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1、会计学1淀粉酶产生淀粉酶产生(chnshng)菌的分离菌的分离第一页，共12页。淀粉酶：是指一类能催化分解淀粉分子中糖淀粉酶：是指一类能催化分解淀粉分子中糖 苷键的酶的总称，主要包括苷键的酶的总称，主要包括 淀粉酶和淀粉酶和-淀淀粉酶等，粉酶等，-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的的-1,4-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有糖苷键，形成麦芽糖、含有6 6个葡萄糖个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉蓝色。这种淀粉- -碘复合物
2、在碘复合物在660nm660nm处有较大处有较大的吸收的吸收(xshu)(xshu)峰，可用分光光度计测定。随峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定标来测定-淀粉酶的活力。淀粉酶的活力。第1页/共11页第二页，共12页。实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释实验原理：土
3、壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他几天，细菌或者是其他几天，细菌或者是其他几天，细菌或者是其他(qt)(qt)(qt)(qt)的微生物便能在平板的微生物便能在平板的微生物便能在平板的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能
4、够产生淀粉酶接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被的菌便是淀粉产生
5、菌。在培养基上滴碘液，淀粉被的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌透明圈的大小来初步判断菌透明圈的大小来初步判断菌透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。种产淀粉的能力。种产淀粉的能力。种产淀粉的能力。第2页/共11页第三页，共12页。实验器材料及试剂：实验器材料及试剂：实验器材料及试剂：实验器材料及试剂：材料：河南科技学院花园土壤。材料：河南科技学院花园土壤。材料：河南科技学院花园土壤。材
6、料：河南科技学院花园土壤。培养基：培养基：培养基：培养基：（1 1 1 1）分离）分离）分离）分离(fnl)(fnl)(fnl)(fnl)培养基：牛肉膏蛋白胨固体培培养基：牛肉膏蛋白胨固体培培养基：牛肉膏蛋白胨固体培培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏养基（牛肉膏养基（牛肉膏养基（牛肉膏3g3g3g3g、蛋白胨、蛋白胨、蛋白胨、蛋白胨10g10g10g10g、NaCl5gNaCl5gNaCl5gNaCl5g、溶于、溶于、溶于、溶于1000mL1000mL1000mL1000mL蒸馏水中，再加入蒸馏水中，再加入蒸馏水中，再加入蒸馏水中，再加入15g15g15g15g琼脂粉，琼脂粉，琼脂粉，琼脂
7、粉，pHpHpHpH调至，调至，调至，调至，121121121121灭菌灭菌灭菌灭菌15min15min15min15min，待冷却至，待冷却至，待冷却至，待冷却至50505050左右时，于超净左右时，于超净左右时，于超净左右时，于超净工作台倒平板）工作台倒平板）工作台倒平板）工作台倒平板） （2 2 2 2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉20g,20g,20g,20g,硝酸钾硝酸钾硝酸钾硝酸钾1g,1g,1g,1g,磷酸氢二钾磷酸氢二钾磷酸氢二钾磷酸氢二钾0.5g,0.5g,0.5
8、g,0.5g,氯化钠氯化钠氯化钠氯化钠0.5g,0.5g,0.5g,0.5g,硫酸镁硫酸镁硫酸镁硫酸镁0.5g,0.5g,0.5g,0.5g,硫酸亚铁硫酸亚铁硫酸亚铁硫酸亚铁0.01g,0.01g,0.01g,0.01g,琼脂琼脂琼脂琼脂20g,20g,20g,20g,水水水水1000100010001000毫升，调整毫升，调整毫升，调整毫升，调整pHpHpHpH值到。）值到。）值到。）值到。） （3 3 3 3）摇）摇）摇）摇瓶培养：淀粉培养液。瓶培养：淀粉培养液。瓶培养：淀粉培养液。瓶培养：淀粉培养液。第3页/共11页第四页，共12页。试剂：碘液、试剂：碘液、试剂：碘液、试剂：碘液、2%2
9、%2%2%可溶性淀粉、可溶性淀粉、可溶性淀粉、可溶性淀粉、磷酸氢二钠磷酸氢二钠磷酸氢二钠磷酸氢二钠- - - -柠檬酸缓冲柠檬酸缓冲柠檬酸缓冲柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、乙酸、液、标准糊精溶液、乙酸、液、标准糊精溶液、乙酸、液、标准糊精溶液、乙酸、0.85%0.85%0.85%0.85%生理盐水。生理盐水。生理盐水。生理盐水。4444、器材：、器材：、器材：、器材： 培养皿、锥形瓶、高压培养皿、锥形瓶、高压培养皿、锥形瓶、高压培养皿、锥形瓶、高压(goy)(goy)(goy)(goy)灭菌锅、超净工作台、灭菌锅、超净工作台、灭菌锅、超净工作台、灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。恒温水
10、浴锅、分光光度计。恒温水浴锅、分光光度计。恒温水浴锅、分光光度计。器材：器材：器材：器材： 培养皿、锥形瓶、高压培养皿、锥形瓶、高压培养皿、锥形瓶、高压培养皿、锥形瓶、高压(goy)(goy)(goy)(goy)灭菌锅、超净工灭菌锅、超净工灭菌锅、超净工灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。作台、恒温水浴锅、分光光度计。作台、恒温水浴锅、分光光度计。作台、恒温水浴锅、分光光度计。第4页/共11页第五页，共12页。实验步骤：实验步骤：实验步骤：实验步骤：淀粉产生菌的筛选：淀粉产生菌的筛选：淀粉产生菌的筛选：淀粉产生菌的筛选： （1 1 1 1）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液；）采集土样，
11、并用无菌水稀释成菌悬液；）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液；）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液； （2 2 2 2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养基，倒平板备用；基，倒平板备用；基，倒平板备用；基，倒平板备用； （3 3 3 3）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉膏蛋白胨平板上，于膏蛋白胨平板上，于膏蛋白胨平板上，于膏蛋白胨平板上，于37373737摄氏度培养箱
12、中培养一摄氏度培养箱中培养一摄氏度培养箱中培养一摄氏度培养箱中培养一天；天；天；天； （4 4 4 4）挑取整个）挑取整个）挑取整个）挑取整个(zhngg)(zhngg)(zhngg)(zhngg)菌落，将其移入淀粉菌落，将其移入淀粉菌落，将其移入淀粉菌落，将其移入淀粉培养基中，继续放在培养基中，继续放在培养基中，继续放在培养基中，继续放在37373737摄氏度培养箱中培养两摄氏度培养箱中培养两摄氏度培养箱中培养两摄氏度培养箱中培养两天；天；天；天； （5 5 5 5）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。）将碘液滴在平
13、板上，观察透明圈的大小。第5页/共11页第六页，共12页。酶活力测定：酶活力测定：酶活力测定：酶活力测定：（1 1）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于将菌溶于将菌溶于将菌溶于5ml5ml无菌生理盐水中，吸取此培养液加无菌生理盐水中，吸取此培养液加无菌生理盐水中，吸取此培养液加无菌生理盐水中，吸取此培养液加入入入入(jir)(jir)淀粉培养液中，淀粉培养液中，淀粉培养液中，淀粉培养液中，3030摄氏度摇瓶培养摄氏度摇瓶培养摄氏度摇瓶培养摄氏度摇瓶培养72h72h。 （2
14、2）酶液稀释：）酶液稀释：）酶液稀释：）酶液稀释： 取发酵液进行取发酵液进行取发酵液进行取发酵液进行4000r/min4000r/min离心离心离心离心5min5min，取上清液，用缓冲液适当稀释。，取上清液，用缓冲液适当稀释。，取上清液，用缓冲液适当稀释。，取上清液，用缓冲液适当稀释。（3 3）标准曲线制作：）标准曲线制作：）标准曲线制作：）标准曲线制作： 准备七支试管，按照下表准备七支试管，按照下表准备七支试管，按照下表准备七支试管，按照下表配置混合液。使用分光光度计策规定各管溶液配置混合液。使用分光光度计策规定各管溶液配置混合液。使用分光光度计策规定各管溶液配置混合液。使用分光光度计策规
15、定各管溶液在在在在660nm660nm下的下的下的下的ODOD值。然后以淀粉浓度为横坐标，值。然后以淀粉浓度为横坐标，值。然后以淀粉浓度为横坐标，值。然后以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。吸光度为纵坐标，做标准曲线。吸光度为纵坐标，做标准曲线。吸光度为纵坐标，做标准曲线。第6页/共11页第七页，共12页。管号1234567淀粉稀释液/ml2(0%)2(0.2%)2(0.5%)2(1.0%)2(1.5%)2(2.0%)2(2.0%)缓冲液/ml111111140摄氏度水浴保温5min蒸馏水/ml1111110粗酶液/ml000000140摄氏度水浴保温30min，然后放入沸水浴5m
16、in稀碘液/ml1111111第7页/共11页第八页，共12页。（4 4 4 4）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管的要求配置混合液，测得吸光度后，中七号管的要求配置混合液，测得吸光度后，中七号管的要求配置混合液，测得吸光度后，中七号管的要求配置混合液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗消耗消耗消耗(xioho)(xioho)(xioho
17、)(xioho)的淀粉量。的淀粉量。的淀粉量。的淀粉量。（5 5 5 5）酶活力测定：）酶活力测定：）酶活力测定：）酶活力测定： 酶活力以每毫升粗酶液在酶活力以每毫升粗酶液在酶活力以每毫升粗酶液在酶活力以每毫升粗酶液在40404040摄氏度，的条件下每小时所分解的淀粉毫克摄氏度，的条件下每小时所分解的淀粉毫克摄氏度，的条件下每小时所分解的淀粉毫克摄氏度，的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。数来衡量。数来衡量。数来衡量。第8页/共11页第九页，共12页。淀粉产生淀粉产生淀粉产生淀粉产生(chnshng)(chnshng)(chnshng)(chnshng)菌的筛选：菌的筛选：菌的筛选：菌的筛选：第9页/共11页第十页，共12页。第10页/共11页第十一页，共12页。内容(nirng)总结会计学。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。实验器材料及试剂：材料：河南科技学院花园土壤。）（3）摇瓶培养：淀粉培养液。实验步骤：淀粉产生菌的筛选：（1）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液。（2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养基，倒平板备用(biyng)。（2）酶液稀释：取发酵液进行4000r/min离心5min，取上清液，用缓冲液适当稀释。然后以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线第十二页，共12页。
