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1、医学免疫学实验（三）免疫标记技术张蓓张蓓检测检测Ag-Ab的体外实验的体外实验123凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应免疫标免疫标记技术记技术标记免疫技术标记免疫技术=抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术常用的免疫标记物质常用的免疫标记物质类别 标记物 用途荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析
2、测定金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定 分分 类类免疫标记技术放射物标记技术免疫酶技术免疫酶技术免疫荧光技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法双抗体夹心法竞 争 法双抗原夹心法间 接 法双位一点法l主要试剂主要试剂: : 酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原l酶标物特点：酶标物特点： 免疫学活性免疫学活性 酶对底物的催化活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性酶高效催化反应的专一性ELISA ELISA 原理及特点原理及特点特点：特点：灵敏度高、特异性强、灵敏度高、特异性强、准确性好准确性好酶标记试
3、剂能够较长时酶标记试剂能够较长时间保持稳定间保持稳定操作简便、对环境没有操作简便、对环境没有污染。污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的衍生出适用范围更广的新方法新方法。原理：原理：酶标抗体（抗原）与抗原酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析定性或定量的测定分析 原理及特点原理及特点酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法（双位点一步双抗体夹心法（双位点一步法）测甲胎蛋白（法）测甲胎蛋白（AFP） 【临床意义】significanc
4、e in clinical practise1 1、原发性肝癌的大规模、原发性肝癌的大规模普查普查 2、可以用作检测胎儿畸形和畸胎瘤一、一、ELISA双抗体双抗体夹心法心法测AFP原理原理l用用抗抗AFP抗抗体体包包被被固固相相载体体，加加入入待待检标本本，标本本中中的的AFP与与固固相相载体体上上的的抗抗体体结合合，再再加加入入酶酶标记的的抗抗AFP抗抗体体，形形成成抗抗体体-抗抗原原-酶酶标抗抗体体复复合合物物，加加底底物物显色色，颜色色的的深深浅浅与与相相应AFP的的量量呈正相关。呈正相关。l双双位位点点一一步步法法：包包被被抗抗体体和和酶酶标标抗抗体体分分别别是是抗抗AFP不同位点的不
5、同位点的McAbELISA原原理理图图【实验原理】【实验原理】Experiments mechanismprincipleEAFPAb包被固相载包被固相载体体+S显色EE待测待测AFP抗抗AFP-E抗抗AFPMcAb抗体抗体抗抗AFPMcAb抗体抗体AFP双位点一步法：抗双位点一步法：抗AFP不同位点的不同位点的McAb二、二、试剂材料材料1、AFP检测试剂盒盒2、AFP参参考考标准准液液（0、25、50、100、200、400ng/ml）。）。3、DW4、终止液（止液（2M H2SO4）。）。5、酶酶标测定定仪、37温箱。温箱。6、微量加、微量加样器、滴管、吸水器、滴管、吸水纸等。等。三、m
6、ethod（一）（一）quantity test1 1、add sampleadd sample 取取包包被被好好的的酶酶标孔孔7 7孔孔，进行行标记，第第1 16 6孔孔分分别别加加入入AFPAFP参参考考标标准准夜夜（0 0、2525、5050、100100、200200、400ng/ml400ng/ml）各各10100ul0ul。第。第7 7孔加入样品孔加入样品10100ul0ul。37372020分钟分钟2 2、washwash：在在各各孔孔中中加加入入洗洗液液2 2滴滴, ,轻轻轻轻摇摇动动几几下下, ,弃弃之之, ,然然后后用用蒸蒸馏馏水水或或自自来来水水加加满满各各孔孔, ,甩甩
7、掉掉, ,反反复复5 5次次, ,最最后后在在吸吸水水纸纸上拍干上拍干. .3 3、每孔加酶结合物、每孔加酶结合物2 2滴，滴，37153715分钟。分钟。4 4、washwash5 5、显色、显色每每孔孔加加底底物物和和显显色色液液各各1 1滴滴，轻轻轻轻振振摇摇，室室温温避避光光反反应应5 5分分钟钟，加入加入2 2滴终止液滴终止液终止反应。终止反应。5 5、酶标仪、酶标仪450nm450nm比色，计算结果。比色，计算结果。（二）（二） quality test1Add samplel取取包包被被好好的的酶酶标标板板3 3各各孔孔，分分别别加加入入阴阴性性对对照照（25 25 ng/mln
8、g/ml）、阳阳性性对对照照（400 400 ng/mlng/ml）和和待待检检标标本本各各10100ul 370ul 372020分钟。分钟。2 2、washwash：在在各各孔孔中中加加入入洗洗液液2 2滴滴, ,轻轻轻轻摇摇动动几几下下, ,弃弃之之, ,然然后后用用蒸蒸馏馏水水或或自自来来水水加加满满各各孔孔, ,甩甩掉掉, ,反反复复5 5次次, ,最后在吸水纸上拍干最后在吸水纸上拍干. .3 3、每孔加酶结合物、每孔加酶结合物2 2滴，滴，37153715分钟。分钟。4 4、washwash5 5、显色、显色每每孔孔加加底底物物和和显显色色液液各各1 1滴滴，轻轻轻轻振振摇摇，室室
9、温温避避光光反反应应5 5分钟，加入分钟，加入2 2滴终止液滴终止液终止反应。终止反应。四、result 1Quantity testQuantity testl用用酶酶标仪进行行比比色色，以以0 0 ng/mlng/ml标准准孔孔为空空白白孔孔，在在波波长450nm450nm处分分别读取取各各标准准孔孔和和样本本孔孔ODOD值，以以ODOD值为横横坐坐标，AFPAFP含含量量为纵坐坐标，在在半半对数数坐坐标纸上上画画出出标准准曲曲线，以以测定孔的定孔的ODOD值在在标准曲准曲线上上查出相出相应标本的本的AFPAFP含量。含量。 2 2Quality testQuality testl在在白白
10、色色背背景景上上直直接接肉肉眼眼观察察结果果。阴阴性性对照照孔孔应基基本本无无色色，阳阳性性对照照孔孔呈呈深深蓝色色。若若待待检样品品孔孔色色泽深深于于阳阳性性对照照孔孔则AFPAFP 400ng/ml400ng/ml，阳阳性性；若若待待检样品品孔孔色色泽深深于于阴阴性性对照照孔孔而而浅浅于于阳阳性性对照照孔孔则20ng/ml20ng/mlAFPAFP400ng/ml400ng/ml，弱弱阳阳性性；待待检样品孔色品孔色泽浅于阴性浅于阴性对照孔照孔则AFP AFP 2 20ng/ml0ng/ml，阴性，阴性。l 参考范参考范围：正常成人：正常成人AFPAFP含量含量20ng/ml20ng/ml。【实验结果】Experiments resultsl若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为l若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为l若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为间则判定为阴性阴性阳性阳性弱阳性弱阳性五、Report1 1简述简述ELISAELISA原理及原理及ELISAELISA双抗体夹心法测双抗体夹心法测AFPAFP原理。原理。2 2记录实验结果。记录实验结果。
