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1、 工业发酵灭菌工业发酵灭菌 工业发酵灭菌 最新n知识目标知识目标 理解工业发酵常用灭菌方法的原理和适用范围理解工业发酵常用灭菌方法的原理和适用范围 掌握工业发酵培养基和发酵设备灭菌工艺的选择掌握工业发酵培养基和发酵设备灭菌工艺的选择 掌握无菌空气制备的基本知识和典型工艺要求掌握无菌空气制备的基本知识和典型工艺要求工业发酵灭菌 最新n一、热灭菌法一、热灭菌法n1 1、火焰灭菌法、火焰灭菌法 直接在火焰上灼烧灭菌，如接种针和直接在火焰上灼烧灭菌，如接种针和一些金属小工具、试管口、三角瓶口等灭一些金属小工具、试管口、三角瓶口等灭菌采用这种方法，该方法简单有效，但局菌采用这种方法，该方法简单有效，但局
2、限性很大。限性很大。工业发酵灭菌 最新2 2、干热灭菌法、干热灭菌法n n进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内微生物体内蛋白质变性蛋白质变性和和电解质浓缩电解质浓缩引起引起中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般度要高，时间要长，一般160160170170，1 11.5h1.5h。n n实际应用时，对一些要求保持干燥的实验实际应用时，对一些要求保持干燥
3、的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。器具和材料可以采用干热灭菌法。工业发酵灭菌 最新n n湿热灭菌法湿热灭菌法n n利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。n n其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。生物死亡。n n由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热蒸汽存在潜由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热蒸汽存在潜热。热。n n蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可
4、靠，是蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条件为件为121 121 ，30 min30 min。 工业发酵灭菌 最新湿热灭菌法湿热灭菌法n煮沸灭菌法煮沸灭菌法 将要消毒的物品放入水中煮沸将要消毒的物品放入水中煮沸（100）1520min，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但不，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但不能杀死芽孢。能杀死芽孢。n巴氏消毒法巴氏消毒法 法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消毒法。加热到毒法。加热到6262，经过，经过3030分钟，以杀死不耐高分钟，以
5、杀死不耐高温的物质中的微生物和病原体的消毒法。温的物质中的微生物和病原体的消毒法。 牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。工业发酵灭菌 最新湿热灭菌法湿热灭菌法n间歇灭菌法间歇灭菌法 反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。生物营养体和芽孢的目的。 操作步骤：操作步骤：100，30-60min；37，1d；同上重复三次同上重复三次 适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基。牛奶培养基。 方法简单，但却麻烦；工作周期长。方法简单，但却麻烦；工作周期长。 工业
6、发酵灭菌 最新湿热灭菌法湿热灭菌法n高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增高，温度也随之增高，从而提高杀菌力，高，温度也随之增高，从而提高杀菌力，缩短灭菌时间。缩短灭菌时间。n最有效而广泛应用的灭菌方法最有效而广泛应用的灭菌方法n实验室常用的是实验室常用的是0.1MPa，121，1530min工业发酵灭菌 最新n应用范围应用范围 培养基，水，发酵罐等其他不适培养基，水，发酵罐等其他不适合干热灭菌的物品。合干热灭菌的物品。n高压蒸汽灭菌法的注意事项：高压蒸汽灭菌法的
7、注意事项：1.完全排除锅内冷空气完全排除锅内冷空气2.灭菌完毕后要缓慢减压灭菌完毕后要缓慢减压3.压力降为零后打开盖子压力降为零后打开盖子工业发酵灭菌 最新n二、辐射灭菌法二、辐射灭菌法n n利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物n n以以以以紫外线紫外线紫外线紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗起作用，但细菌芽孢和霉菌
8、孢子对紫外线的抵抗起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超过过过过1.2 m1.2 m1.2 m1.2 m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液；对固
9、体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。体物料的灭菌。体物料的灭菌。体物料的灭菌。工业发酵灭菌 最新n三、化学药品灭菌法三、化学药品灭菌法n n某些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、某些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、酶失活、细胞通透性）而具有杀菌的作用。酶失活、细胞通透性）而具有杀菌的作用。n n化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。n n化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸不同有浸泡、添加、
10、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。等。工业发酵灭菌 最新n n 高锰酸钾高锰酸钾 高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡，一般用基酸氧化，使微生物死亡，一般用0.10.10.250.25的溶液。的溶液。 n n 漂白粉漂白粉 漂白粉的化学名称是次氯酸盐漂白粉的化学名称是次氯酸盐( (次氯酸钠，次氯酸钠，NaOCl)NaOCl)，它是强氧化剂，也是廉价易得的灭菌，它是强氧化剂，也是廉价易得的灭菌剂。它的杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯酸，剂。它的杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧和氯，后者不稳定，在水溶液中分解为新生
11、态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对杀死细使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对杀死细菌和噬菌体均有效。菌和噬菌体均有效。工业发酵灭菌 最新n n 75 75酒精溶液酒精溶液 7575酒精溶液的杀菌作用在于使细胞脱水，酒精溶液的杀菌作用在于使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉引起蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀死作用，但对细菌的芽孢杀死作菌孢子均有杀死作用，但对细菌的芽孢杀死作用较差。常用于皮肤和器具表面杀菌。用较差。常用于皮肤和器具表面杀菌。n n 新洁尔灭新洁尔灭 新洁尔灭是表面活性剂类洁净消毒剂。它在新洁尔灭是表面活性剂类洁净消毒剂。它在水溶液中以阳离
12、子形式与菌体表面结合，引起水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白变性。菌体外膜损伤和蛋白变性。10 min10 min能杀死营养能杀死营养细胞，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。一般细胞，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。一般用于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤用于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤剂合用，不能接触铝制品。剂合用，不能接触铝制品。工业发酵灭菌 最新n n 甲醛甲醛 甲醛甲醛(HCHO)(HCHO)是强还原剂，它能与蛋白质的是强还原剂，它能与蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，对氨基和蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，对氨基和蛋白质的变性有较强活性，这是用甲醛作为灭菌
13、剂的根变性有较强活性，这是用甲醛作为灭菌剂的根据。使用时可以以据。使用时可以以2 2份份3737甲醛溶液与甲醛溶液与1 1份份KMnOKMnO4 4混合，或者将混合，或者将3737甲醛溶液直接加热，产甲醛溶液直接加热，产生气态甲醛用于灭菌。甲醛灭菌的缺点是穿透生气态甲醛用于灭菌。甲醛灭菌的缺点是穿透力差。力差。n n 过氧乙酸过氧乙酸 过氧乙酸是强氧化剂，它是广谱、高效、过氧乙酸是强氧化剂，它是广谱、高效、速效的化学杀菌剂，对营养细胞、细菌芽孢、速效的化学杀菌剂，对营养细胞、细菌芽孢、真菌孢子和病毒都有杀灭作用。真菌孢子和病毒都有杀灭作用。工业发酵灭菌 最新n n 戊二醛戊二醛 在酸性条件下，
14、不具有杀死芽孢的能力，在酸性条件下，不具有杀死芽孢的能力，只有在碱性条件下，才具有杀死芽孢的能力，只有在碱性条件下，才具有杀死芽孢的能力，常用常用2 2的溶液，常用于器具、仪器和工具等的溶液，常用于器具、仪器和工具等灭菌。灭菌。n n 酚类酚类 苯酚毒性较大，易污染环境，且水溶性差，苯酚毒性较大，易污染环境，且水溶性差，使应用受到限制，而酚类衍生物的使用，扩使应用受到限制，而酚类衍生物的使用，扩大了作为消毒剂的使用范围。大了作为消毒剂的使用范围。工业发酵灭菌 最新四、臭氧灭菌四、臭氧灭菌n利用臭氧的氧化作用杀死微生物细胞。利用臭氧的氧化作用杀死微生物细胞。n氧化分解葡萄糖所必需的酶，从而直接破
15、氧化分解葡萄糖所必需的酶，从而直接破坏其细胞膜，从而将细菌杀死。坏其细胞膜，从而将细菌杀死。n无污染消毒剂无污染消毒剂n对细菌、霉菌等杀菌效果好对细菌、霉菌等杀菌效果好n安全，杀菌效果明显，安装灵活等特点安全，杀菌效果明显，安装灵活等特点n用于洁净室、净化设备的消毒。用于洁净室、净化设备的消毒。工业发酵灭菌 最新n五、过滤除菌法五、过滤除菌法n n利用过滤方法阻留微生物，也可达到除菌的目利用过滤方法阻留微生物，也可达到除菌的目的，这就是过滤除菌法。的，这就是过滤除菌法。n n此法仅适用于澄清液体和气体的除菌。工业上此法仅适用于澄清液体和气体的除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物
16、常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物培养过程使用。培养过程使用。工业发酵灭菌 最新工业发酵灭菌 最新第二节第二节 培养基和发酵设备的湿热灭菌培养基和发酵设备的湿热灭菌n一、灭菌条件的选择一、灭菌条件的选择 选择的原则：达到灭菌的目的，同时选择的原则：达到灭菌的目的，同时使培养基成分破坏减至最小。使培养基成分破坏减至最小。1、灭菌温度和灭菌时间的选择灭菌温度和灭菌时间的选择 为什么选择为什么选择高温快速高温快速灭菌？灭菌？ 温度升高，反应速率升高，温度升高，反应速率升高，微生物死亡速微生物死亡速率远大于营养成分的的破坏速率率远大于营养成分的的破坏速率灭菌程度与灭菌时间的影响灭菌程度与灭菌时间
17、的影响 微生物的热死规律微生物的热死规律对数残留定律对数残留定律工业发酵灭菌 最新n灭菌程度与灭菌时间的灭菌程度与灭菌时间的影响影响 微生物的热死规律微生物的热死规律对数对数残留定律残留定律n微生物受热死亡的主要原因是高微生物受热死亡的主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残存的微生视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比。物数量成正比。工业发酵灭菌 最新式中式中N经时间经时间t后残存的活菌浓度（个后残存的活菌浓度（个/L)，N0开始灭菌时原有活菌浓度（个开始灭菌时原有活菌浓度（个/L)；t
18、灭菌时间（灭菌时间（s,min）K灭菌速率常数或比死亡速率常数（灭菌速率常数或比死亡速率常数（s-1,min-1）它的大小与微生物的它的大小与微生物的种类种类和加热和加热温度温度有关。在同等有关。在同等温度下，其值小，微生物的耐热性强。温度下，其值小，微生物的耐热性强。从上式得出：从上式得出：t,N之间的关系为对数之间的关系为对数式中式中N/N0菌体存活率，而菌体存活率，而N0/N为灭菌度。为灭菌度。t=（2.303/K）(N0/N)工业发酵灭菌 最新n n影响培养基灭菌的因素影响培养基灭菌的因素n n 培养基成分培养基成分 油脂、糖类；低质量分数油脂、糖类；低质量分数(1(12 2) )的的
19、NaClNaCl溶液溶液n n pHpH值值 pHpH值值6.06.08.08.0，微生物最耐热；，微生物最耐热；pH6.0pH6.0，氢，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡理反应促使其死亡n n 培养基中的颗粒培养基中的颗粒n n 泡沫泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使传热困泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物难，热难穿透过去杀灭微生物工业发酵灭菌 最新二、培养基的灭菌方法二、培养基的灭菌方法n n（1 1）分批灭菌）分批灭菌 n n分批灭菌是在每批培养基全部流入发酵罐后，分批灭菌是在每批培养基全部流入发酵罐
20、后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。罐与培养基一起灭菌。n n不需要附属设备，操作简便，常用的灭菌方法不需要附属设备，操作简便，常用的灭菌方法n n加热和冷却时间较长，营养随时间降低，罐利加热和冷却时间较长，营养随时间降低，罐利用率低；不能采用高温快速灭菌工艺。用率低；不能采用高温快速灭菌工艺。工业发酵灭菌 最新n n发酵罐溶积越大，加热冷却时间越长发酵罐溶积越大，加热冷却时间越长 T总总=t1+t2+t3式中式中式中式中t t1 1、t t2 2
21、、t t3 3分别为加热、维持、冷却所需要的分别为加热、维持、冷却所需要的分别为加热、维持、冷却所需要的分别为加热、维持、冷却所需要的时间时间时间时间n n其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备十分其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备十分耐压，则可采用较高的温度，但必须注意设备耐压，则可采用较高的温度，但必须注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的部位。部位。工业发酵灭菌 最新n n（2 2）连续灭菌）连续灭菌 n n连续灭菌也叫连消，是指培养基在发酵罐外经连续灭菌也叫连消，是指培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入过一套灭菌设
22、备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺流程。已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺流程。n n其其温度一般以温度一般以126132为宜，总蒸汽压力要为宜，总蒸汽压力要求达到求达到0.0440.049MPa以上。以上。n n优点优点 营养成分破坏少；发酵罐非生产占用时间短，营养成分破坏少；发酵罐非生产占用时间短，溶积利用率提高；蒸汽负荷均衡，锅炉利用率溶积利用率提高；蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便；适用于自动化控制，降低劳动高，操作方便；适用于自动化控制，降低劳动强度。强度。工业发酵灭菌 最新n缺点缺点 不适用于黏度大或固形物含量高的培养不适用于黏度大或固形物含量高的培养基的灭菌；增加
23、了一套连续灭菌设备，增基的灭菌；增加了一套连续灭菌设备，增加了操作环节，增加了染菌的概率。加了操作环节，增加了染菌的概率。n按设备和工艺条件分按设备和工艺条件分 （1）蒸汽直接加热）蒸汽直接加热 （2）蒸汽间接加热）蒸汽间接加热工业发酵灭菌 最新1、蒸汽直接加热连续灭菌系统、蒸汽直接加热连续灭菌系统定义：定义：蒸汽通入培养基中，蒸汽通入培养基中，快速加热至杀菌快速加热至杀菌温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过程。分两种形式：程。分两种形式：（1）由连消塔、维持罐和冷却器组成）由连消塔、维持罐和冷却器组成配料罐将培养基预热配料罐将培养基预热60-70，
24、防止培养基在杀菌时，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。连消塔使培养基迅速连消塔使培养基迅速(20s)升温升温(126-132)。维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min.冷却管：将培养基迅速冷却到冷却管：将培养基迅速冷却到40-50，输送到灭菌，输送到灭菌后的发酵罐内后的发酵罐内工业发酵灭菌 最新连续灭菌流程连续灭菌流程连续灭菌流程连续灭菌流程培养基配料培养基配料培养基配料培养基配料 配料罐配料罐配料罐配料罐 加热器加热器加热器加热器 维持罐维持罐维持罐维持罐 冷却器
25、冷却器冷却器冷却器 无菌培养基无菌培养基无菌培养基无菌培养基工业发酵灭菌 最新（2 2）喷射加热连续灭菌流程）喷射加热连续灭菌流程由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续灭菌系统。灭菌系统。蒸汽直接喷入待灭菌的培养液，培养液急剧升蒸汽直接喷入待灭菌的培养液，培养液急剧升温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空冷却器冷却。冷却器冷却。保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻底底升温快、营养损失小升温
26、快、营养损失小随着蒸汽的冷凝使培养基稀释随着蒸汽的冷凝使培养基稀释工业发酵灭菌 最新工业发酵灭菌 最新2 2、蒸汽间接加热连续灭菌系统、蒸汽间接加热连续灭菌系统n蒸汽不直接与培养基接触，而是通过热交换器蒸汽不直接与培养基接触，而是通过热交换器对培养基进行加热。对培养基进行加热。n热交换器有板式和螺旋板式两种热交换器有板式和螺旋板式两种n螺旋板式交换器的特点：流道宽，流速快，可螺旋板式交换器的特点：流道宽，流速快，可减少热交换器表面结垢现象。适用于含有固行减少热交换器表面结垢现象。适用于含有固行悬浮物的培养基的灭菌。悬浮物的培养基的灭菌。n板式交换器的特点：适用于含有少量固行悬浮板式交换器的特点
27、：适用于含有少量固行悬浮物的培养基的灭菌。物的培养基的灭菌。工业发酵灭菌 最新工业发酵灭菌 最新温度随时间的变化温度随时间的变化工业发酵灭菌 最新连续灭菌与分批灭菌的比较与选择连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌分批灭菌优点：优点：1.1.不需附加设备不需附加设备2.2.蒸汽利用率高蒸汽利用率高3.3.节约劳动力节约劳动力缺点缺点1.1.培养基质量差培养基质量差2.2.罐的利用率低罐的利用率低3.3.冷却水用量大冷却水用量大连续灭菌连续灭菌优点：优点：1.1.采用高温快速灭菌法采用高温快速灭菌法2.2.可可以以把把培培养养基基按按其其性性质分开灭菌质分开灭菌3.3.有利于自动控制有利于自动控
28、制4.4.节省冷却水节省冷却水缺点缺点1.1.投资费用高投资费用高2.2.对物料要求高对物料要求高3.3.蒸汽用量大蒸汽用量大工业发酵灭菌 最新三、发酵设备灭菌三、发酵设备灭菌n实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌n连续灭菌时，发酵罐、种子罐等要先进行空罐连续灭菌时，发酵罐、种子罐等要先进行空罐灭菌。灭菌。0.147-0.180MPa，维持，维持45-60min。n空消后不能立即冷却，先保压，待培养基进入空消后不能立即冷却，先保压，待培养基进入后，再开冷却系统。后，再开冷却系统。n附属设备：空气过滤器、补料系统和消泡剂系附属设备：空气过滤器、补料系统和消泡剂系统等。统等。n各个管路在灭菌前，要严格检查，以防泄露和各个管路在灭菌前，要严格检查，以防泄露和“死角死角”的存在。的存在。工业发酵灭菌 最新
