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1、实验六细胞核的分离与核酸的鉴定Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望 1.1.掌握离心技术的原理及离心机的使用；掌握离心技术的原理及离心机的使用；2.2.熟悉提取分离细胞核、细胞质的方法；熟悉提取分离细胞核、细胞质的方法；3.3.熟悉鉴定核酸的方法；熟悉鉴定核酸的方法； 一、分离细胞质与细胞核一、分离细胞质与细胞核 . .破碎细胞破碎细胞细胞破碎的方法细胞破碎的方法机械法机械法高速组织捣碎机高速组织捣碎机玻璃匀浆器玻璃匀浆器研钵研钵物理法物理法超声匀浆器超声匀浆器冻融法冻融
2、法化学法化学法自溶法自溶法酶处理酶处理表面活性剂处理法表面活性剂处理法 利用各细胞器在一定介质中的利用各细胞器在一定介质中的沉降速度的差沉降速度的差异异，可采取离心的方法，将细胞器分离出来。，可采取离心的方法，将细胞器分离出来。.离心技术离心技术 细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。 离离 心心 方方 法法差速沉降离心法差速沉降离心法 速率区带离心法速率区带离心法等密度区带离心法等密度区带离心法密度梯度区密度梯度区带离心法带离心法 差速沉降离心法差速沉降离心法(differentia
3、l centrifugation) 采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。间下分批分离的方法。 加速加速 低速低速高速高速 差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差较大（一般为差较大（一般为1010倍）的颗粒。倍）的颗粒。缺点：缺点：分离效果差，不能一次得到纯颗粒；分离效果差，不能一次得到纯颗粒； 壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高 时，在离心管一
4、侧会出现沉淀；时，在离心管一侧会出现沉淀； 颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗 粒变形、聚集而失活。粒变形、聚集而失活。每种纯样品成份在介质溶液中的沉降速度可以表为：每种纯样品成份在介质溶液中的沉降速度可以表为： V=d218(-s)2r。V V： 是某一时刻样品的沉降速度（厘米是某一时刻样品的沉降速度（厘米/ /秒）；秒）；d d： 样品颗粒的直径（厘米）；样品颗粒的直径（厘米）；：样品颗粒的密度（克：样品颗粒的密度（克/ /厘米厘米3 3）；）；s s： 介质溶液的密度（克介质溶液的密度（克/ /厘米厘米3 3）；）；：介质溶液的粘性系数（
5、克：介质溶液的粘性系数（克/ /厘米厘米秒）；秒）；：离心机重轴的旋转角速度（：离心机重轴的旋转角速度（1/1/秒），秒），=2N60=2N60，N N：转：转/ /分；分； r r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）；：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）；密度梯度离心法的理论依据密度梯度离心法的理论依据 待分样品的沉浮行为如何确定？待分样品的沉浮行为如何确定？当当S时时 V0即样品顺离心力方向沉降即样品顺离心力方向沉降S时时 V0即样品逆离心力方向上浮即样品逆离心力方向上浮=S时时 V=0即样品停止沉降或上浮，即样品停止沉降或上浮，“稳定稳定”在在这一位置
6、这一位置用这个公式可以很好地解释在速率区带离心法或用这个公式可以很好地解释在速率区带离心法或等密度区带离心法中单一样品的沉降（或上浮）等密度区带离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。行为。 速率区带离心法速率区带离心法 人为地加入不同密度的活性物质，形成一个较为平缓的人为地加入不同密度的活性物质，形成一个较为平缓的介质梯度，将样品加在介质中进行离心，在一定的离心力下介质梯度，将样品加在介质中进行离心，在一定的离心力下根据颗粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，根据颗粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。形成不同区带的分离方法。 此法用于分离具有一定沉
7、此法用于分离具有一定沉降速度差的颗粒降速度差的颗粒（沉降速度差沉降速度差为为20% 或更少）或更少）或分子量相差或分子量相差3倍的蛋白质倍的蛋白质。适用于分离密适用于分离密度相似而大小有别的样品。度相似而大小有别的样品。 样品在密度较高、密度梯度较为陡峭的介质溶液中样品在密度较高、密度梯度较为陡峭的介质溶液中进行离心，具有不同密度的颗粒向上浮起，一直移动进行离心，具有不同密度的颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是形成几条不同的区带，这就是等密度区带离心法。等密度区带离心法。 等密度区带离心法
8、等密度区带离心法此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。优点：优点：a. 分离效果好，可一次获得较纯颗粒。分离效果好，可一次获得较纯颗粒。 b. 适应范围广适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降能象差速离心法一样分离具有沉降 系数差的颗粒系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒。又能分离有一定浮力密度差的颗粒。 c. 颗粒不会挤压变形。颗粒不会挤压变形。缺点：缺点：a.离心时间较长；离心时间较长； b.需要制备梯度；操作严格，不易掌握。需要制备梯度；操作严格，不易掌握。 密度梯度区带离心法密度梯度区带离心法(density gradient
9、centrifugation) 1 1、核酸的种类及其分布、核酸的种类及其分布请思考？请思考？ DNA、RNA在细胞中的分布：在细胞中的分布：DNA胞核内胞核内(98%)胞质内胞质内(2%)RNA胞核内胞核内(10%)胞质内胞质内(90%) 核酸的种类：核酸的种类： DNA、RNA结论：结论：DNA主要存在于细胞核，主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。主要存在于细胞质。二、核酸的鉴定二、核酸的鉴定 2、核酸的水解、核酸的水解核核 酸酸 核苷酸核苷酸 磷磷 酸酸 碱碱 基基 戊戊 糖糖 定糖法（戊糖的差异）定糖法（戊糖的差异）（1 1）核糖核酸的鉴定）核糖核酸的鉴定浓浓HClHCl 3H
10、3H2 2O O+ + D核糖核糖 糠醛糠醛 糠醛糠醛 3，5二羟基甲苯二羟基甲苯 绿色化合物绿色化合物 RNA水解水解 D核糖核糖 （2）脱氧核糖核酸的鉴定）脱氧核糖核酸的鉴定 DNA水解水解 D脱氧核糖脱氧核糖-H-H2 2O O硫酸硫酸硫酸硫酸 脱氧核糖脱氧核糖 羟基羟基酮基戊醛酮基戊醛蓝色化合物蓝色化合物蓝色化合物蓝色化合物（1）分离细胞质与细胞核）分离细胞质与细胞核（1）分离细胞质与细胞核）分离细胞质与细胞核（2） 核酸的鉴定核酸的鉴定0.5g肝组织肝组织 少许石英砂研磨少许石英砂研磨加加5ml的的1.5%柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤 肝匀浆，倾入离心
11、管肝匀浆，倾入离心管离心：离心：3000r/min；10上层液上层液沉淀沉淀加入加入1ml 0.25mol/L 蔗糖柠檬酸溶液蔗糖柠檬酸溶液 核悬液核悬液沿壁缓铺于沿壁缓铺于8ml 0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上蔗糖柠檬酸液面上离心：离心：2000r/min；5上层液（弃去）上层液（弃去）沉淀沉淀核洗液核洗液5ml洗涤沉淀，离心：洗涤沉淀，离心：2000r/min，5 上层液（弃去）上层液（弃去）沉沉 淀淀初步纯化的细胞核初步纯化的细胞核 5ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核溶解细胞核待测样品待测样品鉴定鉴定 实实 验验 流流 程程 图图 编编 号号12细细胞胞质质（滴）（滴）2
12、0-核液（滴）核液（滴）-201mol/LKOH（滴）（滴）20202鉴定：取试管三支，编号，按下表操作鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 编编号号123细细胞胞质质水解液（滴）水解液（滴）20-核液水解液（滴）核液水解液（滴）-20-5三三氯氯醋酸（滴）醋酸（滴）1010303,5一二一二羟羟基甲苯液（滴）基甲苯液（滴）3030301.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：水解：取离心管二支，编号，按下表操作：（2） 核糖核酸的鉴定核糖核酸的鉴定混合各管混合各管沸水浴沸水浴(10)冷却冷却加入加入5%三氯三氯醋酸醋酸 (8ml)搅匀后离心搅匀后离心 2000r/min；5上清液上清液 立即
13、混合各管立即混合各管沸水浴沸水浴(10)冷却冷却比较各管颜色比较各管颜色 2鉴定：取试管三支，编号，按下表操作鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:1.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：水解：取离心管二支，编号，按下表操作：编编号号12细细胞胞质质（滴）（滴）20-核液（滴）核液（滴）-201mol/L过氯过氯酸酸(滴）滴）2020 编编号号123细细胞胞质质水解液（滴）水解液（滴）20-核水解液（滴）核水解液（滴）-20-1mol/L过氯过氯酸（滴）酸（滴）20二苯胺二苯胺试剂试剂（滴）（滴）202020（3）脱氧核糖核酸的鉴定）脱氧核糖核酸的鉴定混合各管混合各管冷却冷却离心离心 上清液上
14、清液 立即混合各管立即混合各管冷却冷却比较各管颜色比较各管颜色 2000r/min;5表表1.核糖核酸的鉴定核糖核酸的鉴定试管编号试管编号123现象现象试管编号试管编号123现象现象表表2.脱氧核糖核酸的鉴定脱氧核糖核酸的鉴定1规范操作，防止滴管、试剂的污染。规范操作，防止滴管、试剂的污染。2.细核悬液的平铺要轻柔；细核悬液的平铺要轻柔；3.浓酸的取用要小心；浓酸的取用要小心；4.使用离心机注意平衡，转速从低到高；使用离心机注意平衡，转速从低到高；思思 考考1. 本实验结束后若想继续测定肝脏中本实验结束后若想继续测定肝脏中DNA、RNA的含的含 量，可用什么方法？量，可用什么方法？ 2. 我们
15、已经学习了电泳法和层析法来分离蛋白质，请问我们已经学习了电泳法和层析法来分离蛋白质，请问 我们是否可以用这两种方法分离我们是否可以用这两种方法分离DNA、RNA？若能，请？若能，请简单叙述其原理。简单叙述其原理。实验七实验七 血糖测定（葡萄糖氧化酶血糖测定（葡萄糖氧化酶-过氧化物酶过氧化物酶法）及肾上腺素对血糖浓度的影响法）及肾上腺素对血糖浓度的影响1.血糖的来源与去路？血糖的来源与去路？2.激素对血糖的调节？激素对血糖的调节？3.什么是高血糖、低血糖，尿糖？什么是高血糖、低血糖，尿糖？4.实验原理及操作步骤。实验原理及操作步骤。下次实验预习内容下次实验预习内容生物化学设计性实验安排生物化学设
16、计性实验安排经讨论决定，本学期第八次实验是设计性实验设计性实验，也作为实验考核内容，占实验总实验总成绩的成绩的30%（共（共9分）分）。一.内容：牛血清白蛋白的提取与鉴定二.设计方案的要求和时间：要求每大组每大组1份份，写明实验目的、实验原理、操作步骤或流程、仪器和试剂、预测结果、参考文献或资料等项目。于第七次试验前完成，第七次实验时交给相应实第七次实验时交给相应实验室的实验教师验室的实验教师。实验设计成绩4分（科学合理3分、可操作性1分）三.实验实施的时间和要求：按最后一次实验的时间安排，分班按课程表进行实验，要求每人独立完成实验操作并当堂完成实验报告每人独立完成实验操作并当堂完成实验报告。实验操作成绩3分（基本操作1分、试剂盘整理有序1分、实验环境卫生1分）实验报告成绩2分（目的原理0.5分、操作流程0.5分、结果0.5分、分析讨论0.5分） 生物化学实验室 2010年11月15日
