农学]第二节酶学与酶工程

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1、第二节 酶学与酶工程 酶的分类、组成、结构特点和作用机制酶的分类、组成、结构特点和作用机制酶作为催化剂的显著特点酶作为催化剂的显著特点酶抑制作用的概念和分类酶抑制作用的概念和分类可逆抑制作用可逆抑制作用不可逆抑制作用不可逆抑制作用酶抑制剂的应用酶抑制剂的应用一、 酶的分类、组成、结构特点和作用机制酶的分类：酶的组成和结构特点酶的作用机制1酶的分类：氧化还原酶转移酶水解酶裂合酶异构酶连接酶（合成酶）核酸酶（催化核酸）（ 1 ） 氧化还原酶 (Oxidoreductase)包括脱氢酶(Dehydrogenase) 、氧化酶(Oxidase) 、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等（2）转移酶(Tr

2、ansferase)包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等（3）水解酶(Hydrolase)脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶（4）裂合酶(Lyase)这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。（5）异构酶(Isomerase)此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等（6）连接酶（合成酶）(Ligase or Synthetase)这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键（与脂肪酸合成有关）

3、、C-C键和磷酸酯键。 （7）核酸酶（催化核酸） Ribozyme核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。酶用于生物催化的概况类别类别占总酶占总酶比例比例% %利用率利用率% %水解酶水解酶 hydrolases2665氧化还原酶氧化还原酶oxidoreductases2725转移酶转移酶 transferases245裂合酶裂合酶 lyases125异构酶异构酶 isomerases51连接酶连接酶 ligases612酶的组成和结构特点单体酶寡聚酶多酶复合体（1）多酶复合体的组成部分辅因子：酶蛋白中非蛋白质部分，它可以是无机离子也可以是

4、有机化合物。辅酶：有机辅因子与酶蛋白结合松散即为辅酶。辅基：有机辅因子与酶蛋白结合紧密即为辅基。 3酶的作用机制 酶的作用过程酶与底物的结合模型酶的催化作用1） 酶的作用过程酶的活性部位：是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。 2）酶与底物的结合模型a 锁和钥匙模型b 诱导锲合模型 a 锁和钥匙模型b 诱导锲合模型3）酶的催化作用（1） 研究方法（2）影响酶的催化作用（1） 研究方法a.从非酶系统模式获得催化作用规律b.从酶的结构与功能研究中得到催化作用机理的证据。 （2）影响酶的催化作用 a. 广义的酸碱

5、催化b. 共价催化c. 邻近效应及定向效应d. 变形或张力e. 酶的活性中心为疏水区域a. 广义的酸碱催化能供给质子的物质即为酸，能接受质子的物质即为碱例 HA=A-+H+ HA为酸，A-为碱例 HA（酸）+A=AXH（酸催化）AXH+B-（碱）=Y+BH+A-（碱催化） b. 共价催化底物与酶以共价方式形成中间物。这种中间物可以很快转变为活化能大为降低的转变态，从而提高催化反应速度b. 共价催化亲电试剂：一种试剂具有强烈亲和电子的原子中心。亲核试剂：就是一种试剂具有强烈供给电子的原子中心。c. 邻近效应及定向效应所谓邻近效应就是底物的反应基团与酶的催化基团越靠近，其反应速度越快。d. 变形或

6、张力e. 酶的活性中心为疏水区域酶的活性中心为酶分子的凹穴此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基第一节结束酶的分类：酶的组成和结构特点酶的作用机制氧化还原酶转移酶水解酶裂合酶异构酶连接酶 单体酶 寡聚酶 多酶复合体 酶的作用过程 酶与底物的结合模型 酶的催化作用广义的酸碱催化共价催化邻近效应及定向效应变形或张力酶的活性中心为疏水区域锁和钥匙模型诱导锲合模型二、 酶作为催化剂的显著特点催化能力专一性调节性 1.催化能力催化转换数：每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。一般为103min-1，碳酸酐酶最高为3.6* 107min-1有酶加入比无酶参加反应速度一般要高107-10132.专一性绝对专一：

7、 只催化一种底物进行快速反应，甚至是立体专一性相对专一性：基团专一和键专一 3.调节性酶浓度的调节 激素调节 共价修饰调节 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 抑制剂的调节 反馈调节 金属离子和其他小分子化合物的调节催化能力专一性调节性酶酶作作为为催催化化剂剂的的显显著著特特点点绝对专一相对专一1. 酶浓度的调节 2 激素调节 3. 共价修饰调节 4. 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 5. 抑制剂的调节 6. 反馈调节 7. 金属离子和其他小分子化合物的调节三、 酶抑制作用的概念和分类概念抑制程度的表示抑制作用的分类抑制作用的定义1、概念：能降低酶催化反应速度的因素 失活作用抑制作用去激活作用4.

8、 阻遏作用1）. 失活作用失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。 2）. 抑制作用抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。 3）. 去激活作用去激活作用，某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失。4）. 阻遏作用阻遏作用指某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化.2.抑制程度的表示 一般用反应速度的变化来表示。若以不加抑制剂时的反应速度为 Vo，加入抑制剂

9、后的反应速度为Vi，则酶的抑制程度有下列几种表示方法： 2.抑制程度的表示： 相对活力分数（残余活力分数） a=Vi/Vo相对活力百分数（残余活力百分数） a%=Vi/Vo*100%抑制分数 指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo抑制百分数 i%=(1-a)*100%=(1-Vi/Vo)*100% 通常所谓抑制率是指抑制分数或 抑制百分数。 3. 抑制作用的分类 不可逆抑制作用（非专一性不可逆抑制作用；专一性不可逆抑制作用）可逆抑制作用（竞争性抑制作用，非竞争性抑制作用，反竞争性抑制作用，混合型抑制）四. 抑制作用的定义不可逆抑制作用可逆抑制作用1）.不可逆抑制作用抑制剂与酶的必需

10、基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活者，称为不可逆抑制作用。2）. 可逆抑制作用抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方 法除去抑制剂而使酶复活者称为可逆抑制作用。5可逆抑制和不可逆抑制作用的鉴别 除了根据上述透析，过滤等物理方法视其能否去除抑制剂来区别不可逆抑制和可逆抑制作用外，还可以利用下列两种动力学方法来加鉴别。 方法1方法2一 概念二 抑制程度的表示三 抑制作用的分类四 抑制作用的动力学方法鉴别1. 失活作用2. 抑制作用3. 去激活作用4. 阻遏作用1 不可逆抑制作用2 可逆抑制作用1 相对活力分数2 相对活

11、力百分数3 抑制分数4 抑制百分数四、可逆抑制作用竞争性抑制作用反竞争性抑制非竞争性其他可逆抑制1 竞争性抑制作用竞争性抑制作用的含义竞争性抑制作用的机理竞争性抑制作用举例过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂1）.竞争性抑制作用的含义2）. 竞争性抑制作用的机理竞争性抑制的机理1 抑制剂与底物在结构上有类似之处2 可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，从而阻断了底物和酶的结合3 降低酶和底物的亲和力。3）竞争性抑制作用举例举例某些药物或体内代谢物对酶的竞争性抑制作用 药物（抑制剂）药物（抑制剂）被抑制的酶被抑制的酶竞争底物竞争底物临床应用及机理临床应用及机理磺胺药二氢叶酸合成酶（细菌）苯甲酸

12、抗菌作用（抑制四氢叶酸）氨基蝶呤二氢叶酸还原酶二氢叶酸抗白血病5-氟尿嘧啶（5-FU）尿嘧啶核苷磷酸化酶（胸腺嘧啶核苷磷酸化酶）尿嘧啶（胸腺嘧啶）抗癌作用（抑制核苷酸合成）别嘌呤醇黄嘌呤氧化酶黄嘌呤，次黄嘌呤抗通风（抑制尿酸生成）6-氨基已酸纤溶酶-赖氨酸-氨基酰止血，抗纤溶（抑制纤溶酶）苯丙胺（麻黄素）单胺氧化酶肾上腺素（去甲肾上腺素）中枢兴奋，抗哮喘4）过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂所谓过渡态底物是指底物和酶结合成中间复合体后被活化的过渡形式，一般用S*表示，由于其能障小，和酶结合就紧密得多。4）过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂4）过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂2. 反竞争性抑制2.

13、反竞争性抑制举例2举例：单底物酶：如芳香基硫酸基的肼解 氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用多底物：如双底物乒乓机制中，任何一个底物的竞争性抑制剂也是另一底物的反竞争性抑制剂。 3. 非竞争性抑制Ki=Ki2. 非竞争性抑制举例4混合型抑制 5 其他可逆抑制部分抑制底物抑制产物抑制1）部分抑制1 部分抑制：假如混合型抑制中ESI复合物也能释放产物即为部分抑制。 2）底物抑制3）产物抑制3 产物抑制：产物对酶反应的抑制作用在生物体中较为常见，在细胞内，酶反应的产物虽然不断被另外的酶作用，但S和P总是同时存在的，因此，考虑产物对反应速度的影响，可能具有一定的意义。竞争性抑制作用反竞争性抑制非竞争性抑制混合

14、型抑制其他可逆抑制1竞争性抑制的含义2竞争性抑制的机理3竞争性抑制举例4过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂1概念2举例1 部分抑制2 底物抑制3 产物抑制五、不可逆抑制作用不可逆作用可分为非专一性专一性1. 非专一性的不可逆抑制作用概念：抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应。类型：酰化剂、烃基化剂、含活泼双键的试剂、 亲电试剂、 氧化剂、 还原剂2.专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂的类型:Ks型结合型不可逆抑制剂Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀底物）1）Ks型结合型专一性不可逆抑制剂抑制剂只能专一地与某种酶结合而引起的不可逆抑制作用举例：1 对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮抑制胰凝乳蛋白酶 2

15、 对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮抑制胰蛋白酶 2） Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀底物）抑制剂能专一地与某种酶结合并发生催化反应，而反应的产物中含有一个基团可以与酶分子活性中心的基团共价结合，导致酶分子不可逆地丧失催化活性。Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）（1） 天然酶的自杀底物（2） 治疗用人工合成的酶自杀底物（1） 天然酶的自杀底物Ackee(Blighia sapida) 植物未成熟果实的假种皮中含有一种有毒的降糖氨酸（即甲叉环丙基丙氨酸）（2） 治疗用人工合成的酶自杀底物治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿瘤治疗上；治疗震颠麻痹症；痛风症的自杀底物疗法。非专一性的不可逆抑制作用专

16、一性不可逆抑制剂的类型酰化剂烃基化剂含活泼双键的试剂亲电试剂氧化剂还原剂Ks型专一性不可逆抑制剂Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）六、 酶抑制剂的应用医学上的应用农业生产上的应用工业生产上应用 1、 医学上的应用 青霉素类药物长期使用青霉素，细菌中产生-内酰胺酶，可水解青霉素中的内酰胺环，使之成为不杀菌的青霉酸酰。（不能形成D-丙氨酸-D-丙氨酸结构，丧失了杀菌能力）1 青霉素类药物1 青霉素类药物两者结构类似，故可竞争性地抑制转肽酶，导致胞壁合成障碍。传统化学法生产内酰胺抗生素路线 图 1.1 传统化学法生产内酰胺抗生素路线Figure 1.1. An overview of the tra

17、ditional, chemical synthesis of -lactam antibiotics 酶法生产-内酰胺类抗生素路线图 图图 1.2 酶法生产酶法生产-内酰胺类抗生素路线图内酰胺类抗生素路线图Figure 1.2. The network of enzymatic modification of -lactam antibioticsPGA for penecillin G acylase; 6-APA for 6-aminopenicillinic acid; 7-ADCA for 7- aminodeacetoxi-cephalospornic acid; 7-ACA fo

18、r 7-aminocephalospornic acid青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的合成与后加工 图图1.3 青霉素青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的合成与后加工酰化酶在大肠杆菌中的合成与后加工Fig. 1.3 Synthesis and maturation of penicillin G acylase in E. coli.：The pac gene from E. coli encodes a polypeptide precursor (preproPAC) which is composed of, in the direction of N-terminus to C-terminus

19、, a signal peptide (S), subunit (), connecting peptide (C), and subunit (). 青霉素酰化酶的三维结构图图图 1.4 青霉素酰化酶的三维结构图青霉素酰化酶的三维结构图Figure 1.4. The three-dimensional structure of penicillin acylaseMOLSCRIPT representation of the heterodimer. The A chain is shown in red wrapped aroud the B chain (blue)。（Duggleby,

20、 H.J. Nature, 1995, (373):264-268）.青霉素酰化酶的结构不同来源的青霉素酰化酶都有，两个亚基组成，亚基的分子量在24k左右，亚基的分子量在65k左右。E. coli来源的PGA结构基因全长2538个核苷酸，编码846个氨基酸组成的前体蛋白，包括26个氨基酸组成的信号肽，209个氨基酸组成的亚基，54个氨基酸组成的连接肽和557个氨基酸组成的亚基。青霉素酰化酶的催化活性中心采用多底物竞争性抑制用X晶体衍射测定了复合物（青霉素酰化酶和底物苯乙酸，3，4二羟基苯乙酸，2，5二羟基苯乙酸，p硝基苯乙酸)的三维结构，这些复合物揭示了底物结合区域构象的变化可能作为酶自催化的

21、开关。显示了催化中心中的Asn B241的作用。PGA活性高度依赖于Asn B241，在催化中心里，B241 Asn导致形成阳离子的洞，包括底物与Ser B1。Arg A263参与了与底物的结合并协助Asn B241的定位。Phe 146是底物进入活性中心的开关，所以准确地说，青霉素酰化酶的催化活性中心是Ser-Asn二联体。 青霉素酰化酶催化机制 图图 1.6 1.6 青霉素酰化酶催化水解青霉素青霉素酰化酶催化水解青霉素G G机理示意图机理示意图Figure 1.6 The mechanics of hydrolysis of penicillin G by penicillin acyla

22、seThe carbonyl carbon atom of the amide bond is attacked by the Ser_1 and aovalent acyl-enzyme is formed through a tetrahedral transition state, which is further stabilized by the H-bonds to Asn_241 and Ala_69. The tetrahedral intermediate then forms a seryl-acyl enzyme and releases the 6-APA. The a

23、cyl enzyme is attacked by water to form a second tetrahedral intermediate by the same mechanism with the interaction of Asn _241 and Ala_69. Finally, this intermediate collapses to release the PAA. Dotted lines represent possible hydrogen bonds 2. 农业生产上的应用 农药杀虫的机理-抑制生物体中的靶酶。例如：有机磷的杀虫原理主要是：胆碱对生物体神经突触后膜上的乙酰胆碱酶（ACHE）的抑制，造成突触间隙乙酰胆碱的积蓄，持续地作用于受体，引起一系列反应使病虫神经过度兴奋而死亡 3. 工业生产上应用 食品加工过程中由于多酚氧化酶的作用，发生酶促褐变，使果蔬类加工食品货架寿期缩短。多酚氧化酶是含铜金属蛋白，因而许多金属螯合剂是其抑制剂。4.应用研究热点 1.转换酶抑制剂的临床应用进展2.HIV蛋白酶抑制剂的研究进展