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1、第五章第五章 动物细胞的大规模动物细胞的大规模培养培养一、概述一、概述二、方法和操作方式二、方法和操作方式三、动物细胞生物反应器三、动物细胞生物反应器本章本章内容提要内容提要概述概述 在生物技术中，人们已广泛地围绕着细菌、酵母、在生物技术中，人们已广泛地围绕着细菌、酵母、丝状真菌等微生物的大量培养来生产各种酶、抗生丝状真菌等微生物的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质等产物。然而，许多有重要价值的蛋白素、蛋白质等产物。然而，许多有重要价值的蛋白质等生物物质，必须借助于动物细胞的培养来获得，质等生物物质，必须借助于动物细胞的培养来获得，例如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。例如病毒疫苗、干扰素、单
2、克隆抗体等。 大规模的动物细胞培养开始于本世纪大规模的动物细胞培养开始于本世纪50年代，年代，经过多年来的研究，人类对动物细胞培养技术进行经过多年来的研究，人类对动物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进展。尽管如此，了大量的研究开发，取得了很大的进展。尽管如此，目前的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和目前的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求，随着动物细胞培养技术的应用日趋广生产的要求，随着动物细胞培养技术的应用日趋广泛，已显示出很广阔的发展前景。泛，已显示出很广阔的发展前景。 基本概念：动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术：指在人工条件下，指在人工条件下，
3、在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。胞用于生产生物制品的技术。 人工条件人工条件-既满足培养过程必需的营养既满足培养过程必需的营养要求，还要进行要求，还要进行pH和溶解氧的最佳控制和溶解氧的最佳控制动物细胞培养的产物动物细胞培养的产物 疫苗疫苗人人小小儿儿麻麻痹痹症症疫疫苗苗、狂狂犬犬疫疫苗苗、风风疹疹疫疫苗苗、脑脑炎疫苗、疱疹疫苗等炎疫苗、疱疹疫苗等动物动物牛牛病病毒毒性性腹腹泻泻疫疫苗苗、牛牛痢痢疾疾疫疫苗苗、犬犬传传染染性性肝肝炎炎疫疫苗苗、鸡鸡痘痘病病疫疫苗苗、猪猪霍霍乱乱疫疫苗苗、牛牛疫疫狂狂犬犬疫疫苗苗、草草鱼鱼出出
4、血血热疫苗热疫苗单克隆抗体单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂免疫调节剂-细细胞胞生生长长因因子子、干干扰扰素素、白白细细胞胞活活化化因因子子、血血清清胸胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶酶尿尿激激酶酶、天天门门冬冬氨氨酰酰胺胺酶酶、胶胶原原酶酶、细细胞胞色色素素P、450、纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原激激活活剂剂、胃胃蛋蛋白白酶酶、胰胰蛋蛋白白酶酶、酷酷氨氨酸脱羟酶等酸脱羟酶等激素激素绒绒膜膜促促性性腺腺激激素素、促促红红细细胞胞生生成成素素、促促滤滤泡泡激激素素、生生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等长激素、促间质细胞
5、激素、促黄体激素等大大规规模模动动物物细细胞胞培培养养工工艺艺流流程程图图细胞培养反应器细胞培养反应器提取提取细胞细胞诱生剂诱生剂细胞细胞产品（肿瘤抗原）产品（肿瘤抗原）纯化纯化产品（干扰素）产品（干扰素）纯化纯化提取提取产品（单克隆抗体）产品（单克隆抗体）浓缩纯化浓缩纯化79865432110性性质动物物细胞胞微生物微生物细胞胞大小大小代代谢调节方方式式营养要求养要求生生长速率速率机械机械强强度度环境适境适应性性10-100um内部和激素内部和激素苛刻苛刻倍增倍增时间一般一般为12-60h很差，缺乏保很差，缺乏保护性性细胞胞壁壁差差10um内部内部宽松，可利用多种底松，可利用多种底物物倍增倍
6、增时间一般一般为0.5-2h较好好好好1、动物细胞与微生物细胞的性质比较、动物细胞与微生物细胞的性质比较 第二节第二节大规模培养的方法和操作方式大规模培养的方法和操作方式2 、动物细胞与微生物细胞的培养方法比较、动物细胞与微生物细胞的培养方法比较微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞PH控制控制添加酸、碱添加酸、碱CO2-HCO3缓冲液缓冲液搅拌速度搅拌速度速度快、范围广速度快、范围广较慢较慢溶氧控制溶氧控制改变搅拌速度、通气量、进气氧浓改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度度改变进入气体的氧改变进入气体的氧浓度浓度培养基灭菌方培养基灭菌方法法高温蒸煮高温蒸煮过滤过滤培养时间培养时间几小时几小时几天几
7、天几天几天3、4周周对水纯度的要对水纯度的要求求较低较低很高很高 二、动物细胞培养方法二、动物细胞培养方法贴壁培养贴壁培养悬浮培养悬浮培养固定化培养固定化培养 1.1.贴壁培养贴壁培养 是是指指必必须须贴贴附附在在固固体体介介质表成上生长的细胞培养。质表成上生长的细胞培养。贴壁培养：贴壁培养：旋转瓶培养旋转瓶培养中空纤维培养中空纤维培养细胞工厂培养细胞工厂培养微载体培养微载体培养微载体悬浮培养系统微载体悬浮培养系统 微微载载体体培培养养定定义义：用用微微珠珠作作载载体体， 使使单单层层动动物物细细胞胞生生长长于于微微珠珠表表面面，可可在培养液中进行悬浮培养。在培养液中进行悬浮培养。 微微载载体
8、体：贴贴壁壁培培养养动动物物细细胞胞的的载载体体微微珠。珠。 反应器反应器: :可用与悬浮培养相同设备可用与悬浮培养相同设备 优点：优点：比表面积大；生长条件比表面积大；生长条件易控制且易放大，兼贴壁与悬浮易控制且易放大，兼贴壁与悬浮培养的优势，取样方便；易于分培养的优势，取样方便；易于分离。离。 缺点：缺点：连续搅拌损伤载体表面连续搅拌损伤载体表面细胞；培养后期细胞容易脱落。细胞；培养后期细胞容易脱落。 实心微载体实心微载体大孔微载体大孔微载体2. 2. 悬浮培养悬浮培养 是是指指细细胞胞在在培培养养器器中中自自由由悬悬浮浮生生长的过程。长的过程。6 6、悬浮培养的优点、悬浮培养的优点增加培
9、养细胞与培养液的接触增加培养细胞与培养液的接触面面及时带走培养物产生的有害代及时带走培养物产生的有害代谢产物谢产物保证了氧的充分供应保证了氧的充分供应 3.3.固定化培养固定化培养 是是既既适适用用于于贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞，又又适适用用于于非非贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞的的包包埋埋培培养养方式。方式。3、固定化培养、固定化培养 固固定定化化培培养养是是既既适适用用于于贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞，又又适适用用于于非非贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞的的包包埋埋培培养养方方式式，具具有有细细胞胞生生长长密密度度高高、抗抗剪剪切切力力和和抗污染能力强抗污染能力强等等优点优点。 由由于于所所培
10、培养养的的细细胞胞的的不不同同，固固定定化化培培养养的的方方式式也也有有不不同同，一一般般对对于于贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞通通常常采采用用胶胶原原包包埋埋，而而对对于于非非贴贴壁壁依赖性细胞则常用依赖性细胞则常用海藻酸钙海藻酸钙包埋。包埋。 常常用用的的细细胞胞固固定定化化的的方方法法主主要要有有吸吸附附、共共价价贴贴附附、离离子子/共价交联、共价交联、包埋包埋和微囊化和微囊化等。等。大规模培养技术的操作方式大规模培养技术的操作方式（1）分批培养；（2）流加培养； （3）半连续培养； （4）连续培养；（5）灌流式培养。1、分批式培养、分批式培养定义分分批批式式培培养养是是指指先先将将细细胞
11、胞和和培培养养液液一一次次性性装装入入反反应应器器内内进进行行培培养养，细细胞胞不不断断生生长长，同同时时产产物物也也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。 在在细细胞胞分分批批培培养养过过程程中中，不不向向培培养养系系统统补补加加营营养养物物质质，而而只只向向培培养养基基通通入入氧氧，能能够够控控制制的的参参数数只只有有PH、温温度度和和通通气气量量，因因此此细细胞胞所所处处的的生生长长环环境境随随着着营营养养物物的的消消耗耗和和产产物物、副副产产物物的的积积累累时时刻刻都都在在发发生生变变化化，不不能能使使细细胞胞自自始始至至终终处处于于最最优
12、优的的条条件件下下，因因而而分分批批培培养养并并不不是是一一种种很很好好的的培培养养方方式。式。0时间时间分分批批分批式培养过程的特征分批式培养过程的特征营养物营养物废废产物产物PH、温度、温度、DO0培养时间（d）细胞密度分批式培养的生长曲线对数生长期对数生长期减速期减速期平稳期平稳期衰退期衰退期延延滞期滞期为什么说采用分批式培养细胞效果不佳？为什么说采用分批式培养细胞效果不佳？问题问题 细细胞胞分分批批式式培培养养的的生生长长曲曲线线如如图图所所示示。在在分分批批式式培培养养过过程程中中，细细胞胞的的生生长长可可分分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段。为延滞期、对数生长
13、期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段。 2、流加式培养（、流加式培养（补料分批式） 定义流流加加式式培培养养是是指指先先将将一一定定量量的的培培养养液液装装入入反反应应器器，在在适适宜宜的的条条件件下下接接种种细细胞胞，进进行行培培养养，使使细细胞胞不不断断生生长长，产产物物不不断断形形成成，而而在在此此过过程程中中随随着着营营养养物物质质的的不不断断消消耗耗，不不断断地地向向系系统统中中补补充充新新的的营营养养成成分分，使使细细胞胞进进一一步步生生长长代代谢谢，直直到到整整个培养结束后取出产物。个培养结束后取出产物。 流流加加式式培培养养只只是是向向培培养养系系统统补补加加必必要要的的营营养
14、养成成分分，以以维维持持营营养养物物质质的的浓浓度度不不变变。由由于于流流加加式式培培养养能能控控制制更更多多的的环环境境参参数数，使使得得细细胞胞生生长长和和产产物物生生成成容容易易维持在优化状态。维持在优化状态。流加式培养有何特点？流加式培养有何特点？（P102）问题问题0时间流加流加式培养过程的特征流加式培养过程的特征PH、温度、温度、DO废废产物产物营养物营养物根根据据流流加加控控制制方方式式不不同同，有有两两种种流流加加式式培培养养方方式式：无无反反馈馈控控制制流流加加和和有有反反馈馈控控制制流流加加。无无反反馈馈控控制制流流加加包包括括定定流流量量加加和和间间断断流流加加等等；有有
15、反反馈馈控控制制流流加加一一般般是是连连续续或或间间断断地地测测定定系系统统中中限限制制性性营营养养物物质质的的浓浓度度，并并以以此此为为控控制制指指标标来来调调节节流流加加速速率率或或流加液中营养物质的浓度等。流加液中营养物质的浓度等。3、半连续式培养、半连续式培养 半半连连续续式式培培养养又又可可称称为为反反复复分分批批式式培培养养，是是指指在在分分批批式式培培养养的的基基础础上上，将将分分批批培培养养的的培培养养液液部部分分取取出出，并并重重新新补补充充加加入入等等量量的的新新鲜鲜培培养养基基，从从而而使使反反应应器器内内培养液的总体积保持不变的培养方式。培养液的总体积保持不变的培养方式
16、。定义4、连续式培养、连续式培养 连连续续式式培培养养是是指指将将细细胞胞种种子子和和培培养养液液一一起起加加入入反反应应器器内内进进行行培培养养，一一方方面面新新鲜鲜的的培培养养液液不不断断加加入入反反应应器器内内，另另一一方方面面又又将将反反应应器器液液连连续续不不断断地地取取出出，使反应条件处于一种恒定状态。使反应条件处于一种恒定状态。 定义与与分分批批式式培培养养和和半半连连续续式式培培养养不不同同，连连续续式式培培养养可可以以保保持持细细胞胞所所处处的的环环境境条条件件长长时时间间地地稳稳定定，可可以以使使细细胞胞维维持持在在优优化化的的状状态态下下，促促进进细细胞胞的的生生长长和和
17、产产物物的的形形成成。由由于于连连续续式式培培养养过过程程中中连连续续不不断断地地收收获获产产物物，并并能能提提高高细细胞胞密密度度，在生产上已被应用于培养非贴壁依赖性细胞。在生产上已被应用于培养非贴壁依赖性细胞。 请比较半连续式培养和连续式培养？请比较半连续式培养和连续式培养？问题问题细胞灌流细胞灌流式培养系式培养系统实例统实例液位液位控制控制细细胞胞悬悬液液细细胞胞新鲜培养基新鲜培养基收液收液过滤器过滤器细胞培养系统细胞培养系统动动物物细细胞胞的的连连续续培培养养一一般般是是采采用用灌灌流流培培养养。灌灌流流培培养养是是把把细细胞胞接接种种后后进进行行培培养养，一一方方面面连连续续向向反反
18、应应器器中中注注入入新新鲜鲜的的培培养养基基，同同时时又又连连续续不不断断地地取取出出等等量量的的培培养养液液，但但是是过过程程中中不不取取出出细细胞胞，细细胞胞仍仍留留在在反反应应器器内内，使使细细胞胞处处于于一一种种营营养养不不断断的的状状态态。当当高高密密度度培培养养动动物物细细胞胞时时，必必须须确确保保补补充充给给细细胞胞以以足足够够的的营营养养以以及及除除去去有有素素毒毒的的代代谢谢物物。灌灌流流培培养养时时用用新新鲜鲜的的培培养养液液进进行行灌灌注注，可可以以确确保保上上述述目目的的的的实实现现。通通过过调调节节灌灌注注速速度度，可可以以把把培培养养过过程程保保持持在在稳稳定定的的
19、、废废代代谢谢物物低低于于抑抑制制水水平平的的状状态态下下。灌灌流流培培养养过过程的特征如图所示。程的特征如图所示。 0时间灌注灌注培养过程的特征PH、温度、温度、DO废废产物产物营养物营养物不同培养方式对不同培养方式对CHO细胞生产人细胞生产人组织血纤维溶酶原激活剂（组织血纤维溶酶原激活剂（tPA)产产量和活性的影响量和活性的影响细胞培养方式细胞培养方式分批培养分批培养半半连续培养连续培养灌注培养灌注培养纯化利率 ，%82165纯化物质的相对产量11.337.74比活性，IU/mgtPA114.4391.3392.6采采用用灌灌注注培培养养的的优优越越性性不不仅仅在在于于大大大大提提高高了了
20、细细胞胞生生长长密密度度，而而且且有有助助于于产产物物的的表表达达和和纯纯化化。如如表表及及图图所所示示，因因此此，灌灌注注培培养养已已经经应应用用于于许许多多不不同同的培养系统中，规模已达几百升。的培养系统中，规模已达几百升。说说灌注培养的优越性说说灌注培养的优越性？问题问题第三节第三节动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器1、通气搅拌式细胞培养反、通气搅拌式细胞培养反应器应器 工作原理工作原理:反应器反应器运转时，圆筒以运转时，圆筒以30-30-60r/min60r/min的速度转动，的速度转动，由于离心力的作用，由于离心力的作用，搅拌器中心管内产生搅拌器中心管内产生负压，使搅拌器外培负压，
21、使搅拌器外培养基流入中心管，沿养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从导管螺旋上升，再从导流筒口排出，从搅拌流筒口排出，从搅拌器外沿下降，形成循器外沿下降，形成循环流动。在气腔内气环流动。在气腔内气体由分布管鼓泡，气体由分布管鼓泡，气体溶于液体中，依靠体溶于液体中，依靠气腔丝网外液体的循气腔丝网外液体的循环流动及扩散作用，环流动及扩散作用，使溶于液体中的气体使溶于液体中的气体成分均匀地分布到反成分均匀地分布到反应器内。应器内。反应器的优缺点反应器的优缺点优点：避免向培养优点：避免向培养基直接通气时气基直接通气时气泡损伤细胞，没泡损伤细胞，没有移动部件，密有移动部件，密封好，氧转换率封好，氧转换率较高
22、，便于放大。较高，便于放大。 缺点：氧传递系数缺点：氧传递系数小，气路系统不小，气路系统不能就地灭菌。能就地灭菌。反应器适用范围反应器适用范围 悬浮培养：非贴壁依赖性细胞悬浮培养：非贴壁依赖性细胞和贴壁于微载体的贴壁细胞和贴壁于微载体的贴壁细胞2 2、气升式动物细胞培养反应器、气升式动物细胞培养反应器 与与微微生生物物发发酵酵及及植植物物细细胞胞培培养养的反应器结构相同。的反应器结构相同。优点优点:器内湍流温和均匀剪应力小，完全密封，便器内湍流温和均匀剪应力小，完全密封，便于无菌操作，氧的转换率高，便于放大生产。于无菌操作，氧的转换率高，便于放大生产。 3 3、中空纤维细胞培养反应、中空纤维细胞培养反应器器1 1）结构）结构2 2）用用途途 : :培培养养悬悬浮浮生生长长的的细细胞胞和和贴贴壁壁依依赖赖性细胞性细胞 3)3)优点优点培养器体积小，细胞密度高；培养器体积小，细胞密度高；浓缩产品；浓缩产品；产物纯度高；产物纯度高；自动化程度高，细胞生长周期长。自动化程度高，细胞生长周期长。4)4)缺点缺点: :价格高价格高
