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1、第六章第六章 蛋白质分子设计蛋白质分子设计一、蛋白质分子设计的目的一、蛋白质分子设计的目的 1. 1.探索蛋白质结构层次之间的相互关系；探索蛋白质结构层次之间的相互关系； 2. 2.探索蛋白质结构，特别是立体探索蛋白质结构，特别是立体结构的形成规律；结构的形成规律； 3. 3.探索蛋白质折叠的分子机理；探索蛋白质折叠的分子机理； 4. 4.为蛋白质结构为蛋白质结构与功能的关系研究提供手段；与功能的关系研究提供手段； 5. 5.改造天然蛋白质的结构，获得符合需要的蛋白质；改造天然蛋白质的结构，获得符合需要的蛋白质； 6. 6.为创造全新的蛋白质奠定基础。为创造全新的蛋白质奠定基础。二、蛋白质分子
2、设计原理二、蛋白质分子设计原理1.1. 内核假设：蛋白质内核中侧链的相互作用决定其独内核假设：蛋白质内核中侧链的相互作用决定其独特的折叠形式。内核是指蛋白质在进化中保守的内部特的折叠形式。内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在通常情况下区域。在通常情况下, ,内核由氢键连接的二级结构单元内核由氢键连接的二级结构单元组成。组成。2.2. 所有蛋白质内部都是密堆积（很少有空穴大到可以所有蛋白质内部都是密堆积（很少有空穴大到可以结合结合1 1个水分子或惰性气体），并且没有重叠。因为：个水分子或惰性气体），并且没有重叠。因为：分子是从内部排出的；原子间的伦敦色散力。分子是从内部排出的；原子间的伦敦色
3、散力。3.3. 所有内部氢键都是最大满足的，包括主链和侧链。所有内部氢键都是最大满足的，包括主链和侧链。4.4. 疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及与不可疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及与不可及的表面。及的表面。5.在金属蛋白质中，配位残基的替换要求满足金属配在金属蛋白质中，配位残基的替换要求满足金属配位几何。在金属周围放置适当数目的蛋白质侧链或位几何。在金属周围放置适当数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角及整体几何。溶剂分子，并符合正确的键长、键角及整体几何。6.对于金属蛋白质，围绕金属中心的第二壳层的相互对于金属蛋白质，围绕金属中心的第二壳层的相互作用是重要的。因为
4、大多数配基含有一个以上的基作用是重要的。因为大多数配基含有一个以上的基团，除与金属离子形成配位键以外的基团之间或与团，除与金属离子形成配位键以外的基团之间或与其他氨基酸侧链之间形成氢键。如组氨酸。其他氨基酸侧链之间形成氢键。如组氨酸。7.最佳的氨基酸侧链几何排列。包括排列顺序、优势最佳的氨基酸侧链几何排列。包括排列顺序、优势构象。构象。8.结构及功能的专一性。这是蛋白质分子设计最困难结构及功能的专一性。这是蛋白质分子设计最困难的问题。的问题。蛋白质分子设计涉及到的重要技术：蛋白质分子设计涉及到的重要技术：1.在蛋白质设计开始之前，要对所要求的活性进行在蛋白质设计开始之前，要对所要求的活性进行筛
5、选。由于真菌与细胞相对容易处理，因此，它筛选。由于真菌与细胞相对容易处理，因此，它们是一个生物活性物质源。们是一个生物活性物质源。2.由于基因工程的发展，真核基因表达技术的发展由于基因工程的发展，真核基因表达技术的发展使动物蛋白质与植物蛋白质的数目迅速增长，又使动物蛋白质与植物蛋白质的数目迅速增长，又增加了新的生物活性物质源。增加了新的生物活性物质源。即：目的基因表达方法的选择与确定。即：目的基因表达方法的选择与确定。3.蛋白质提取与纯化蛋白质提取与纯化后需要进行细致的表征，测定后需要进行细致的表征，测定它们的序列、三维结构、稳定性、生物活性等。它们的序列、三维结构、稳定性、生物活性等。4.专
6、一性突变体专一性突变体是蛋白质设计成败的关键。一些新是蛋白质设计成败的关键。一些新技术，如技术，如PCR及自动化技术的发展使各种类型的及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速、容易。基因工程变得快速、容易。5.计算机模拟技术计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位在蛋白质设计循环中占有重要位置。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或置。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至关重要的。白质工程是至关重要的。但应注意，但应注意，在明确突变位点或蛋白质序列应改在明确突变位点或蛋白质序列应改变的区域
7、后，可以进行定位突变，但要得到具有预变的区域后，可以进行定位突变，但要得到具有预期结构与功能的蛋白质是期结构与功能的蛋白质是极其困难极其困难的，可能需要经的，可能需要经过几轮的循环。过几轮的循环。编码氨基酸编码氨基酸的分类：的分类：非极性氨基酸非极性氨基酸（8 8种）种）：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met和和Pro极性氨基酸极性氨基酸（1212种）：种）：不带电极性氨基酸：不带电极性氨基酸：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和和Gln带电极性氨基酸：带电极性氨基酸：带正电荷极性氨基酸：带正电荷极性氨基酸：Arg、His和和Lys带负电荷极性氨基酸：带负电荷极性
8、氨基酸：Asp和和Glu参考第二章中有关参考第二章中有关20种氨基酸的结构（侧链的不同）！种氨基酸的结构（侧链的不同）！倾向于形成倾向于形成-螺旋的氨基酸：螺旋的氨基酸：对已知蛋白质结构进行大量的分析表明，氨基酸形成对已知蛋白质结构进行大量的分析表明，氨基酸形成-螺螺旋的倾向性不同。旋的倾向性不同。强烈倾向于形成强烈倾向于形成-螺旋的氨基酸有：螺旋的氨基酸有：Ala、Glu、Leu、Lys和和Met。非常不利于形成非常不利于形成-螺旋的氨基酸有：螺旋的氨基酸有：Pro、Gly、Tyr和和Ser。举例：举例：抗菌肽的结构与功能抗菌肽的结构与功能三、蛋白质分子设计的主要途径三、蛋白质分子设计的主要
9、途径包括包括基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计、蛋白质从蛋白质从头设计头设计及及计算蛋白质设计。计算蛋白质设计。计算机模拟计算机模拟基因构建基因构建功能分析功能分析突变蛋白产品突变蛋白产品蛋白质分子设计循环蛋白质分子设计循环科研楼 （一）基于天然蛋白质结构的分子设计（一）基于天然蛋白质结构的分子设计以天然蛋白质的分子结构及功能（稳定性）知识为基础。以天然蛋白质的分子结构及功能（稳定性）知识为基础。（PDB及相关数据库可提供大量参考信息）及相关数据库可提供大量参考信息）首先对其进行不同方式的理论改造，并借助于计算机模拟首先对其进行不同方式的理论改造，并借助于计算机模拟技术，
10、推测其可能的改造后的结构与功能。技术，推测其可能的改造后的结构与功能。然后用基因工程技术或人工合成技术获得这种改造后的新然后用基因工程技术或人工合成技术获得这种改造后的新蛋白质，并用实验的方法测定其结构及功能。蛋白质，并用实验的方法测定其结构及功能。如未达到要求，再重复上述过程，直至满足需要为止。如未达到要求，再重复上述过程，直至满足需要为止。设计目标设计目标解决方法解决方法热稳定性热稳定性引入二硫键；增加氢键数目；改善内部疏水堆引入二硫键；增加氢键数目；改善内部疏水堆积；增加表面盐桥。积；增加表面盐桥。对氧化的稳定性对氧化的稳定性将将CysAla、Ser；MetGln、Val、Ile及及Le
11、uTrpPhe、Tyr。对重金属的稳定性对重金属的稳定性CysAla、Ser；MetGln、Val、Ile及及Leu替代表面羧基。替代表面羧基。pH稳定性稳定性替换表面荷电基团；分子内替换表面荷电基团；分子内His、Cys及及Tyr的置的置换；内离子对的置换。换；内离子对的置换。提高酶学性质提高酶学性质专一性改变；增加逆转数；改变酸碱度。专一性改变；增加逆转数；改变酸碱度。设计目标与解决方法设计目标与解决方法以天然蛋白质结构为基础进行分子设计的具体步骤：以天然蛋白质结构为基础进行分子设计的具体步骤：1.从天然蛋白质的三维结构出发，利用计算机模拟技从天然蛋白质的三维结构出发，利用计算机模拟技术确
12、定突变位点及替换的氨基酸。术确定突变位点及替换的氨基酸。注意的问题：注意的问题：1）应确定对蛋白质折叠敏感的区域，这些区域包括：带）应确定对蛋白质折叠敏感的区域，这些区域包括：带特殊扭角的氨基酸、盐桥和密堆积区等。特殊扭角的氨基酸、盐桥和密堆积区等。内核！内核！2）应确定对功能非常重要的位置，这些可以从结构与功）应确定对功能非常重要的位置，这些可以从结构与功能的关系、生物化学或蛋白质工程实验及结构上考虑。能的关系、生物化学或蛋白质工程实验及结构上考虑。3）应考察其余位置对所希望改变的影响。）应考察其余位置对所希望改变的影响。4）当进行互换或插入）当进行互换或插入/删除残基时，应考虑它们对结构特
13、删除残基时，应考虑它们对结构特征及功能的影响。征及功能的影响。应遵循以下原则：应遵循以下原则：氨基酸侧链的改变不影响氨基酸侧链的改变不影响该主链的折叠，插入删除某些部分不影响表面区域，侧链交该主链的折叠，插入删除某些部分不影响表面区域，侧链交换遵守蛋白质结构保守原则。换遵守蛋白质结构保守原则。 2.利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构。白质结构。3.预测的结构与原始蛋白质结构比较，利用蛋白质结预测的结构与原始蛋白质结构比较，利用蛋白质结构与功能、结构与稳定性的相关知识及理论，预测新构与功能、结构与稳定性的相关知识及理论，预测新蛋白质可
14、能具有的性质。蛋白质可能具有的性质。4.人工合成新设计蛋白或利用基因工程技术表达该蛋人工合成新设计蛋白或利用基因工程技术表达该蛋白质，经分离纯化后，进行系统地鉴定（表征）。白质，经分离纯化后，进行系统地鉴定（表征）。（二）蛋白质从头设计或蛋白质全新设计（二）蛋白质从头设计或蛋白质全新设计以天然蛋白质结构为基础进行的分子设计以天然蛋白质结构为基础进行的分子设计，可以优化蛋白，可以优化蛋白质的活性，改善其药效动力学性质。质的活性，改善其药效动力学性质。那么，人们能否根据自己意愿，设计合成具有全新的结构那么，人们能否根据自己意愿，设计合成具有全新的结构与功能的蛋白质呢？与功能的蛋白质呢？例如：离子通
15、道纳米管，例如：离子通道纳米管，血红素结合蛋白血红素结合蛋白，氧化还原活性，氧化还原活性蛋白，蛋白，DNA结合蛋白等。结合蛋白等。全新蛋白质分子设计全新蛋白质分子设计是另外一种蛋白质工程，即合成具有是另外一种蛋白质工程，即合成具有新的更优良的结构与功能的蛋白质。新的更优良的结构与功能的蛋白质。全新蛋白质分子设计：全新蛋白质分子设计：从头结构设计从头结构设计和和从头功能设计。从头功能设计。1.蛋白质的从头结构设计蛋白质的从头结构设计 设计合成一个全新的蛋白质结构，其设计合成一个全新的蛋白质结构，其中心问题中心问题是设计一是设计一个具有稳定和独特的三维结构的氨基酸序列。个具有稳定和独特的三维结构的
16、氨基酸序列。要使一个序列能够折叠成稳定的三维结构，就必须使设要使一个序列能够折叠成稳定的三维结构，就必须使设计的计的相互作用能相互作用能大于大于构象熵。构象熵。全面了解蛋白质的结构及稳定性的规律是进行蛋白质全全面了解蛋白质的结构及稳定性的规律是进行蛋白质全新分子设计的关键。特别是二级结构的形成规律。目前，许新分子设计的关键。特别是二级结构的形成规律。目前，许多蛋白质的分子设计都是基于对二级结构的认识进行的。多蛋白质的分子设计都是基于对二级结构的认识进行的。（熵熵是一个表示物质系统的有序或无序的物理量。系统的熵是一个表示物质系统的有序或无序的物理量。系统的熵越大，反映了它的无序程度越大，所处的状
17、态越稳定。物质越大，反映了它的无序程度越大，所处的状态越稳定。物质系统自发的变化过程总是向熵增大的方向进行。系统自发的变化过程总是向熵增大的方向进行。）蛋白质的超二级结构示意图蛋白质的超二级结构示意图a.组合组合b.组合组合c.组合组合A:；B:x；C:；D、E:单双向单双向-折叠；折叠；F：-迂回；迂回；G：回型拓扑结构。回型拓扑结构。左为左为PrPC；右为右为PrPSC具体方法有：具体方法有： 1.1.二级结构单元的自组装二级结构单元的自组装 优点：优点：设计简单；容易合成。设计简单；容易合成。 问题：问题：稳定性差；结构的简单重复。稳定性差；结构的简单重复。2.2.配体诱导组装配体诱导组
18、装 可利用与配体如金属离子结合的特点，诱导多个二级结可利用与配体如金属离子结合的特点，诱导多个二级结构如双亲构如双亲-螺旋自组装。螺旋自组装。3.3.通过共价交叉连接实现肽的自组装通过共价交叉连接实现肽的自组装 利用二硫键或其他方式将几个二级结构进行预连接，以利用二硫键或其他方式将几个二级结构进行预连接，以降低构象熵。降低构象熵。4.基于组合库的全新蛋白质分子设计基于组合库的全新蛋白质分子设计利用组合库技术已在如下方面取得成功：利用组合库技术已在如下方面取得成功：-螺旋；螺旋；-折折叠片；单体；自组装为有序的排列；堆积为天然类蛋白；超叠片；单体；自组装为有序的排列；堆积为天然类蛋白；超热稳定性
19、；结合辅因子的能力；催化活性。热稳定性；结合辅因子的能力；催化活性。5.在合成模板上肽的组装在合成模板上肽的组装6.线性多肽折叠为球状结构线性多肽折叠为球状结构2.蛋白质功能的从头设计蛋白质功能的从头设计1）通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能；通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能；在以下方面已取得成功：在以下方面已取得成功：DNA结合专一性；改变结合专一性；改变辅因子的专一性；改变底物的专一性（抗体酶）辅因子的专一性；改变底物的专一性（抗体酶）2）键合及催化的从头设计；键合及催化的从头设计；3）在全新蛋白质中引入结合位点；在全新蛋白质中引入结合位点；4）催化活性蛋白质的设计；催化活性蛋白质的设计
20、；5）膜蛋白及离子通道的设计；膜蛋白及离子通道的设计；6）新材料的设计。新材料的设计。（三）计算蛋白质设计（三）计算蛋白质设计蛋白质设计是一个理论与实验之间的循环。这蛋白质设计是一个理论与实验之间的循环。这个循环已经在蛋白质的合理设计中得到了许多重要个循环已经在蛋白质的合理设计中得到了许多重要进展。进展。计算蛋白质设计包括能量表达、能量优化、侧计算蛋白质设计包括能量表达、能量优化、侧链构象的离散化、残基分类链构象的离散化、残基分类(内核、表面、边界内核、表面、边界)、功能位点设计、专一性、稳定性及序列空间的稳健功能位点设计、专一性、稳定性及序列空间的稳健性预测等方面内容。性预测等方面内容。四、
21、蛋白质分子设计中的结构与功能关系研究四、蛋白质分子设计中的结构与功能关系研究1.根据结构信息确定突变的残基根据结构信息确定突变的残基利用利用NMR或或X-ray技术解析蛋白质的空间结构信息，据此技术解析蛋白质的空间结构信息，据此确定突变的碱基。确定突变的碱基。2.功能残基的鉴定方法功能残基的鉴定方法1）随机突变法随机突变法2）插入或删除分析法插入或删除分析法3）接头接头(linker)(linker)扫描突变法扫描突变法4）利用蛋白质同源性鉴定功能残基利用蛋白质同源性鉴定功能残基结构与功能的容忍度结构与功能的容忍度蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构蛋白质结构及功能对残基的替换有
22、一定的容忍度，即结构与功能的关系有一定的稳健度。与功能的关系有一定的稳健度。例如：例如：Fersht等替换了等替换了Barnase的所有内核残基。结果表明，的所有内核残基。结果表明，23的突变体保留了酶的活性。的突变体保留了酶的活性。Mathews等在溶菌酶内核中替换多至等在溶菌酶内核中替换多至10个残基。实验证明个残基。实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠。多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠。这些结果说明不同的氨基酸序列具有相近的设计结构。这些结果说明不同的氨基酸序列具有相近的设计结构。五、蛋白质工程的基本问题与困难五、蛋白质工程的基本问题与困难一）改变蛋白质结构的基本途径一）改变
23、蛋白质结构的基本途径1.以同源蛋白为模型推测突变体蛋白的空间构象。以同源蛋白为模型推测突变体蛋白的空间构象。2.突变一系列有结构倾向的氨基酸以改变蛋白质结构类型。突变一系列有结构倾向的氨基酸以改变蛋白质结构类型。3.从热力学第一定律出发设计蛋白质结构。从热力学第一定律出发设计蛋白质结构。二）增加蛋白质稳定性的基本途径二）增加蛋白质稳定性的基本途径1.降低折叠与非折叠的熵差。降低折叠与非折叠的熵差。2.稳定稳定-螺旋。螺旋。3.填充疏水内核。填充疏水内核。三）蛋白质工程的基本困难三）蛋白质工程的基本困难与与生生物物体体内内蛋蛋白白质质的的形形成成过过程程相相比比较较，蛋蛋白白质质工工程程是是一一
24、个个反反向向分分子子生生物物学学过过程程。在在这这一一过过程程中中，最最基基本本的的问问题题是是：按按期期望望的的结结构构寻寻求求最最适适氨氨基基酸酸序序列列。要要做做到到这这一一点点，就就要要求求有有先先进进的的计计算算机机程程序序，它它能能够够模模拟拟细细胞胞内内或或体体外外氨氨基基酸酸多多肽肽链链折折叠叠成成三三维维结结构构的精确过程。但这是一个目前还没有解决的基本问题。的精确过程。但这是一个目前还没有解决的基本问题。分子生物学过程分子生物学过程transcriptiontranslationfoldingDNAmRNApolypeptides3D-structurefunctionsynthesismoleculardesign蛋白质工程过程蛋白质工程过程不疾学而能为魁士名人者，未之尝有也！不疾学而能为魁士名人者，未之尝有也！-吕氏春秋劝学吕氏春秋劝学在科学的道路上，只有丰碑，没有路标！在科学的道路上，只有丰碑，没有路标！-爱因斯坦爱因斯坦凡事之本，必先治身！凡事之本，必先治身！-吕氏春秋先己吕氏春秋先己衣带渐宽终不悔，衣带渐宽终不悔，为为伊伊消得人憔悴。消得人憔悴。柳永（宋）柳永（宋）知识知识+ +智慧智慧+ +机遇机遇+ +健康健康+ +奋斗奋斗 成功成功! !伊伊新解：科学新解：科学
