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1、如何查找基因及设计因为如何查找基因及设计因为,PCR,PCRPart one -如何查找基因序列、mRNA序列Part two -引物设计引物设计Part three -Real-timePCR原理及应用原理及应用Part four(Discussing) -从发现到分析从发现到分析,再到应用解决（临床问题）再到应用解决（临床问题）mRNA同一个基因，可能存在不同的isoforms,mRNA序列有所不同，若没有特别要求，只需扩增到该基因的话，PCR引物可以选择扩增几个不同序列的公共保守区的序列。Part two -引物设计引物设计参考影响因子高的文献上的引物序列或好的网站上的（注意种属！）自行
2、引物设计（软件） 普通PCR Real-time PCR 厂家设计合成（eg:Taqman 探针法）普通PCR设计软件Real-time PCR设计软件Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功能 。打开程序首先进入的是序列编辑参看这是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引
3、物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。 在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。 PRIMER PREMIER能即时分析引物二级结构在左下的两排按钮可以显示发现了哪些二级结构而按下的按钮表明相邻的图框里显示的是何种二级结构除了二级结构图框里也显示二级结构的自由能数值G 单位kcal/molEdit Primer 引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条
4、已有引物序列。进行粘贴时Paste 粘贴窗口会激活用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式您也可以手工键入引物序列一旦引物被编辑发生变化Analyze 按钮就可以使用点击Analyze 按钮即可分析编辑后的引物。Automatic Search 自动搜索参考影响因子高的文献上的引物序列或好的网站上的（注意种属！）自行引物设计（软件） 普通PCR Real-time PCR 厂家设计合成（eg:Taqman 探针法）Real-time PCR Real time PCR 使用SYBR Dye 的话，对PCR 产物的特异性要求非常高。非特异产物主要是引物二聚体，它的多少可能决定了本实验的检测灵敏
5、度。熔点曲线和电泳可以检测引物二聚体。SYBR 与所有dsDNA 结合，包括引物二聚体（Primer Dimers），这就会使结果偏大。如何消除引物二聚体并提高灵敏度？理想情况是引物设计非常完美，各种试剂的使用量恰到好处，温度变化与“变性，退火，延伸”完全吻合，使得PCR 过程中产生极少引物二聚体，极少有偏差的延伸，极少非目的模板的扩增。（1）设计适合Real time PCR 的引物。AppliedBiosystems 公司建议用Primer Press 软件来专门设计real time PCR 引物。一些常见的基因引物序列可以借鉴其他成功的研究者。（2）除了寻找合适的序列，还可以改变退火温
6、度，限制引物的浓度。（3）减少配试剂到开始反应之间的非特异扩增。（缩短时间+冰上操作）（4）PCR 使用热启动酶，UNG 酶。Part three -Real-timePCR原理及应用原理及应用游离时无荧光信号和DNA双链结合时，发出荧光每次实验都必须同时扩增内参基因Part four(Discussing) -从发现到分析从发现到分析,再到应用解决（临床问题）再到应用解决（临床问题）基因研究平台少量样本数更多样本数少量基因Genome-wideSurvey10,000基因Pathwayfocesedsurey30-1000基因Iontorrent高通量测序高通量测序平台平台全基因组全基因组m
7、RNA/小小RNA检测检测发现新发现新RNA分子分子高密度全基高密度全基因组杂交芯片因组杂交芯片microArray全基因组检全基因组检测已知测已知mRNA低密度低密度TaqManArray单个信号通单个信号通路路/基因家族基因家族/疾病关联基因疾病关联基因/microRNA检测检测个别基因个别基因real-timePCR检测检测TaqManArraysTaqMan芯片TaqMan Array Family96孔板孔板TaqManArrayPlate384孔孔TaqManArray(低密度芯片低密度芯片/微流卡微流卡)所有所有TaqManArray反应孔中都预先固化了反应孔中都预先固化了Taq
8、Man探针和引物探针和引物3072孔超高通量荧光定量平台孔超高通量荧光定量平台OepnArrayTaqMan基因表达芯片从基因通路网络工具(GeneAssist）搜寻目的基因表达检测试剂盒定制成96孔板或384孔微流卡芯片运行定量PCR，分析数据。同时分析几十到上百个基因表达Ambion mirVana KitsDiscovery to Diagnostics Anti-miR miRNA Inhibitors & Pre-miR miRNA Precursors TaqManmiRNA Array & 7900HTTaqManmiRNAAssaysIon TorrentTMNext GenSequencingRNAIsolation Discovery ProfilemicroRNAs Validate FunctionalStudies Publish/CommercializeCompleteSolutionforMicroRNAProfiling,Validation&Characterization Rx/DxTheranosticsDevelopment 与大家共勉！与大家共勉！结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！58
