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1、微流控芯片主要应用之-细胞和活体层面的信息获取 杨晓涵 2012-05-313细胞捕获n电场力捕获细胞n介电力捕获细胞n流体动力学陷阱捕获细胞n空间位阻捕获细胞n固定化技术捕获细胞 在细胞分析中,往往需要将样品池中的细胞样品引入到微流控芯片通道中.借助电场力、介电力、静电力、磁场力等操纵手段实现对细胞的灵活操纵,并将细胞捕获在微流控芯片通道特定的位置.3.1电场力捕获细胞 细胞表面带有净电荷,在电场力作用下会发生运动,即电泳现象.Cao等通过反复切换一组低电压,使细胞在电场力作用下不断改变流速和方向,最终沉降至微通道底部并贴壁,这样可以控制细胞捕获在十字交叉口附近一定范围内,然后溶膜检测.3.
2、2介电力捕获细胞 介电力除了可以用以细胞分选外,也可用于细胞的操控和捕获.Gray等利用正向介电泳力将单个细胞捕获在直径为3m的微电极点阵上,当单个细胞被捕获在电机中间而占据了介电泳力最大的位置时,其余细胞由于介电泳力较小而被流动的溶液冲走.负介电泳捕获单细胞Mittal 等利用负向介电泳力作用来捕获单个细胞,他们设计如图所示的平面微电极芯片,包含一中空方形电极和与之对应的线状电极,细胞在负向介电泳力作用下被推向电场最弱处,即方形电场的中空位置.由于该中空位置的大小和细胞相当,因此可实现单细胞在特定位置的捕获.3.3流体动力学陷阱捕获 与电场力相比,流体压力比较温和,对细胞活性的影响较小,因此
3、更有利于操纵或捕获细胞. Di Carlo 等设计了如图的微阵列芯片,采用半渗透微结构,单个细胞在微穴中定位后,其他细胞将改变流动方向,进入其他微穴,形成单细胞阵列.微穴阵列捕获单细胞示意图微穴阵列捕获单细胞示意图3.4空间位阻捕获细胞 利用传统的多层光刻技术,可制作出深、宽为数微米级甚至纳米的各种”坝形” 、”碗型”微结构以阻挡细胞.但制作这种结构的芯片需要复杂的光刻,多次曝光等工艺过程.也可通过降低通道的宽度来实现阻挡细胞流过的功能,当捕获通道的尺寸变窄,细胞悬液的浓度适当降低时,亦可实现单细胞的捕获.3.5固定化技术捕获细胞 固定化微生物技术是采用化学或物理的手段将游离细胞或酶定位于限定
4、的空间区域内,该技术广泛应用于生物领域.载体材料多是天然蛋白和多糖,如:琼脂、琼脂糖、明胶、卡拉胶、黄原胶、阿拉伯胶、海藻酸钠等.2 细胞裂解 细胞裂解是进行细胞内涵物电泳分离和检测的必要步骤.能否快速有效地裂解细胞,是后续细胞内涵物检测的关键.目前,基于微流控芯片的细胞裂解方法主要有:机械裂解法、超生裂解法、热裂解法、化学试剂裂解法及电裂解法等.2.1 机械裂解法 随着微加工技术和刻蚀技术的提高,已可以在微流控芯片通道中刻蚀出纳米尺寸的坝形 或刀形的微结构,用于机械捕获并破碎细胞.如图所示,利用深度反应离子刻蚀技术(DRIE)在硅片通道内刻蚀纳米刀样精细结构,细胞在液压作用下,通过这些纳米刀
5、结构时受到摩擦力的作用而破碎.2.2 超生裂解法 细胞在持续超声波作用下可以发生快速裂解,图为微超声波仪,炭疽病毒被输入与超声波连接的腔体,30s后裂解.微超声波仪微超声波仪2.3 热裂解法 利用芯片PCR的控温装置,可以实现细胞的热裂解.Waters等在PCR 区域控温94, 4min实现大肠杆菌热裂解,并完成核酸的PCR 扩增、电泳分离.Liu等在集成了泵阀、加热器和DNA传感器的芯片上了实现了血液中病原性细菌热裂解PCR反应和DNA杂交等过程.热裂解的缺点是裂解时间较长.2.4 化学试剂裂解法n相对而言,化学试剂是生物实验室中最为常见的裂解方法,该方法具有简单、有效、不需附加设备和抑郁实
6、验等特点.常用的化学试剂主要有十二烷基磺酸钠(SDS),毛地黄皂苷,强碱NaOH等. 右图为一块集成了细胞培养和细胞裂解的PDMS芯片,该芯片可实现连续多天细胞培养,同时在芯片上通过电解质水解的方法产生高浓度的OH ,使细胞快速裂解.2.5 电裂解法n细胞在脉冲电场的诱导下会产生跨膜电势,当这种电势高于1V时,细胞膜的通透性增加,可以与外界发生物质交换,通常利用这种特性客将外源DNA、RNA 、蛋白质或各种染料导入细胞内,当脉冲电场消失后细胞恢复到原样,这种现象成为电穿孔.nLu等设计了一种带有立体锯齿状点极阵列的微流控芯片,利用相对低频的电场产生的电穿孔效应来诱导细胞膜穿孔乃至破裂.Sche
7、matics of a micro electroporation device for cell lysis.Only one set of electrodes is shown for simplicity.微流控芯片在活体层面的信息获取 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是一种常见的小型土壤线虫，全身透明，具有雄性和雌雄同体两种性别，秀丽隐杆线虫成虫长约l mm，体径约50 m，在实验室容易保存和饲养，野生型线虫在20可存活约20 天 秀丽隐杆线虫是一种经典的模式生物，目前有关秀丽隐杆线虫在发育遗传方面的相关研究获得了两次诺贝尔生理医学奖秀丽隐杆线虫遗传背景清
8、楚、个体结构简单、生活史短、基因组测序完成通过比较基因组学得出，线虫的蛋白质组序列中至少有40%的人类同源基因，这为科研人员通过秀丽隐杆线虫研究药物作用的内在机理奠定了基础因此，秀丽隐杆线虫被广泛应用于遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、药物筛选、环境生物学等研究领域 近年来，在微流控芯片上从事秀丽隐杆线虫研究工作的科学家主要有：哈佛大学的Whitesides 团队、洛克菲勒大学的Bargmann 课题组、密歇根大学的Chronis 课题组、佐治亚理工学院的Lu-Hang课题组、麻省理工大学的Yanik 实验室、加拿大麦克马斯特大学的Gupta 课题组、中国科学院大
9、连化学物理研究所林炳承- 秦建华课题组等. 秀丽隐杆线虫还是用于研究人体生理出现的长期变化的最完美替代物，原因在于它们在很多相同条件下也和人类一样出现肌肉萎缩现象。肌肉萎缩是宇航员担心的主要健康问题之一。2009年，美国宇航局将百万秀丽隐杆线虫送入了太空空间站，目的旨在帮助进一步了解什么因素引起人体肌肉增强和萎缩。除了肌肉萎缩外，这项研究还将帮助科学家更多地了解零重力状态如何影响卧床不起的人，卧床不起主要由肌肉萎缩症、糖尿病、外伤和衰老所致。固定线虫方法n块阀 即直接利用微流控技术中的双层膜阀结构。 2008年，Ben小组的Guo等利用单个块阀下压推挤单个线虫至通道一侧，包裹线虫身体达到全身固
10、定效果。用于满足解剖结构观察和激光烧蚀实验的需求.单个块阀下压推挤固定线虫示意。(a)线虫固定三维示意图。(b)膜在压力下的形变剖视图。n侧吸 这种方法是在流通线虫的通道一侧添加很多孔道。线虫流经通道时，对通道上方施加负压挑选一只线虫，其后在下方侧吸口处施加负压固定线虫。这种方法于2007年由Yanik小组的Rhode等提出，并获得了较好的身体固定效果。 微流控线虫分选操作。分选器包括控制通道和阀(灰色)用于控制线虫的流动方向。阀标记以A一F。操作步骤为:1、清洗固定腔;2、线虫被上层吸口捕获，一卜层小通道不动;3、清洗掉同时进入的其它线虫，收集至废液池或回收利用;4、将腔室与其它通道隔离开;
11、5、线虫从上层吸口释放，被下层小通道吸住;6、成像或操作后，根据显型将线虫收集或引向废液池.n锥形通道 线虫身体呈纺锤形，头尾都为锥形。将通道设计为渐变的锥形，以匹配线虫的外形。2007年，Bargmann小组的Chronis等利用这种锥形结构设计了两种芯片:限制线虫移动方向的锥形“行为芯片”，以及特用来固定头部以观察神经元活动的“嗅觉芯片。两种利用锥形捕获和固定线虫的芯片。(a)行为芯片，(b)嗅觉芯片Whitesides 研究团队开发了一种可用于在线自动固定单条线虫的PDMS 芯片，此芯片结构由128 个阵列通道组成，每个通道是锥形结构，可以快速分别固定128 条线虫，芯片结构如图所示：固
12、定线虫的128 通道阵列结构示意图插图是一个单元(16 通道)的放大图.n冷冻利用线虫在低温时活性迅速降低的特性，Lu小组在芯片底部加温度控制通道，使通过通道上方的线虫受到冷冻而保持不动。加以侧吸通道定位，和很多阀件配合开断流体，使得该系统先后实现了自动的高通量分选和细胞烧蚀。nCO2气体麻醉法2009年，Chronis小组的Chokshi利用PDMS材料的透气性和线虫在低氧环境中运动变慢的特性，长时间(l-2小时)的固定线虫。该方法可用于需要长期稳定固定的实验，为研究神经细胞再生长和细胞发育等研究提供了技术平台。通入CO2气流固定线虫刺激输出方式 2007年，Bargmann小组的chron
13、is等人利用层流输出切换灵敏的药液环境，对线虫体内神经元感受刺激的应答进行光学监测。微流控层流切换精确输出药液方式2010年，selvaganapathy小组的Rezai报道了一种微流控芯片，输出低压电场，观察线虫在电场中的电趋向性。实验装置示意图。 (a)线虫操作单元(微注射泵，样品容器出入口连接管)，一个监控单元(数码相机和显微镜)，(b)微流控设备(在蓄液池里植入电极的PDMS通道)Polymerase Chain Reaction-Free, Sample-to-Answer Bacterial Detection in 30 Minutes with Integrated Cell
14、LysisBacterial detection sensorsIntegrated sensing system.(A)Schematic of cartridge integrating lysis chamber, NME chip, and connector to analyzer. (B)Overview of detection scheme; injection, lysis, delivery, and readout in 30 min.(C) Typical differential pulse voltammograms of positive (left) and n
15、egative (right) samples where the dotted line is the background and the solid line is the readout.Aptamer-Based Origami Paper Analytical Device for Electrochemical Detection of Adenosine*The operating principle of the sensor. DMM=digital multi-meter. d) A plot of fluorescence intensity If versus the
16、 concentration of adenosine Cadenosine in the sample. e) Sequences of the aptamer strand, the fluorophore strand, and the quencher strand. a,b) Fluorescence micrographs of the oPAD showing 10 mm fluorescent microbeads preloaded in one split channel c) A fluorescence micrograph of a paper fluidic dev
17、ice having two channels preloadeda) Calibration curve for detecting adenosine using the oPAD with and without amplification by a capacitor. The error bars represent standard deviation of readings from a DMM for three independent measurements. b) Sequences of DNA strands of the aptamer sensor. The se
18、quence for binding to adenosine is in italics.Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegansSubcellular resolution imaging and optical manipulation of physiologically active C. elegans. (b) Cross-section of the chip showing the immobilization methodMicrofluidic chip for
19、 mechanical immobilization of C. elegans. (a) Diagram of the chip with numbered arrows showing C. elegans manipulation steps.Cross-section of the microfluidic device showing the immobilization region. The device is vertically cut along the line from port-B to port-C. The thermally bonded compression
20、 layer and flow layer are visible. A PDMS channel array is molded from the flow-1 layer with 10 m thickness. A 15- to 20-m-thick PDMS membrane is formed between the compress-1 and flow-2 layers. This device will be plasma bonded to a cover glass. Microfluidic device integrated with off-chip componen
21、ts. Manual operation of the microfluidic device. The table indicates the state of each port during operation. (a) Loading of the animal from syringe. (b) Immobilization of the animal in linear orientation. (c) Unloading of the animal to the agar plate.Lifespan analysis of the immobilized population and control population. Animals were brought into the chip and immobilized for 1 min each using 15 p.s.i. and then recovered on agar pads. The mean lifespan of the immobilized population (17.3 d) was consistent with that of controls (16.9 d).
