蛋白质生物信息学的主要内容蛋白质生物信息学的主要内容蛋白质生物信息学的主要内容蛋白质生物信息学的主要内容1.基因功能表达谱的研究，探讨基因在特定时空中的表达。基因功能表达谱的研究，探讨基因在特定时空中的表达。2.确确定定核核酸酸序序列列中中编编码码蛋蛋白白质质的的基基因因，了了解解蛋蛋白白质质的的功功能能及及其其分分子子基础，运用蛋白质结构模拟与分子设计进行功能预测基础，运用蛋白质结构模拟与分子设计进行功能预测3.对对已已知知的的各各种种代代谢谢途途径径和和相相关关的的生生物物分分子子的的结结构构和和功功能能及及它它们们之之间间的
72、的相相互互作作用用进进行行整整理理，用用以以研研究究细细胞胞发发育育、分分化化途途径径和和疾疾病病的的发发生生与与发发展展的的途途径径，并并将将这这些些信信息息与与生生命命体体和和生生命命过过程程的的生生理理生生化化信信息息相相结结合合，阐阐明明其其分分子子机机制制，最最终终进进行行蛋蛋白白质质及及核核酸酸的的分分子子设计设计、药物设计药物设计和和个体化的医疗保健设计个体化的医疗保健设计等。等。4.其其他他。例例如如，序序列列对对比比，结结构构对对比比；计计算算机机辅辅助助基基因因识识别别，非非编编码码区区分分析析；分分子子进进化化和和比比较较基基因因组组学学；基基因因芯芯片片设设计计；序序列
73、列重重叠叠群群装装配配；生生物物信信息息处处理理并并行行算算法法的的研研究究；蛋蛋白白质质组组学学数数据据分分析析等等等。等。2常用常用的几个的几个DNA数据库数据库美国国家生物技术信息中心（美国国家生物技术信息中心（NCBI）的）的GenBank数据库，数据库，欧洲生物信息学研究所（欧洲生物信息学研究所（EBI）维护的）维护的EMBL核酸序列数据库核酸序列数据库日本国立遗传学研究所（日本国立遗传学研究所（NIG）建立的日本）建立的日本DNA数据库（数据库（DDBJ），），并列为国际上最著名的三大并列为国际上最著名的三大DNA数据库。数据库。3序列对比和数据库搜索序列对比和数据库搜索在生物信息
74、学研究中，在生物信息学研究中，序列对比序列对比是最常用和最经典的一个研究手段。是最常用和最经典的一个研究手段。将研究对象进行相互比较来寻找研究对象可能具备的某些特性。从将研究对象进行相互比较来寻找研究对象可能具备的某些特性。从核酸及蛋白质的一级结构方面来分析序列的相同点和不同点，从而核酸及蛋白质的一级结构方面来分析序列的相同点和不同点，从而能够推测它们的结构、功能及进化上的联系。能够推测它们的结构、功能及进化上的联系。序列对比的理论基础是进化学说。序列对比的理论基础是进化学说。如果基因和蛋白质序列之间具有足如果基因和蛋白质序列之间具有足够的相似性，就推测两者可能有共同的进化祖先，经过序列内残基
75、够的相似性，就推测两者可能有共同的进化祖先，经过序列内残基的替换、缺失以及序列重组等遗传变异过程分别演化而来。的替换、缺失以及序列重组等遗传变异过程分别演化而来。序列的相似性（序列的相似性（similarity）：在序列对比中描述两条序列之间相同：在序列对比中描述两条序列之间相同碱基或氨基酸残基所占比例（可进行量化）碱基或氨基酸残基所占比例（可进行量化） 。序列的同源性（序列的同源性（homology）：指从大量数据中推断出的两个基因在：指从大量数据中推断出的两个基因在进化上具有共同祖先的结论（不可进行量化）进化上具有共同祖先的结论（不可进行量化） 。在生物信息学研究中，局部相似性序列对比更合
76、理，应用也比较广泛。在生物信息学研究中，局部相似性序列对比更合理，应用也比较广泛。其生物学基础是蛋白质功能结构域的高度保守性。所以，通过比较其生物学基础是蛋白质功能结构域的高度保守性。所以，通过比较分析保守位点上的残基可以对蛋白质的结构和功能进行预测。分析保守位点上的残基可以对蛋白质的结构和功能进行预测。4生物信息学研究的主要工具生物信息学研究的主要工具蛋白质分析专家系统蛋白质分析专家系统（Expert Protein Analysis System，ExPASy）是于）是于1994年年由瑞士生物信息学院（由瑞士生物信息学院（Swiss Institute of Bioinformatics，
77、SIB）创立的世界上第一）创立的世界上第一个分子生物学网站，个分子生物学网站，专门从事蛋白质序列、专门从事蛋白质序列、结构、功能和蛋白质结构、功能和蛋白质2D-PAGE图谱等的分图谱等的分析。析。较广泛的序列相似性搜索工具：较广泛的序列相似性搜索工具：FASTA、BLAST和和BLITZ等。等。第七章第七章 蛋白质组学理论与进展蛋白质组学理论与进展基本概念基本概念l基因组（基因组（genome）lDNA微阵列微阵列l蛋白质组蛋白质组l蛋白质组学蛋白质组学l表达蛋白质组学表达蛋白质组学l细胞图谱蛋白质组学细胞图谱蛋白质组学l串联质谱串联质谱l肽质量指纹谱肽质量指纹谱回答问题：回答问题：1. 蛋白
78、质组学的基本概念及意义。蛋白质组学的基本概念及意义。2. 蛋白质组和基因组的主要区别。蛋白质组和基因组的主要区别。3. 蛋白质组学研究的几个重要的技术平台。蛋白质组学研究的几个重要的技术平台。4. 二维电泳的基本原理和实验过程。二维电泳的基本原理和实验过程。5. 质谱技术的基本原理和质谱仪的组成部分。质谱技术的基本原理和质谱仪的组成部分。6. 两种常用的软电离技术的基本原理和特点，为两种常用的软电离技术的基本原理和特点，为什么它们可以用于生命科学领域的研究？什么它们可以用于生命科学领域的研究？7. 几种常用的质量分析器的基本原理和特点。几种常用的质量分析器的基本原理和特点。8. 质谱技术进行蛋
79、白质鉴定的基本流程。质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程。9. 质谱技术在蛋白质及多肽分析中的应用。质谱技术在蛋白质及多肽分析中的应用。10. 酵母双杂交的基本原理、缺陷及其发展。酵母双杂交的基本原理、缺陷及其发展。11. 蛋白质组学在医药学中的应用。蛋白质组学在医药学中的应用。 第七章第七章 主要内容主要内容1. 蛋白质组学的基本概念及意义蛋白质组学的基本概念及意义2蛋白质组学研究的几种重要的技蛋白质组学研究的几种重要的技术平台术平台3. 蛋白质组学在医药学中的应用蛋白质组学在医药学中的应用1. 蛋白质组学的基本概念及意义蛋白质组学的基本概念及意义基基因因组组（genome）：生生物物体体内内一
80、一套套完完整整单单倍倍体体的的遗遗传传物物质质的的总总和和。由由基基因因和和基基因因外外的的核核苷苷酸酸序序列列组组成成。包包括括基基因因组组DNA（某某些些病病毒毒为为RNA）、质质粒粒DNA、线线粒粒体体DNA和和叶叶绿绿体体DNA。DNA微微阵阵列列（DNA Microarray）又又称称为为基基因因芯芯片片（Gene Chip）或或DNA芯芯片片（DNA Chip），是是在在核核酸酸水水平平进进行行目目的的基基因因表表达达规规律律研研究究的的方方法法。它它采采用用原原位位合合成成或或直直接接点点样样的的方方法法将将DNA片片段段或或寡寡核核苷苷酸酸片片段段排排列列在在硅硅片片或或玻玻璃
81、璃等等介介质质上上形形成成微微阵阵列列，待待检检样样品品（cDNA）用用荧荧光光分分子子或或同同位位素素标标记记后后与与微微阵阵列列杂杂交交，通通过过信信号号扫扫描描及及计计算算机机分分析析即即可可获获得得样样品品中中大大量量的的基基因因序序列列及及表表达达信信息息，以以达达到到快快速速、高高效效和和高高通通量量地地分分析析基基因因表表达达规规律律的的目的。目的。蛋白质组：蛋白质组：指由一个基因组、细胞或组织表达的所有蛋白质。指由一个基因组、细胞或组织表达的所有蛋白质。 蛋白质组和基因组的主要区别：蛋白质组和基因组的主要区别：蛋白质组是动态的；基因组是相对恒定的。蛋白质组是动态的；基因组是相对
82、恒定的。蛋白质组学（蛋白质组学（proteomics）：）：从整体上研究细胞或组织内，特定的时间和空间内全部蛋白从整体上研究细胞或组织内，特定的时间和空间内全部蛋白质的组成及其相互作用规律的学科。通过蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位以及质的组成及其相互作用规律的学科。通过蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位以及相互作用等研究，阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，最终揭示蛋白质功能。相互作用等研究，阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，最终揭示蛋白质功能。l蛋白质组学按照研究的内容可以分为：表达蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学。蛋白质组学按照研究的内容可以分为：表达蛋白质组学和细
83、胞图谱蛋白质组学。表达蛋白质组学表达蛋白质组学研究在不同机体状态中细胞或组织中全部蛋白质的表达及其变化。研究在不同机体状态中细胞或组织中全部蛋白质的表达及其变化。细胞图谱蛋白质组学细胞图谱蛋白质组学主要研究蛋白质间的相互作用，以明确细胞的信号转导通路的复杂机制主要研究蛋白质间的相互作用，以明确细胞的信号转导通路的复杂机制等。等。蛋白质组学研究的意义：蛋白质组学研究的意义：蛋白质是基因表达的最终产物和基因功能的实施者，有其自身蛋白质是基因表达的最终产物和基因功能的实施者，有其自身特有的活动规律，例如，蛋白质的加工与修饰、转运定位、结特有的活动规律，例如，蛋白质的加工与修饰、转运定位、结构形成、代
84、谢以及蛋白质分子之间复杂的相互作用等，均无法构形成、代谢以及蛋白质分子之间复杂的相互作用等，均无法从基因组水平上的研究获知。从基因组水平上的研究获知。基因组内各个基因的表达随着机体内外环境的变化呈现不同的基因组内各个基因的表达随着机体内外环境的变化呈现不同的表达模式。即表达产物的种类和数量受到严格的调控而表现时表达模式。即表达产物的种类和数量受到严格的调控而表现时空特异性。不仅在同一机体的不同发育阶段有明显的差异，在空特异性。不仅在同一机体的不同发育阶段有明显的差异，在机体的不同组织和不同细胞中，以及生理状态和疾病状态也各机体的不同组织和不同细胞中，以及生理状态和疾病状态也各不相同。不相同。由
85、于蛋白质翻译后的加工与修饰，基因和蛋白质不是由于蛋白质翻译后的加工与修饰，基因和蛋白质不是1个基因个基因对应对应1个蛋白质的关系。个蛋白质的关系。1个基因可以产生多种蛋白质，而且形个基因可以产生多种蛋白质，而且形式各异。所以，蛋白质数量比基因更大，相互作用也更复杂。式各异。所以，蛋白质数量比基因更大，相互作用也更复杂。mRNA的丰度并不一定与蛋白质表达产物有直接的关系。的丰度并不一定与蛋白质表达产物有直接的关系。蛋白质组学研究是基因组学研究的重要补充和延伸。蛋白质组蛋白质组学研究是基因组学研究的重要补充和延伸。蛋白质组学的研究对揭示生命活动规律、探讨重大疾病机制、疾病诊断学的研究对揭示生命活动
86、规律、探讨重大疾病机制、疾病诊断和防治以及新药的开发等提供重要的理论基础。和防治以及新药的开发等提供重要的理论基础。2蛋白质组学研究的几种重要的蛋白质组学研究的几种重要的技术平台技术平台（1）二维电泳）二维电泳（2）质谱技术）质谱技术（3）酵母双杂交）酵母双杂交（4）蛋白质芯片）蛋白质芯片（1）二维电泳）二维电泳第一向是等电聚焦电泳，第二向是第一向是等电聚焦电泳，第二向是SDS-PAGE。第一向第一向IEF电泳系统中含有高浓度的电泳系统中含有高浓度的尿素尿素和适量的和适量的非离子型去垢非离子型去垢剂剂NP-40，而且蛋白质样品处理液中还需含有，而且蛋白质样品处理液中还需含有二硫苏糖醇二硫苏糖醇
87、（dithiothreitol，DTT）。l这些试剂可破坏蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质变性，有这些试剂可破坏蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质变性，有利于第二向中蛋白质变性后的肽链与利于第二向中蛋白质变性后的肽链与SDS充分结合；充分结合；l这些试剂本身并不带电荷，不会影响蛋白质原有的电荷量和这些试剂本身并不带电荷，不会影响蛋白质原有的电荷量和等电点。等电点。第一向电泳结束后，凝胶柱用去离子水洗第一向电泳结束后，凝胶柱用去离子水洗3次，再放入第二向次，再放入第二向SDS-PAGE的浓缩胶缓冲液含的浓缩胶缓冲液含-巯基乙醇（巯基乙醇（-ME）和和SDS中震荡平衡。中震荡平衡。l-ME使蛋白质分子中
88、的二硫键保持还原状态，以便蛋白质与使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，以便蛋白质与SDS充分结合，从而完成第二向的样品处理。充分结合，从而完成第二向的样品处理。第一向电泳的环境温度保持在第一向电泳的环境温度保持在2035。l尿素在低温时容易析出，在高温时容易分解。尿素在低温时容易析出，在高温时容易分解。电泳后蛋白质的回收方法包括：电泳后蛋白质的回收方法包括：扩散洗脱扩散洗脱和和电泳洗脱电泳洗脱。（2）质谱技术）质谱技术基本原理基本原理质谱仪组成质谱仪组成软电离技术软电离技术l基质辅助激光解吸电离源（基质辅助激光解吸电离源（MALDI） l电喷雾电离源（电喷雾电离源（ESI） 质量分析器质量分析
89、器l飞行时间（飞行时间（time of flight，TOF）分析器）分析器l四极杆分析器四极杆分析器 l离子阱分析器离子阱分析器 质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程1.1.样品制备后进行样品制备后进行2-DE2-DE分析。分析。2.2.将感兴趣的蛋白质点从凝胶上切割下来。将感兴趣的蛋白质点从凝胶上切割下来。3.3.凝凝胶胶上上的的蛋蛋白白质质经经胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化后后，断断裂裂成成多多个个肽肽段段。所得的肽片段质量用所得的肽片段质量用MALDI-TOP-MSMALDI-TOP-MS或或ESI-MSESI-MS进行测定。进行测定。4.4.将得到的肽质量指纹谱
90、的数据在数据库中进行搜索。将得到的肽质量指纹谱的数据在数据库中进行搜索。5.5.配配比比的的结结果果是是按按照照数数据据库库中中肽肽片片段段与与未未知知蛋蛋白白共共有有的的肽肽片片段段数数目目作作一一排排行行榜榜。“冠冠军军”蛋蛋白白质质具具有有与与未未知知蛋白质最相近的组分，从而进行蛋白质鉴定。蛋白质最相近的组分，从而进行蛋白质鉴定。 肽质量指纹谱（肽质量指纹谱（peptide mass fingerprint，PMF）由由Henzel等人于等人于1993年提出。年提出。原原理理：用用酶酶（最最常常用用的的是是胰胰蛋蛋白白酶酶）对对由由2-DE分分离离的的蛋蛋白白质质在在胶胶上上或或在在膜膜
91、上上于于精精氨氨酸酸或或赖赖氨氨酸酸的的C-末末端端处处进进行行断断裂裂，断断裂裂所所产产生生片片段段的的精精确确分分子子量量通通过过质质谱谱来来测测量量（MALDI-TOF-MS或或ESI-MS）。所所有有的的肽肽质质量量最最后后与与数数据据库库中中理理论论肽肽质质量量相相配配比比（理理论论肽肽是是由由实实验验所所用用的的酶酶来来“断断裂裂”蛋蛋白白质质所所产产生生的的）。配配比比的的结结果果是是按按照照数数据据库库中中肽肽片片段段与与未未知知蛋蛋白白共共有有的的肽肽片片段数目作一排行榜。段数目作一排行榜。 质谱技术在蛋白质及多肽分析中的应用：质谱技术在蛋白质及多肽分析中的应用：蛋白质的鉴定
92、蛋白质的鉴定磷酸化位点的分析磷酸化位点的分析（3）酵母双杂交技术）酵母双杂交技术酵母双杂交体系的基本原理：酵母双杂交体系的基本原理：由于真核生物转录激活因子由两部分独由于真核生物转录激活因子由两部分独立的结构域组成，即立的结构域组成，即DNADNA结合结构域（结合结构域（DNA binding domainDNA binding domain，BDBD）和转）和转录激活结构域（录激活结构域（activation domainactivation domain，ADAD）。将与）。将与BDBD融合的已知蛋白质融合的已知蛋白质作为作为“诱饵诱饵”，与，与ADAD融合的另一待测蛋白质作为融合的另一待
93、测蛋白质作为“猎物猎物”。如果两种。如果两种蛋白质在酵母细胞核内有相互作用时，则蛋白质在酵母细胞核内有相互作用时，则BDBD与与ADAD靠近并激活报告基因靠近并激活报告基因的转录，借此可研究蛋白质间的相互作用。的转录，借此可研究蛋白质间的相互作用。酵母双杂交系统的缺陷：酵母双杂交系统的缺陷：l不能检测到一些依靠翻译后修饰的相互作用（需用三杂交系统）。不能检测到一些依靠翻译后修饰的相互作用（需用三杂交系统）。l所得到的蛋白质相互作用信息可能存在所得到的蛋白质相互作用信息可能存在“假阴性假阴性”或或“假阳性假阳性”，还需通，还需通过进一步的验证加以确定和排除。过进一步的验证加以确定和排除。l该系统
94、并非对所有的蛋白质都适用。该系统并非对所有的蛋白质都适用。由于有些蛋白质本身有激活转录活性，不经过双杂交相互作用就能激活报由于有些蛋白质本身有激活转录活性，不经过双杂交相互作用就能激活报告基因的表达，因此酵母双杂交系统不适用。告基因的表达，因此酵母双杂交系统不适用。根据其原理，融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的，根据其原理，融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前已经在表达质粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必须经虽然目前已
95、经在表达质粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必须经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质，尤其是胞外蛋白，不能过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质，尤其是胞外蛋白，不能进入核内。进入核内。 酵母双杂交系统的发展酵母双杂交系统的发展发展酵母菌株的多重筛选机制发展酵母菌株的多重筛选机制表达型载体的改进表达型载体的改进酵母接合型的引用酵母接合型的引用Sos蛋蛋白白介介导导的的双双杂杂交交系系统统/Sos救救活活系系统统（Sos recruitment system）反向酵母双杂交系统反向酵母双杂交系统酵母三杂交系统酵母三杂交系统3. 蛋白质组学在医药学中的应用蛋白质组学在医药学中的应用
96、在基础医学和疾病机理研究中在基础医学和疾病机理研究中，应用蛋白质组学研究策，应用蛋白质组学研究策略高通量地分析不同生长发育期；不同生理和病理条件略高通量地分析不同生长发育期；不同生理和病理条件下；以及不同细胞类型的蛋白质表达谱的变化，通过对下；以及不同细胞类型的蛋白质表达谱的变化，通过对相应蛋白质的鉴定及其功能进行研究，可能找到直接与相应蛋白质的鉴定及其功能进行研究，可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，特定生理或病理状态相关的分子，发现新的疾病诊断标发现新的疾病诊断标志物及治疗靶点，从而有利于疾病的早期诊断和治疗。志物及治疗靶点，从而有利于疾病的早期诊断和治疗。药物筛选：药物筛选：由于
97、各种疾病的发生和药物治疗靶点大多数由于各种疾病的发生和药物治疗靶点大多数是在蛋白质（酶、受体或信号转导蛋白等）水平，蛋白是在蛋白质（酶、受体或信号转导蛋白等）水平，蛋白质组学在寻找有效的药物靶点及新药开发方面有广泛的质组学在寻找有效的药物靶点及新药开发方面有广泛的应用。通过比较正常状态和疾病状态、药物治疗前后细应用。通过比较正常状态和疾病状态、药物治疗前后细胞内蛋白质表达的差异，胞内蛋白质表达的差异，进行高通量的药物筛选，有可进行高通量的药物筛选，有可能找到有效的药物靶点。能找到有效的药物靶点。研究药物的毒理作用。研究药物的毒理作用。例如，例如，Steiner等利用蛋白组学等利用蛋白组学的方法
98、分析发现，在环孢素的方法分析发现，在环孢素A作用后的肾脏细胞作用后的肾脏细胞2-DE图图谱中发现一个谱中发现一个28 kDa的的calbindin-D特异蛋白质表达减特异蛋白质表达减少，现在已经证明环孢素少，现在已经证明环孢素A的毒性与这种参与钙离子结的毒性与这种参与钙离子结合及转运的蛋白质减少有关。合及转运的蛋白质减少有关。第八章第八章 生物芯片与蛋白质芯片生物芯片与蛋白质芯片1. 生物芯片及其特点、分类生物芯片及其特点、分类2. 蛋白质芯片及其特点、分类蛋白质芯片及其特点、分类3. 蛋白质芯片技术的简要操作步骤蛋白质芯片技术的简要操作步骤（以样品直接荧光标记为例）（以样品直接荧光标记为例）
99、1生物芯片生物芯片生生物物芯芯片片（biochip）：基基于于生生物物大大分分子子（核核酸酸和和蛋蛋白白质质等等）相相互互作作用用的的大大规规模模并并行行分分析析方方法法，并并结结合合微微电电子子学学、微微机机械械、化化学学、物物理理和和计计算算机机等等多多领领域域的的技技术术及及生生命命科科学学研研究究中中所所涉涉及及的的样样品品反反应应、检检测测和和分分析析等等连连续续化化、集集成成化化和和微微型型化化的的过过程程。它它以以载载玻玻片片和和硅硅等等材材料料为为载载体体，在在单单位位面面积积上上高高密密度度地地排排列列大大量量的的生生物物分分子子，从从而而达达到到一一次次试试验验同同时时检检
100、测测多多种种疾疾病病或或分分析析多多种种生物样品的目的生物样品的目的。生物芯片的特点生物芯片的特点：高度平行性；多样性；微型化；自动化。：高度平行性；多样性；微型化；自动化。生物芯片的分类生物芯片的分类：基因芯片：基因芯片/DNA芯片芯片/DNA微阵列；蛋白质芯微阵列；蛋白质芯片。片。2蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片是将各种微量纯化的蛋白质阵列是将各种微量纯化的蛋白质阵列在一种高密度的固相载体上，并与待测样品在一种高密度的固相载体上，并与待测样品杂交，以测定相应蛋白质的性质、特征以及杂交，以测定相应蛋白质的性质、特征以及蛋白质与生物大分子之间的相互作用的方法。蛋白质与生物大分子之间的
101、相互作用的方法。蛋白质芯片用于蛋白质组学研究时，通常把蛋白质芯片用于蛋白质组学研究时，通常把抗体固化制作成抗体固化制作成“蛋白质芯片的探针蛋白质芯片的探针”来检测来检测多种待测蛋白质，制成多种待测蛋白质，制成抗体芯片抗体芯片。蛋白质芯片的主要特点蛋白质芯片的主要特点:1.高高通通量量平平行行性性。一一次次实实验验可可同同时时检检测测成成千千上上万万种蛋白质种蛋白质，得到大量数据得到大量数据。2.具具有有抗抗原原抗抗体体结结合合的的高高特特异异性性和和亲亲和和力力。受受到到杂质影响较低杂质影响较低，检测前样品的处理较为简单检测前样品的处理较为简单。3.灵灵敏敏度度较较高高。相相对对传传统统的的E
102、LISA，由由于于采采用用光光敏敏染染料料标标记记，因因此此灵灵敏敏度度较较高高，检检测测水水平平可可达达到到1 g/mL。4.所需样品量少所需样品量少。5.具有较高的信噪比具有较高的信噪比，准确率高，重复性好。准确率高，重复性好。 6.操作自动化。操作自动化。蛋白质芯片分类：蛋白质芯片分类：按按制作方法和用途制作方法和用途分类：分类：u蛋白功能芯片蛋白功能芯片u将将所所研研究究体体系系中中的的每每种种天天然然蛋蛋白白质质都都点点加加在在芯芯片片上上，主主要要用用于于天天然然蛋蛋白白活活性及分子亲和性的高通量平行研究。性及分子亲和性的高通量平行研究。u蛋白检测芯片蛋白检测芯片u将将具具有有高高
103、度度亲亲和和特特异异性性的的探探针针分分子子作作为为配配基基固固定定在在芯芯片片上上，用用以以识识别别复复杂杂生生物物样样品品中中的的蛋蛋白白质质或或多多肽肽，通通过过检检测测分分析析从从而而判判断断样样品品中中靶靶分分子子的的性性质质及数量等。及数量等。主要用于疾病监测与诊断和蛋白质谱鉴定等。主要用于疾病监测与诊断和蛋白质谱鉴定等。按蛋白质性质分类：按蛋白质性质分类：u无活性芯片无活性芯片u 将已经合成好的蛋白质以高密度阵列点样在芯片上进行杂交反应。将已经合成好的蛋白质以高密度阵列点样在芯片上进行杂交反应。u有活性芯片有活性芯片u 将生物体直接点在芯片上，并原位表达蛋白质。将生物体直接点在芯
104、片上，并原位表达蛋白质。3. 蛋白质芯片技术的简要操作步骤蛋白质芯片技术的简要操作步骤l将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上制成检测用的芯片。载玻片等各种载体上制成检测用的芯片。l与待检样品反应。（样品可标记，也可不标与待检样品反应。（样品可标记，也可不标记）记）l与特定的标记抗体或其他分子反应。（对未与特定的标记抗体或其他分子反应。（对未标记样品）标记样品）l利用扫描仪测定芯片上各点的信号强度。利用扫描仪测定芯片上各点的信号强度。l通过信号强度分析蛋白质与蛋白质相互作用通过信号强度分析蛋白质与蛋白质相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。的。考试类型考试类型名词解释（名词解释（15分）分）填空题（填空题（20分）分）判断对错题（判断对错题（15分）分）简答题（简答题（30分）分）应用题（应用题（20分）分）
