DNA测序技术的发展历程及其研究进展实用教案

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1、一、DNA序列(xli)测定的意义二、测序技术(jsh)的建立三、DNA测序技术(jsh)的发展四、DNA测序技术的展望五、DNA测序技术的应用第1页/共45页第一页，共46页。 DNA DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容(nirng)(nirng)。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNADNA一级结构的详细了解。一、一、DNADNA序列测定序列测定(cdng)(cdng)的意义的意义第2页/共45页第二页，共46页。 人类基因组计划人类基因组计划(jhu)(

2、jhu)（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHGPHGP）于）于19901990年正式启动，其主要目标有：识别人类年正式启动，其主要目标有：识别人类DNADNA中中所有基因（超过所有基因（超过1010万个）；测定组成人类万个）；测定组成人类DNADNA的的3030亿碱基对亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划析工具；致力于解决该计划(jhu)(jhu)可能引发的伦理、法律可能引发的伦理、法律和社会问题。已于和社会问题。已于20032003年完成。年完成。人

3、类基因组计划人类基因组计划(jhu)(jhu)是当代生命科学一项伟大的科是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了学工程，它奠定了2121世纪生命科学发展和现代医药生物技世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。价值。造福人类的造福人类的HGPHGP第3页/共45页第三页，共46页。19491949年年, Frederick Sanger, Frederick Sanger开发了测定胰岛素两条肽链氨开发了测定胰岛素两条肽链氨基末端序列的技术基末端序列的技术,1953,1953年测定了胰岛素的氨基酸序

4、列。年测定了胰岛素的氨基酸序列。19501950年，年，EdmanEdman提出了蛋白质的提出了蛋白质的N N端测序技术端测序技术, ,后来在此基后来在此基础上发展出了蛋白质自动测序技术。础上发展出了蛋白质自动测序技术。19651965年，年，SangerSanger等发明了等发明了RNARNA的小片段序列测定法的小片段序列测定法, ,并完成并完成(wn chng)(wn chng)了大肠杆菌了大肠杆菌5S rRNA5S rRNA的的120120个核苷酸的测定。个核苷酸的测定。同一时期同一时期,Holley,Holley完成完成(wn chng)(wn chng)了酵母丙氨酸转运了酵母丙氨酸转

5、运tRNAtRNA的序列测定。的序列测定。蛋白质和蛋白质和RNARNA的测序技术的测序技术(jsh)(jsh)二、测序技术二、测序技术(jsh)(jsh)的建立的建立第4页/共45页第四页，共46页。19751975年，年，SangerSanger和和CoulsonCoulson发明了发明了“加减法加减法”测定测定DNADNA序列。序列。19771977年，年， Sanger Sanger在引入双脱氧在引入双脱氧(tu yng)(tu yng)核苷三磷酸核苷三磷酸(ddNTP)(ddNTP)后后, ,形成了双脱氧形成了双脱氧(tu yng)(tu yng)链终止法链终止法, ,使得使得DNAD

6、NA序序列测定的效率和准确性大大提高。列测定的效率和准确性大大提高。19771977年，年，MaxamMaxam和和GilbertGilbert报道了化学降解法测定报道了化学降解法测定DNADNA的序的序列。列。DNADNA测序技术测序技术(jsh)(jsh)的建立的建立第5页/共45页第五页，共46页。 DNA DNA序列测定技术出现后序列测定技术出现后, ,迅速超越了蛋迅速超越了蛋白质和白质和RNARNA测序技术测序技术, ,成为现代成为现代(xindi)(xindi)分子生分子生物学中最重要的技术。物学中最重要的技术。第6页/共45页第六页，共46页。三、三、DNADNA测序技术测序技术

7、(jsh)(jsh)的的发展发展第一代第一代DNADNA测序技术测序技术(jsh)(jsh)第二代第二代DNADNA测序技术测序技术(jsh)(jsh)第三代第三代DNADNA测序技术测序技术(jsh)(jsh)第7页/共45页第七页，共46页。1 1、第一代、第一代DNADNA测序技术测序技术(jsh)(jsh)第一代第一代DNADNA测序技术：测序技术： 传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们(t (t men)men)的基础上发展来的各种的基础上发展来的各种DNADNA测序技术。测序技术。 第一代第一代DNADNA测序技术包括：化学降解法、双

8、脱氧链终止法、测序技术包括：化学降解法、双脱氧链终止法、荧光荧光(ynggung)(ynggung)自动测序技术和杂交测序技术。自动测序技术和杂交测序技术。第8页/共45页第八页，共46页。1.1 1.1 化学降解法化学降解法基本原理基本原理: : 利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂(dun li)DNA(dun li)DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，判断判断DNADNA片段末端核苷酸的种类，从而测出片段末端核苷

9、酸的种类，从而测出DNADNA的序列。的序列。第9页/共45页第九页，共46页。 将双链DNA样品变为单链 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解(jin ji)DNA群体 电泳,读取DNA的核苷酸顺序技术技术(jsh)(jsh)路线路线第10页/共45页第十页，共46页。碱基碱基特异修饰方法特异修饰方法GPh8.0,用用硫酸二甲酯硫酸二甲酯对对 N7进行甲基化进行甲基化,使使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 哌啶甲酸哌啶甲酸可使嘌呤环的可使嘌呤环的N原子化原子化,从而导从而导致脱

10、嘌呤致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼肼可打开嘧啶环可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除后者重新环化成五元环后易除去去C1.5mol/L NaCl存在时存在时,可用可用肼肼除去胞嘧啶除去胞嘧啶Maxam-Gilbert Maxam-Gilbert 法所用法所用(su yn)(su yn)的的化学技术化学技术第11页/共45页第十一页，共46页。第12页/共45页第十二页，共46页。 化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生

11、(chnshng)的拷贝，排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。第13页/共45页第十三页，共46页。1.2 1.2 双脱氧双脱氧(tu yng)(tu yng)链终止法链终止法 又称为又称为SangerSanger法。该法的原理是：利用法。该法的原理是：利用DNADNA聚合酶，以待聚合酶，以待测单链测单链DNADNA为模板，以为模板，以dNTPdNTP为底物，设立四种相互独立的测序为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dide

12、oxyribo nucleoside triphos phatedideoxyribo nucleoside triphos phate，ddNTPddNTP）作为）作为(zuwi)(zuwi)链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按从凝胶底部到顶部按5353方向读出新合成链序列，由此推方向读出新合成链序列，

13、由此推知待测模板链的序列知待测模板链的序列 。第14页/共45页第十四页，共46页。 POHdNTPddNTP POHOH P P P POH第15页/共45页第十五页，共46页。双双脱脱氧氧链末末端端终止止(z(zhhngngzhzh) )法法测序序原原理理示示意意图 第16页/共45页第十六页，共46页。 Sanger Sanger法因操作简便，得到广泛法因操作简便，得到广泛(gungfn)(gungfn)的应的应用。后来在此基础上发展出多种用。后来在此基础上发展出多种DNADNA测序技术，其测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。中最重要的是荧光自动测序技术。第17页/共45页第十七页

14、，共46页。1.3 1.3 荧光荧光(ynggung)(ynggung)自动测序技术自动测序技术 荧光自动测序技术基于荧光自动测序技术基于(jy)Sanger(jy)Sanger原理，用荧光标记代原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNADNA测序测序的速度和准确性。的速度和准确性。 目前，应用最广泛的应用生物系统目前，应用最广泛的应用生物系统(xtng)(xtng)公司公司(applied biosystems (applied biosystems ，ABI)3730ABI)3730系列自动测序仪即是基于系列

15、自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的毛细管电泳和荧光标记技术的DNADNA测序仪。如测序仪。如ABI3730XLABI3730XL测序测序仪拥有仪拥有9696道毛细管，道毛细管，4 4种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记，在通过毛细管时不同长度的荧光标记，在通过毛细管时不同长度的DNADNA片段上的片段上的4 4种荧光种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被CCDCCD检测系统检测系统(xtng)(xtng)识别，并直接翻译成识别，并直接翻译成DNADNA序列。序列。第18页/共45页第十八页，共46页。目前

16、所用目前所用(su yn)(su yn)自动测序技术的自动测序技术的改进改进第19页/共45页第十九页，共46页。3730全自动测序仪第20页/共45页第二十页，共46页。1.41.4杂交杂交(zjio)(zjio)测序技术测序技术 该方法不同于化学降解法和该方法不同于化学降解法和SangerSanger法，是利用法，是利用DNADNA杂杂交原理，将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片交原理，将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上，把待测的上，把待测的DNADNA样品片段变性后与其杂交，根据杂交情况样品片段变性后与其杂交，根据杂交情况排列出样品的序列信息。排列出样品的序列信息。

17、杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷酸杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷酸芯片芯片(xn pin)(xn pin)能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。第21页/共45页第二十一页，共46页。 通过几十年的逐步改进通过几十年的逐步改进, , 第第1 1 代测序仪的读长可以超过代测序仪的读长可以超过1000 bp, 1000 bp, 原始数据的准确率可以高达原始数据的准确率可以高达99.999%, 99.999%, 测定每千碱基测定每千碱

18、基序列的成本序列的成本(chngbn)(chngbn)是是0.5 0.5 美元美元, , 每天的数据通量可以达到每天的数据通量可以达到600000 600000 碱基。碱基。第22页/共45页第二十二页，共46页。 第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用, ,如人类基因组计划如人类基因组计划(human genome project,HGP)(human genome project,HGP)主要主要(zhyo)(zhyo)基基于第一代于第一代DNADNA测序技术。目前基于荧光标记和测序技术。目前基于荧光标记和SangerSanger的

19、双脱氧链的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。 随着人类随着人类(rnli)(rnli)基因组计划的完成基因组计划的完成, ,人们进入了后人们进入了后基因组时代基因组时代, ,即功能基因组时代即功能基因组时代, ,传统的测序方法已经不能传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求, ,这促这促使了新一代使了新一代DNADNA测序技术的诞生。新一代测序技术即第二代测序技术的诞生。新一代测序技术即第二代测序技术。测序技术。第23页/共45页第二十三页，共46页。2 2、第二

20、代、第二代DNADNA测序技术测序技术(jsh)(jsh) 第二代测序技术第二代测序技术(jsh)(jsh)，主要包括罗氏，主要包括罗氏454454公司的公司的GS GS FLXFLX测序平台、测序平台、IlluminaIllumina公司的公司的Solexa Genome AnalyzerSolexa Genome Analyzer测序平测序平台和台和ABIABI公司的公司的SOLiDSOLiD测序平台。测序平台。 第二代测序技术最显著的特征是高通量第二代测序技术最显著的特征是高通量, ,一次能对几一次能对几十万到几百万条十万到几百万条DNADNA分子进行分子进行(jnxng)(jnxng)

21、序列测序序列测序, ,使得对一使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。第24页/共45页第二十四页，共46页。 第二代测序技术将片段化的基因组第二代测序技术将片段化的基因组DNADNA两侧连上接头两侧连上接头, ,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCRPCR克隆阵列。克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行引物每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上, ,这些这些反应就能

22、够大规模平行反应就能够大规模平行(pngxng)(pngxng)进行进行, ,每个延伸反应所掺每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行入的荧光标记的成像检测也能同时进行, ,从而获得测序数据。从而获得测序数据。DNADNA序列延伸和成像检测不断重复序列延伸和成像检测不断重复, ,最后经过计算机分析就最后经过计算机分析就可以获得完整的可以获得完整的DNADNA序列信息。序列信息。 第二代测序技术包括：第二代测序技术包括：454454测序技术、测序技术、SolexaSolexa测序测序技术和技术和SOLiDSOLiD测序技术。测序技术。第25页/共45页第二十五页，共46页。2.1 45

23、42.1 454测序技术测序技术(jsh)(jsh) 原理：在原理：在DNADNA聚合酶、聚合酶、ATPATP硫酸化酶、荧光素酶和硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个双磷酸酶的作用下，将每一个dNTPdNTP的聚合与一次化学发的聚合与一次化学发光信号光信号(xnho)(xnho)的释放偶联起来，通过检测化学发光信的释放偶联起来，通过检测化学发光信号号(xnho)(xnho)的有无和强度，达到实时检测的有无和强度，达到实时检测DNADNA序列的目的。序列的目的。 第26页/共45页第二十六页，共46页。第27页/共45页第二十七页，共46页。 454 454生命科学公司在生命科学公司在

24、20052005年最早推出了第二代测序平年最早推出了第二代测序平台台Genome Sequencer 20Genome Sequencer 20，并测序了支原体，并测序了支原体Mycoplasma Mycoplasma genitaliumgenitalium的基因组。的基因组。 并在并在20072007年推出性能更优的第二代年推出性能更优的第二代基因组测序系统基因组测序系统(xtng)(xtng)一一Genome Sequencer FLX Genome Sequencer FLX System(GS FLX)System(GS FLX)。罗氏在。罗氏在20052005年便与年便与45445

25、4公司洽谈并购事宜，公司洽谈并购事宜，20072007年完成并购，紧接着公布了年完成并购，紧接着公布了DNADNA双螺旋的发现者之一双螺旋的发现者之一沃森沃森(Jim Watson)(Jim Watson)的个人基因组，测序总花费不到一百万的个人基因组，测序总花费不到一百万美元。美元。第28页/共45页第二十八页，共46页。2.2 Solexa2.2 Solexa测序技术测序技术(jsh)(jsh) 核心技术：核心技术：“DNA“DNA簇簇”和和“可逆性末端可逆性末端(m dun)(m dun)终终止止” ” 。 原理：将基因组原理：将基因组DNADNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表的随机片

26、段附着到光学透明的玻璃表面（即面（即Flow cellFlow cell），这些），这些DNADNA片段经过延伸和桥式扩增后，在片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cellFlow cell上形成了数以亿计上形成了数以亿计ClusterCluster，每个，每个ClusterCluster是具有数是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光(ynggung)(ynggung)基团基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBSSBS（边合成（边合成边测序）技术对待测的模板边测序）技术对待测的模板DNADNA

27、进行测序。进行测序。 Illumina Illumina公司的新一代测序仪公司的新一代测序仪Genome AnalyzerGenome Analyzer最早由最早由SolexaSolexa公司研发，利用合成测序公司研发，利用合成测序(Sequencingby Synthesis)(Sequencingby Synthesis)的原的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。第29页/共45页第二十九页，共46页。 Genome Analyzer Genome Analyzer系统需要的样品量低至系统需要的样品量低至100ng100ng，文库构，文库构建过

28、程建过程(guchng)(guchng)简单，减少了样品分离和制备的时间，简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到配对末端读长可达到250 bp250 bp，每次运行后可获得超过，每次运行后可获得超过20 GB20 GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。高的新一代测序技术。第30页/共45页第三十页，共46页。 SOLID SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光标记标记(bioj)(bioj)的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶的寡核苷酸进行

29、多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：连接反应。具体步骤包括：文库文库(wnk)(wnk)准备准备扩增扩增微珠与玻片连接微珠与玻片连接(linji)(linji)连接测序连接测序 超高通量是超高通量是SOLIDSOLID系统最突出的特点，目前系统最突出的特点，目前SOLID 3SOLID 3单次运单次运行可产生行可产生50 GB50 GB的序列数据，相当于的序列数据，相当于1717倍人类基凶组覆盖度。倍人类基凶组覆盖度。2.3 SOLiD2.3 SOLiD测序技术测序技术第31页/共45页第三十一页，共46页。第32页/共45页第三十二页，共46页。3 3、第三代、第三代DNA

30、DNA测序技术测序技术(jsh)(jsh) 第三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术。如生物第三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术。如生物科学公司科学公司(BioScience Corporation)(BioScience Corporation)的的HeliScopeHeliScope单分子测序仪单分子测序仪(HeliScope SingleMolecular Sequencer)(HeliScope SingleMolecular Sequencer)以及正在研制以及正在研制(ynzh)(ynzh)的太平洋生物科学公司的太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences

31、)(Pacific Biosciences)的单分子实时的单分子实时DNADNA测测序技术序技术SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing technologytechnology和牛津纳米孔技术公司和牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore (Oxford Nanopore TechnologiesLtd)TechnologiesLtd)的纳米孔单分子测序技术等。的纳米孔单分子测序技术等。第33页/共45页第三十三页，共46页。 目前目前, ,

32、我国也启动了第三代测序技术的研究。我国也启动了第三代测序技术的研究。20092009年年1212月月, ,中科院北京基因组研究所与浪潮成立中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基中科院北京基因组研究所因组研究所浪潮基因组科学联合实验室浪潮基因组科学联合实验室”,”,利用各自的优利用各自的优势联合研发势联合研发(yn f)(yn f)国产第三代测序仪国产第三代测序仪, ,第一台样机预计第一台样机预计20132013年问世年问世, ,届时有望缓解测序仪核心技术受制于国外公司届时有望缓解测序仪核心技术受制于国外公司的现状。的现状。 第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应第二代的高通量测

33、序技术已经得到了很好的发展和应用用, , 但是但是(dnsh)(dnsh)由于其测序速度、成本、准确度等关键问由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的解决仍存在困难题的解决仍存在困难, ,研究者们很快将目光转向了更高更新的研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。测序解决方案。 单分子测序也就应运而生。单分子测序也就应运而生。第34页/共45页第三十四页，共46页。第三代测序技术非常惊人！第三代测序技术非常惊人！1 1、它实现了、它实现了DNADNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测1010个个碱基，测序速度是化学法测序的碱基，测序速度是化学法测序的

34、2 2万倍。万倍。2 2、它实现了、它实现了DNADNA聚合酶内在自身的聚合酶内在自身的processivityprocessivity（延续性，也（延续性，也就是就是DNADNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个聚合酶一次可以合成很长的片段），一个(y )(y )反应反应就可以测非常长的序列。就可以测非常长的序列。 二代测序现在可以测到上百个碱基，二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复序但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。列的拼接提供了非常好的条件。3 3、它的精度非常高，达到、它的精度非常高，达到

35、99.9999%99.9999%。4 4、可直接测、可直接测RNARNA序列。序列。5 5、可直接测甲基化的、可直接测甲基化的DNADNA序列。序列。第35页/共45页第三十五页，共46页。 2008 2008年年4 4月，月，Helico BioScienceHelico BioScience公司的公司的TimothyTimothy等人在等人在ScienceScience上报道了他们开发的真正的单分子测序技术上报道了他们开发的真正的单分子测序技术, ,并利用该并利用该技术对一个技术对一个M13M13病毒基因组进行重测序。病毒基因组进行重测序。 这项技术之所以被称这项技术之所以被称为为(chn

36、 wi)(chn wi)真正的单分子测序真正的单分子测序, ,是因为它完全跨过了前述是因为它完全跨过了前述3 3种高通量测序依赖的基于种高通量测序依赖的基于PCRPCR扩增的信号放大过程扩增的信号放大过程, ,真正达到了真正达到了读取单个荧光分子的能力。读取单个荧光分子的能力。 斯坦福大学的科学家最近利用斯坦福大学的科学家最近利用HeliscopeHeliscope单分子测序单分子测序仪仪, ,用了用了48 00048 000美元的试剂和美元的试剂和4 4个星期的时间个星期的时间, ,对一名白人男对一名白人男子的基因组进行了测序。测序的覆盖度达子的基因组进行了测序。测序的覆盖度达2828倍倍,

37、 ,覆盖了覆盖了90%90%的的人类人类(rnli)(rnli)参考基因组。序列读长参考基因组。序列读长24-70 bp,24-70 bp,平均读长为平均读长为32 bp,32 bp,并鉴定出并鉴定出280280万个万个SNPSNP位点和位点和752752个拷贝数变异。个拷贝数变异。3.1 HeliScope3.1 HeliScope单分子单分子(fnz)(fnz)测序仪测序仪第36页/共45页第三十六页，共46页。 Pacific bioscience Pacific bioscience 在在ScienceScience上报道了他们的基于上报道了他们的基于SMARTSMART技术的单分子测

38、序技术技术的单分子测序技术, ,该技术利用单分子技术和该技术利用单分子技术和DNADNA聚聚合酶合酶, ,在聚合反应的同时就可以读取测序产物在聚合反应的同时就可以读取测序产物, ,目前一期的读取目前一期的读取速度为速度为3bp / s,3bp / s,但他们声称在但他们声称在2013 2013 前实现三分钟读完人类基前实现三分钟读完人类基因组。因组。PacificPacific技术目前在研究技术目前在研究(ynji)(ynji)大肠杆菌基因组时的大肠杆菌基因组时的评价读长为评价读长为586586个碱基个碱基, ,有些能达到有些能达到28052805碱基碱基, ,新仪器的单个读新仪器的单个读长已

39、达长已达1035110351个碱基个碱基, ,而且有望实现更大的读长而且有望实现更大的读长, ,而且准确率而且准确率99.9999%99.9999%。 3.2 3.2 单分子实时单分子实时(sh sh)DNA(sh sh)DNA测测序技术序技术第37页/共45页第三十七页，共46页。 英国牛津纳米公司成功研制出了基于纳米孔的单分子英国牛津纳米公司成功研制出了基于纳米孔的单分子测序技术测序技术, ,该技术读取数据的速度更快该技术读取数据的速度更快, ,而且成本会大大降低而且成本会大大降低 。 在该测序技术平台中在该测序技术平台中,DNA,DNA分子以一次一个碱基的速度依次分子以一次一个碱基的速度

40、依次通过纳米小孔通过纳米小孔, ,利用利用(lyng)(lyng)核酸外切酶的特性来识别出不同核酸外切酶的特性来识别出不同的的DNADNA碱基碱基, ,同时还能检测出碱基是否被甲基化等相关的重要同时还能检测出碱基是否被甲基化等相关的重要信息。信息。3.3 3.3 纳米孔单分子纳米孔单分子(fnz)(fnz)测序技测序技术术第38页/共45页第三十八页，共46页。 据据2010 2010 年年7 7 月月30 30 日日Xiao YanXiao Yan（Nano LettNano Lett，July 30July 30，20102010）报道，美国宾夕法尼亚大学的研究人员开发出一个纳米）报道，美

41、国宾夕法尼亚大学的研究人员开发出一个纳米(n m)(n m)级的碳基平台，可用于电子探测单个级的碳基平台，可用于电子探测单个DNA DNA 分子。该技分子。该技术最终有望在快速术最终有望在快速DNA DNA 电子测序方面发挥电子测序方面发挥“用武之地用武之地”。这个。这个纳米纳米(n m)(n m)平台由石墨烯制成。研究小组利用电子束技术，平台由石墨烯制成。研究小组利用电子束技术，在石墨烯膜上烧灼出纳米在石墨烯膜上烧灼出纳米(n m)(n m)大小的小孔，在电场的作用大小的小孔，在电场的作用下，微小的下，微小的DNADNA链就可以穿过这些孔洞。通过电子测量手段检链就可以穿过这些孔洞。通过电子测

42、量手段检测测DNA DNA 的易位，再根据的易位，再根据DNA DNA 的的4 4 个碱基各自独特的个碱基各自独特的“电子签名电子签名”，就可以快速完成，就可以快速完成DNA DNA 测序。测序。探测单个探测单个DNA DNA 分子分子(fnz)(fnz)技术开启高通技术开启高通量量DNA DNA 电子测序之门电子测序之门第39页/共45页第三十九页，共46页。第40页/共45页第四十页，共46页。四、四、DNADNA测序技术测序技术(jsh)(jsh)的展望的展望 DNA DNA测序技术经过测序技术经过3030多年的发展多年的发展, ,目前已经到了第三代目前已经到了第三代, ,三代测序技术有

43、各自的优势。三代测序技术有各自的优势。 第一代测序技术虽然第一代测序技术虽然(surn)(surn)成本高成本高, ,速度慢速度慢, ,但是对但是对于少量的序列来说于少量的序列来说, ,仍是最好的选择仍是最好的选择, ,所以在以后的一段时间所以在以后的一段时间内仍将存在内仍将存在; ; 第二代测序技术刚刚商用不久第二代测序技术刚刚商用不久, ,正在逐渐走向成熟正在逐渐走向成熟; ; 第三代测序技术有的刚刚出现第三代测序技术有的刚刚出现, ,有的则正在研制有的则正在研制, ,相信相信很快便可进行商业化运作。很快便可进行商业化运作。 可以预见可以预见, ,在未来的几年里会出现三代测序技术共存在未来

44、的几年里会出现三代测序技术共存的局面。的局面。第41页/共45页第四十一页，共46页。 随着新的测序技术的出现随着新的测序技术的出现, ,大规模测序的成本迅速下大规模测序的成本迅速下降降, ,花费花费1 0001 000美元测一个人的基因组的目标相信很快就可以美元测一个人的基因组的目标相信很快就可以实现。届时实现。届时, ,对于遗传病的诊治将变得简单、快速对于遗传病的诊治将变得简单、快速, ,并能从基并能从基因组水平上指导个人的医疗和保健因组水平上指导个人的医疗和保健, ,从而进入从而进入(jnr)(jnr)个人化个人化医疗的时代。同时医疗的时代。同时, ,生物学研究的进展将会更多地依赖于测生

45、物学研究的进展将会更多地依赖于测序技术的进步序技术的进步, ,不同领域的科学家花很少的钱就可以对自己不同领域的科学家花很少的钱就可以对自己熟悉的物种基因组进行测序熟悉的物种基因组进行测序, ,从而更好地指导试验设计从而更好地指导试验设计, ,取得取得更多新的发现。更多新的发现。第42页/共45页第四十二页，共46页。基因组项目基因组项目 ( (全程测序全程测序) )人，鼠，酵母，病原微生物，水稻人，鼠，酵母，病原微生物，水稻(shudo)(shudo)，玉米等，玉米等cDNA cDNA 测序测序 (EST (EST 或全长测序或全长测序) ) 比较测序或杂合子测序比较测序或杂合子测序 单核苷酸

46、多态性（单核苷酸多态性（SNPSNP）的发现与验证）的发现与验证 突变检测突变检测BRCA, MSH2/MLH1, p53BRCA, MSH2/MLH1, p53依据于测序的分型试剂盒依据于测序的分型试剂盒应用于器官移植等的应用于器官移植等的HLA HLA 配型试剂盒配型试剂盒应用于法医的线粒体测序应用于法医的线粒体测序指导临床治疗的指导临床治疗的HIVHIV基因型检测试剂盒基因型检测试剂盒针对针对16S rRNA 16S rRNA 的细菌鉴定试剂盒的细菌鉴定试剂盒 针对针对D2 rDNA D2 rDNA 的真菌鉴定试剂盒的真菌鉴定试剂盒 五、五、五、五、DNA DNA DNA DNA 测序技

47、术测序技术测序技术测序技术(jsh)(jsh)(jsh)(jsh)的应用的应用的应用的应用第43页/共45页第四十三页，共46页。THEENDThank you ！第44页/共45页第四十四页，共46页。感谢您的欣赏(xnshng)！第45页/共45页第四十五页，共46页。内容(nirng)总结一、DNA序列测定的意义。肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去。核心技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止”。其基本原理是以四色荧光标记(bioj)的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。测序的覆盖度达28倍,覆盖了90%的人类参考基因组。可以预见,在未来的几年里会出现三代测序技术共存的局面。感谢您的欣赏第四十六页，共46页。