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1、分子分子实验基本操作培基本操作培训余涛，郑勤思2008-4-13IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount GroupOutlinevv分子分子分子分子实验实验基本流程介基本流程介基本流程介基本流程介绍绍vv分子分子分子分子实验实验基本操作的原理、步基本操作的原理、步基本操作的原理、步基本操作的原理、步骤骤及注意事及注意事及注意事及注意事项项vv总结总结IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本流程介基本流程介绍vv感受感受感受感受态态的制的制的制的制备备vvPCRPCR克隆目的片断克隆目的片断克隆目的片断克隆目的片断vv
2、酶酶切及切及切及切及酶酶切片断回收（切片断回收（切片断回收（切片断回收（电电泳）泳）泳）泳）vv连接连接连接连接vv小提小提小提小提质质粒并粒并粒并粒并酶酶切切切切鉴鉴定（定（定（定（电电泳）泳）泳）泳）vv大大大大肠肠杆菌的培养杆菌的培养杆菌的培养杆菌的培养vv转化转化转化转化IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本流程介基本流程介绍vv感受感受感受感受态态的制的制的制的制备备vvPCRPCR克隆目的片断克隆目的片断克隆目的片断克隆目的片断vv酶酶切及切及切及切及酶酶切片断回收（切片断回收（切片断回收（切片断回收（电电泳）泳）泳）泳）vv转
3、转化化化化vv连连接接接接vv小提小提小提小提质质粒并粒并粒并粒并酶酶切切切切鉴鉴定（定（定（定（电电泳）泳）泳）泳）vv大大大大肠肠杆菌的培养杆菌的培养杆菌的培养杆菌的培养IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作大大肠杆菌的培养杆菌的培养vv原理原理原理原理 大大大大肠肠杆菌在杆菌在杆菌在杆菌在37 37 下在下在下在下在较较好好好好较较快的快的快的快的进进行增殖，行增殖，行增殖，行增殖， 4 4 下下下下则则可可可可较较好停止代好停止代好停止代好停止代谢谢，便于保存。（，便于保存。（，便于保存。（，便于保存。（长长期保存期保存
4、期保存期保存应应在在在在-80 -80 用用用用15-20%15-20%甘油甘油甘油甘油冻冻存）存）存）存） 由于由于由于由于转转入的入的入的入的质质粒粒粒粒带带有抗性有抗性有抗性有抗性标记标记，用，用，用，用带带有抗生素的培有抗生素的培有抗生素的培有抗生素的培养基即可养基即可养基即可养基即可进进行行行行选择选择性培养。性培养。性培养。性培养。vv分分分分为为固体培养基培养和液体培养基培养固体培养基培养和液体培养基培养固体培养基培养和液体培养基培养固体培养基培养和液体培养基培养 IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作大大肠杆菌的
5、培养杆菌的培养vvStep0: LBStep0: LB培养基的配制培养基的配制培养基的配制培养基的配制(1L(1L培养基含培养基含培养基含培养基含) ) 10g Tryptone 10g Tryptone 5g Yeast Extract 5g Yeast Extract 10g NaCl 10g NaCl 15g Agar 15g Agar ( (仅仅在固体培养基中加入，注意在固体培养基中加入，注意在固体培养基中加入，注意在固体培养基中加入，注意琼琼脂脂脂脂为为AgarAgar琼琼脂糖脂糖脂糖脂糖/Agarose/Agarose区分区分区分区分) ) 1L 1L 去离子水去离子水去离子水去离
6、子水vv一般一瓶配一般一瓶配一般一瓶配一般一瓶配100-300mL100-300mLvvStep0: Step0: 灭灭菌（此后一切保持无菌操作）菌（此后一切保持无菌操作）菌（此后一切保持无菌操作）菌（此后一切保持无菌操作） IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作大大肠杆菌的培养杆菌的培养固体培养基培养固体培养基培养固体培养基培养固体培养基培养 （用于（用于（用于（用于筛选筛选或短期保存菌种）或短期保存菌种）或短期保存菌种）或短期保存菌种）vvStep1: Step1: 倒板倒板倒板倒板 微波炉加微波炉加微波炉加微波炉加热热培养
7、基培养基培养基培养基 - - 室温冷却至室温冷却至室温冷却至室温冷却至60 60 左右左右左右左右 - - 移入超移入超移入超移入超净净台，加入抗生素（台，加入抗生素（台，加入抗生素（台，加入抗生素（1000*1000*的，即需稀的，即需稀的，即需稀的，即需稀释释10001000倍），倍），倍），倍），摇摇匀匀匀匀 - - 趁趁趁趁热热快速倒入平板，快速倒入平板，快速倒入平板，快速倒入平板，12mL/12mL/板板板板 - - 超超超超净净台内室温台内室温台内室温台内室温冷却凝固冷却凝固冷却凝固冷却凝固vvStep2: Step2: 接种接种接种接种 划划划划线线法：法：法：法：烧红烧红接种接
8、种接种接种环环 - - 冷却冷却冷却冷却 - - 蘸上菌液蘸上菌液蘸上菌液蘸上菌液 - - 在平板在平板在平板在平板上划上划上划上划线线 -灼灼灼灼烧烧接种接种接种接种环环。 多用于菌种保存多用于菌种保存多用于菌种保存多用于菌种保存 平平平平铺铺法：用玻璃刮刀将菌液法：用玻璃刮刀将菌液法：用玻璃刮刀将菌液法：用玻璃刮刀将菌液铺铺干与平板上，多用于干与平板上，多用于干与平板上，多用于干与平板上，多用于转转化化化化 IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作大大肠杆菌的培养杆菌的培养固体培养基培养固体培养基培养固体培养基培养固体培养基培
9、养vvStep3Step3：3737培养箱中培养。注意需要先正置培养箱中培养。注意需要先正置培养箱中培养。注意需要先正置培养箱中培养。注意需要先正置10min10min（防菌液倒流）再倒置培养（防止染（防菌液倒流）再倒置培养（防止染（防菌液倒流）再倒置培养（防止染（防菌液倒流）再倒置培养（防止染杂杂菌）。注意培养菌）。注意培养菌）。注意培养菌）。注意培养时时间间不可不可不可不可过长过长，一般不超，一般不超，一般不超，一般不超过过1616小小小小时时，防止突，防止突，防止突，防止突变变株株株株产产生。生。生。生。vvStep4Step4：培养：培养：培养：培养结结束后，需放入束后，需放入束后，需
10、放入束后，需放入4 4 冰箱的，冰箱的，冰箱的，冰箱的，为为防止染防止染防止染防止染杂杂菌，菌，菌，菌，最好用最好用最好用最好用parafilmparafilm封口。封口。封口。封口。 IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作大大肠杆菌的培养杆菌的培养液体培养基培养（用于液体培养基培养（用于液体培养基培养（用于液体培养基培养（用于扩扩增）增）增）增）vvStep1Step1：取出适量培养液于：取出适量培养液于：取出适量培养液于：取出适量培养液于锥锥形瓶或形瓶或形瓶或形瓶或试试管。管。管。管。vvStep2: Step2: 加入适量
11、抗生素。加入适量抗生素。加入适量抗生素。加入适量抗生素。vvStep3Step3：将目：将目：将目：将目标标菌落挑入培养液。（可用接种菌落挑入培养液。（可用接种菌落挑入培养液。（可用接种菌落挑入培养液。（可用接种环环或或或或枪头枪头）vvStep4: Step4: 将培养液放入将培养液放入将培养液放入将培养液放入37 37 摇摇床中培养，床中培养，床中培养，床中培养，转转速一般速一般速一般速一般为为220rpm220rpm。（。（。（。（为为什么要什么要什么要什么要摇摇？）？）？）？）IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作大大肠
12、杆菌的培养杆菌的培养注意事注意事注意事注意事项项：vv无菌操作！无菌操作！无菌操作！无菌操作！vv抗生素加入的抗生素加入的抗生素加入的抗生素加入的时时机及量机及量机及量机及量vv培养培养培养培养时间时间（不可（不可（不可（不可过长过长）返回返回返回返回IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作感受感受态的制的制备vv原理：原理：原理：原理： 感受感受感受感受态态 - - 可接受外来可接受外来可接受外来可接受外来DNADNA的状的状的状的状态态 CaCl CaCl2 2法制法制法制法制备备 Ca2+ Ca2+可以使膜骨架可以使膜骨架可
13、以使膜骨架可以使膜骨架发发生改生改生改生改变变，产产生膜生膜生膜生膜 上的小孔洞，并可使上的小孔洞，并可使上的小孔洞，并可使上的小孔洞，并可使DNADNA分子分子分子分子结结合并合并合并合并进进入入入入细细胞内。胞内。胞内。胞内。vv步步步步骤骤：比：比：比：比较较麻麻麻麻烦烦，属，属，属，属较较考考考考验验分子操作的分子操作的分子操作的分子操作的实验实验之一。往往大之一。往往大之一。往往大之一。往往大批量制批量制批量制批量制备备，因此不需，因此不需，因此不需，因此不需经经常常常常进进行。行。行。行。vv注意事注意事注意事注意事项项：感受：感受：感受：感受态态制制制制备备后后后后应应立即立即立
14、即立即冻冻存于存于存于存于-80-80。使用。使用。使用。使用时时不不不不可反复可反复可反复可反复冻冻融。融。融。融。返回返回返回返回IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作酶切及切及酶酶切片断回收切片断回收切片断回收切片断回收vv原理：原理：原理：原理： 限制性内切限制性内切限制性内切限制性内切酶酶： 1 1）发现发现于于于于细细菌中，用于降解噬菌体的菌中，用于降解噬菌体的菌中，用于降解噬菌体的菌中，用于降解噬菌体的DNADNA；宿主自身；宿主自身；宿主自身；宿主自身的的的的DNADNA则则被甲基化。被甲基化。被甲基化。被甲基化
15、。 2 2）分）分）分）分为为I I、IIII、IIIIII类类。常用。常用。常用。常用IIII类类（识别识别位点与位点与位点与位点与酶酶切位切位切位切位点一致）点一致）点一致）点一致） 3 3）区）区）区）区别别与外切与外切与外切与外切酶酶活性（内切活性（内切活性（内切活性（内切酶彻酶彻底切断底切断底切断底切断DNADNA双双双双链链，外，外，外，外切切切切酶酶只切其中一只切其中一只切其中一只切其中一链链，往往用于，往往用于，往往用于，往往用于DNADNA复制的复制的复制的复制的实时检验实时检验。）。）。）。）vv分分分分类类：单单切和双切切和双切切和双切切和双切 IGEM PKUIGEM
16、PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作酶切及切及酶酶切片断回收切片断回收切片断回收切片断回收单单切：切：切：切：vvStep1: Step1: 酶酶切体系的切体系的切体系的切体系的选选定定定定 确定确定确定确定选选用的用的用的用的酶酶 - - 查查找找找找对应对应高效率的高效率的高效率的高效率的bufferbuffer（常用的（常用的（常用的（常用的bufferbuffer有有有有H, M, L, K, T H, M, L, K, T 五种），确定要不要加五种），确定要不要加五种），确定要不要加五种），确定要不要加BSABSAvvH, M, L, K,
17、T buffer H, M, L, K, T buffer 都有什么？都有什么？都有什么？都有什么？ H-High, M-Medium, L-Low, K-KCl, T-Tri-AcetateH-High, M-Medium, L-Low, K-KCl, T-Tri-AcetateB-L, G-M, O-H, R-K, Tango-TB-L, G-M, O-H, R-K, Tango-TIGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作酶切及切及酶酶切片断回收切片断回收切片断回收切片断回收vvStep2: Step2: 配制配制配制配制酶酶
18、切体系：切体系：切体系：切体系：vv以以以以10uL10uL体系体系体系体系为为例例例例 0.5uL 0.5uL 内切内切内切内切酶酶（含（含（含（含50%50%甘油防甘油防甘油防甘油防冻冻） 1uL Buffer (10*) 1uL Buffer (10*) 5uL 5uL 质质粒粒粒粒 3.5uL 3.5uL 去离子水去离子水去离子水去离子水vv原原原原则则： 1 1） 甘油含量不可超甘油含量不可超甘油含量不可超甘油含量不可超过总过总体系体系体系体系5%5%，防止星火性，防止星火性，防止星火性，防止星火性 2 2） 质质粒可根据具体情况粒可根据具体情况粒可根据具体情况粒可根据具体情况调调整
19、整整整 3 3） 内切内切内切内切酶酶切切切切记记不可置于常温！不可置于常温！不可置于常温！不可置于常温！IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作酶切及切及酶酶切片断回收切片断回收切片断回收切片断回收vvStep3: Step3: 置于置于置于置于3737培养箱中，温育培养箱中，温育培养箱中，温育培养箱中，温育2-4h2-4h。（用水浴也可。（用水浴也可。（用水浴也可。（用水浴也可以，但可能会使溶液因蒸以，但可能会使溶液因蒸以，但可能会使溶液因蒸以，但可能会使溶液因蒸发发而而而而产产生生生生浓浓度不均匀）。注意有度不均匀）。注意有
20、度不均匀）。注意有度不均匀）。注意有些特殊的些特殊的些特殊的些特殊的酶酶所需的条件有所不同，主要是温度条件。所需的条件有所不同，主要是温度条件。所需的条件有所不同，主要是温度条件。所需的条件有所不同，主要是温度条件。vvStep4: Step4: 纯纯化，方法同化，方法同化，方法同化，方法同PCRPCR片段片段片段片段纯纯化。化。化。化。vvStep5: Step5: 电电泳泳泳泳检测检测IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作酶切及切及酶酶切片断回收切片断回收切片断回收切片断回收双切：双切：双切：双切：vvStep1: Step
21、1: 酶酶切体系的切体系的切体系的切体系的选选定定定定 确定确定确定确定选选用的两种用的两种用的两种用的两种酶酶 - - 查查找找找找对应对应双切的双切的双切的双切的BufferBuffer，同，同，同，同时时看看看看与分与分与分与分别单别单切的高效切的高效切的高效切的高效bufferbuffer是否吻合是否吻合是否吻合是否吻合 - - 确定要不要加确定要不要加确定要不要加确定要不要加BSABSAvvStep2: Step2: 配制配制配制配制酶酶切体系。与切体系。与切体系。与切体系。与单单切切切切类类似，但需要注意似，但需要注意似，但需要注意似，但需要注意酶酶的用的用的用的用量。（甘油含量不
22、可超量。（甘油含量不可超量。（甘油含量不可超量。（甘油含量不可超5%.5%.）vvStep3: 37Step3: 37温育温育温育温育2-4h2-4hvvStep4: Step4: 凝胶回收凝胶回收凝胶回收凝胶回收IGEM PKUIGEM PKUCount GroupCount Group分子分子实验基本操作基本操作酶切及切及酶酶切片断回收切片断回收切片断回收切片断回收凝胶回收：即双切后将所需要的小片段重新富集凝胶回收：即双切后将所需要的小片段重新富集凝胶回收：即双切后将所需要的小片段重新富集凝胶回收：即双切后将所需要的小片段重新富集纯纯化。化。化。化。vvStep1: Step1: 电电泳，
23、泳，泳，泳，电电泳泳泳泳过过程中称重一小离心管。程中称重一小离心管。程中称重一小离心管。程中称重一小离心管。vvStep2: Step2: 电电泳泳泳泳结结束后，将凝胶置于成像束后，将凝胶置于成像束后，将凝胶置于成像束后，将凝胶置于成像仪仪内。内。内。内。vvStep3: Step3: 戴上手套，持小刀，将小刀灼戴上手套，持小刀，将小刀灼戴上手套，持小刀，将小刀灼戴上手套，持小刀，将小刀灼烧烧后冷却，隔着防后冷却，隔着防后冷却，隔着防后冷却，隔着防护挡护挡板，打开紫外，迅速将目板，打开紫外，迅速将目板，打开紫外，迅速将目板，打开紫外，迅速将目标标片段片段片段片段处处凝胶切下。凝胶切下。凝胶切下。凝胶切下。vvStep4: Step4: 关关关关闭闭紫外，称重，根据紫外，称重，根据紫外，称重，根据紫外，称重，根据kit protocolkit protocol进进行余下行余下行余下行余下试验试验。vv返回返回返回返回
