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1、年级：2012级 专业：麻醉学实验课时间：第17周周一（2013年6月17日）实验室：第三实验室组别：第二实验组组员：曹 毅（201206008 ） 徐 敏（201206009） 宁丽娟（201206010） 牛 钦（201206011） 潘雪婷（201206012） 薛 娟（201206013） 肖 璘（201206014） 张红娇（201206015）报告人：2012级生物化学与分子生物学实验设计案例 ： 患儿，男性，患儿，男性，3 3岁，因面色苍白伴血尿岁，因面色苍白伴血尿1 1天入院。天入院。1 1天前食用新天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色鲜蚕豆后，今日出现
2、恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温体格检查：体温3838，脉搏，脉搏150150次次/ /分，呼吸分，呼吸4040次次/ /分，血分，血压压80/60mmHg80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞室检查：红细胞 1.
3、981012/L 1.981012/L，血红蛋白，血红蛋白53g/L53g/L，血清总，血清总胆红素胆红素85.5mol/L85.5mol/L，结合胆红素，结合胆红素13.7mol/L13.7mol/L，未结合胆红，未结合胆红素素71.8mol/L71.8mol/L，尿蛋白（，尿蛋白（+），潜血），潜血(+)(+)，尿胆红素，尿胆红素( () )，尿胆素原尿胆素原(+)(+)，尿液镜下未见红细胞。，尿液镜下未见红细胞。1. 1. 根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？（必答）何种疾病？（必答）2. 2. 请设计实验进一步明
4、确诊断。（必答）要求：实验名称，请设计实验进一步明确诊断。（必答）要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。结果如何分析。3. 3. 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。（必从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。（必答）答）4. 4. 要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？（选答）目的基因？（选答）5. 5. 患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答）患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答）1. 根据上述患儿
5、的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？根据患儿的临床表现和体格检查，可初步判断该患儿患的是G6PD（葡萄糖6磷酸脱氢酶）缺乏症俗称蚕豆病恶心、呕吐、面色苍白恶心、呕吐、面色苍白 皮肤及巩膜黄染皮肤及巩膜黄染 红细胞红细胞 1.981012/L 血红蛋白血红蛋白53g/L 血清总胆红素血清总胆红素85.5mol/L 尿蛋白（尿蛋白（+） 尿胆红素尿胆红素() 尿胆素原尿胆素原(+) 尿液镜下未见红细胞尿液镜下未见红细胞 黄疸黄疸红细胞膜不完整，已破裂红细胞膜不完整，已破裂红细胞含量少红细胞含量少含量明显增加含量明显增加血红蛋白量减少血红蛋白量减少排尿呈酱油样色排尿呈酱油样色游离胆红素增
6、加游离胆红素增加溶溶血血性性黄黄疸疸肠肝循环增多 G6PD缺乏症的临床类型蚕豆病新生儿黄疸药物性溶血感染性溶血非球形细胞溶血性贫血等临床类型G6PD缺乏症的临床表现 G6PD缺乏症的临床表现与一般溶血性贫血大致相同。但临床表现的轻重程度不同，多数患者，特别是女性杂合子，平时不发病，无自觉症状，部分患者可表现为慢性溶血性贫血症状。常因食用蚕豆、服用或接触某些药物、感染等诱发血红蛋白尿、黄疸、贫血等急性溶血反应。 因G6PD缺乏诱发的严重的急性溶血性贫血因红细胞破坏过多，如不及时处理，可引起肝、肾、或心功能衰竭，甚至死亡。蚕豆病的发病原因 发病原因:蚕豆病起病急剧，大多在进食新鲜蚕豆后12天内发生
7、溶血，最短者只有2小时，最长者可相隔9天。如因吸入花粉而发病者，症状可在数分钟内出现。潜伏期的长短与症状的轻重无关。 蚕豆病的发病表现 症状有全身不适、疲倦乏力、畏寒、发热、头晕、头痛、厌食、恶心、呕吐、腹痛等。巩膜轻度黄染，尿色如浓红茶或甚至如酱油。一般病例症状持续26天。最重者出现面色极度苍白，全身衰竭，脉搏微弱而速，血压下降，神志迟钝或烦躁不安，少尿或闭尿等急性循环衰竭和急性肾功能衰竭的表现。如果不及时纠正贫血、缺氧和电解质平衡失调，可以致死；但如能及时给以适当的治疗，仍有好转希望。（以上内容引自百度百科）2.请设计实验进一步明确诊断 （要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作
8、流程及注意事项，结果如何分析。)高铁血红蛋白还原试验G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定筛选试验 确诊试验一、高铁血红蛋白还原试验 【实验原理】在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）亚铁血红蛋白亚铁血红蛋白 高铁血红蛋白高铁血红蛋白高铁血红蛋白还原酶高铁血红蛋白还原酶 NADPH(辅酶辅酶) 亚甲蓝亚甲蓝
9、(递氢体递氢体)实验反应方向【主要试剂】0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液、0.4mmol/L亚甲蓝溶液、0.28mol/L葡萄糖溶液、混合液（等量+）、生理盐水、抗凝剂【实验仪器】紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支【实验流程】取静脉血1. 8mL 于抗凝管，混匀抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg)离心沉淀 1000 r/ min 15 min调整 血细胞血浆=11 ，混匀 调整后全血（备用）1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 混匀 混合试剂混合试剂（备用） 1ml 0.14 mmol/ L 亚甲基
10、蓝液【实验流程】取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入试剂高铁血红蛋白还原实验操作步骤混合试剂/ mL 0. 01 / /生理盐水/ mL / 0. 01 /0. 18 mol/ L 亚硝酸钠- / / 0. 010. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL 0. 1 0. 1 0. 1来回摇动1520 次,置37 水浴箱静置3 h蒸馏水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml 试剂 A B SB管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管及“S”管吸光度计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb % = (1 - A/ S) 100 % 【实验流程】二、G6
11、PD荧光斑点试验 【实验原理】葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性 NADP NADPH G6P 6PGAG6PD【主要试剂】反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀【主要仪器】长波紫外灯、滤纸、水浴箱取试管，加10l全血+100l反应液，混匀，取一滴于滤纸上（第一斑点 ）作为对照将
12、上液置于37水浴10min ，再取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）实验组 晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果，计时 根据结果作出相应诊断【实验流程】三、红细胞G6PD活性测定【实验原理】基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是利用紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度（测6次），求每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。方法：WHO推荐的Zinkham;NBT定量法等【主要试剂】生理盐水、溶血素、3.8mmol/LNADP、0.5mol/LTris缓冲液（pH7.5）、0.63mol/L氯化镁溶液、
13、33mmol/LG-6-P液【主要仪器】紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管取抗凝血2ml，生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心 10min）除去上清液和乳白层（白细胞和血小板）加等体积生理盐水红细胞悬液红细胞悬液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min 溶血液并测定其Hb浓度进行比色 （见下表）【实验流程】 G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 )试管 对照管 测定管 NADP液（ml） 0.1 0.1Tris液（ml） 0.1 0.1氯化镁液（ml） 0.1 0.1蒸馏水（ml） 0.68 0.58G6P液（ml） 0.1 37预热溶血液（l） 20 20立即
14、340nm处测吸光度，以对照管调零，37恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化【实验流程】计算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =A/min1000/6.221020/20 Hb(gL-1) A/min:每min吸光度的平均变化值1000/6.22:为微摩尔消光系数1020/20:总容量与溶血液的量之比； 【实验流程】注意事项（1）受检者红细胞比容对结果有一定影响，比容低于30%时，高铁血红蛋白还原率可明显降低故贫血患者应先调整红细胞比容后再测定。（2）抗凝剂以38g / / L柠檬酸或输血时用的抗凝剂ACD为好，血液标本可保存1周左右。肝素抗凝剂可用（每毫升血液用肝素0.5mg），但标本
15、只能保存3天。草酸盐抗凝不适于本法。（3）ACD抗凝剂不宜太多，血液与ACD抗凝剂按1:0.15混合即可，否则可因PH降低，而使高铁血红蛋白还原速度减慢，以致出现假阳性。结果分析方法一、高铁血红蛋白还原试验： 正常值：MHb还原率=75%，脐血=77% 临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者： MHb还原率 30% 脐血 40% 杂合子患者： MHb还原率 31%74% 脐血 41%76%二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验 正常人： 0min斑点无荧光，5-10min出现， 10min荧光最强 临床诊断： 轻度缺陷者：0-10min荧光很弱或不出现 中度缺陷者：10-30min出现荧光 严重
16、缺陷者：30min内不出现荧光结果分析方法三、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以 上即可作出诊断 方法 正常值范围WHO推荐的Zinkham (12.012.09)IU/gHb(37)ICSH推荐的Glock与McLoan法 （8.341.59）IU/gHb(37)NBT定量法 （13.130.0）NBT单位Chapman和Dern法 （2.87.31）IU/gHb(25)结果分析方法必答题一：从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。（1）急性贫血、溶血：因G6PD基因的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧
17、化作用），在遇到蚕豆中某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，红细胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损害细胞膜。G6PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G6PD缺乏时则红细胞被破坏而致病。 A AH22GSH GSSG + + NADH NADPH + H （2）溶血性黄疸：红细胞本身的内在缺陷或红细胞受外源性因素损伤,使红细胞遭到大量破坏,释放出大量的血红蛋白,致使血浆中非脂型胆红素含量增多,超过肝细胞的处理能力则出现黄疸。红细胞死亡后释放的血红蛋白经分解产生间接胆红素(I-Bil)，经肝脏转化为直接胆红素(D-Bil)，随胆汁一起排入胆道，最后经大
18、便排出。间接胆红素与直接胆红素之和就是总胆红素(T-Bil)。上述的任何一个环节出现障碍，均可使人发生黄疸。 （3）尿蛋白（+）：小球滤过膜的滤过作用和肾小管的重吸收作用，健康人尿中蛋白质(多指分子量较小的蛋白质)的含量很少(每日排出量小于150mg)，蛋白质定性检查时，呈阴性反应。当尿中蛋白质含量增加，普通尿常规检查即可测出，称蛋白尿。如果尿蛋白含量3.5g/24h，则称为大量蛋白尿。当溶血性疾患时无论是肾小球滤过蛋白过多、超过肾小管重吸收能力，或肾小管功能障碍回吸收能力下降，均可致蛋白尿。 （4）尿潜血与血尿：尿潜血阳性，只能说明尿中含有红细胞成分，正常人体内红细胞不断破坏，其成分都从尿排
19、出，因此部分正常人尿中亦会出现潜血阳性。一般情况下，红细胞01个/高倍镜视野，属正常范围。当显微镜检查尿中红细胞大于3个/Hp时，才能诊断为血尿。急性溶血时大量红细胞被破坏，其成分从尿液中排除故出现潜血阳性。（5）体温升高：大量溶血，即血红细胞大量破坏，大量的无菌性坏死物质入血，机体动员白细胞吞噬吸收坏死物质，导致无菌性炎症，可引起发热，亦称为吸收热。（6）呼吸加快及心率加快：由于急性溶血导致循环血量减少，红细胞减少，血红蛋白减少，氧气供应相对不足，故机体通过加快呼吸频率，以及加快心率维持心输出量的相对稳定以维持机体代谢的供氧。选答题一：要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基
20、因？要想探讨该病发生的分子基础 ，需要对目的基因进行基因结构分析，即DNADNA序列检测DNA序列测定方法直接法间接法：对于未知片段，或片段过长，用几种方法（RFLP；PCR-RFLP；SSCP）来粗略的估计待分析基因的一级结构是否与对照基因相同双脱氧末端终止法（Sanger法）化学裂解法（Maxam-Gilbert法）DNA的自动化测序DNA序列测定方法DNA链的方向是链的方向是5 5 3 3 交交替替的的磷磷酸酸基基团团和和戊戊糖糖构构成成了了DNA的的 骨骨 架架 (backbone)。选答题二：患者体型瘦小与该患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？病症是否有关，为什么？蚕豆病是因为体内
21、缺乏G6PD，G6PD主要影响体内的磷酸戊糖途径该途径主要生成两种重要的物质即5-磷酸核糖和NADPHNADPH的影响：1、体内以NADPH作为供氢体合成多种活性物质如胆固醇脂肪酸和一些非必需氨基酸2、NADPH可作为羟化酶的辅酶，参与体内生物转化作用3、NADPH参与吞噬细胞的杀菌作用4、维持GSH的正常水平GSH可以保护体内蛋白质或酶免遭氧化使蛋白质或酶处于活性状态 蚕豆病使得该男孩体内发生糖、蛋白质，脂类物质的代谢障碍，一些重要的生物活动受到影响，加之因疾病带来的一些身体上和精神上的折磨，这些因素使得他的身体比同龄孩子削瘦。1、字体安装与、字体安装与设置置如果您对PPT模板中的字体风格不
22、满意，可进行批量替换，一次性更改各页面字体。1.在“开始”选项卡中，点击“替换”按钮右侧箭头，选择“替换字体”。（如下图）2.在图“替换”下拉列表中选择要更改字体。（如下图）3.在“替换为”下拉列表中选择替换字体。4.点击“替换”按钮，完成。442、替、替换模板中的模板中的图片片模板中的图片展示页面，您可以根据需要替换这些图片，下面介绍两种替换方法。方法一：更改图片方法一：更改图片1.选中模版中的图片（有些图片与其他对象进行了组合，选择时一定要选中图片本身，而不是组合）。2.单击鼠标右键，选择“更改图片”，选择要替换的图片。（如下图）注意：注意：为防止替换图片发生变形，请使用与原图长宽比例相同的图片。44赠送精美图标
