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1、结直肠癌的基因检测结直肠癌的基因检测 2000年4月16日，梅艳芳姐姐梅爱芳因子子宫颈癌癌病逝，终年41岁。2003年12月30日，梅艳芳因子子宫颈癌癌病逝，终年40岁。2015年3月11日，梅艳芳二哥梅德明因喉癌喉癌病逝，终年62岁。基因检测朱莉（2013）曾检查出BRCA1基因缺陷，意味着她拥有87%和50%的几率罹患乳癌和卵巢癌，再加上拥有癌症家族史，她的母亲就曾被查出患有乳癌，并最终死于卵巢癌。朱莉当年实施双侧乳腺切除手术，引发全球关注。2015年朱莉又以公开信的形式正式宣告，为了避免患癌，继两年前切除乳腺之后，她又接受了卵巢和输卵管手术基因检测的概念基因：遗传信息基因检测是通过组织、
2、体液或细胞对个体遗传信息进行检测的技术，其检测的信息可以是由DNA、RNA、蛋白质等物质承载。通过不断进步的生物信息学技术手段链接遗传学、表观遗传学、蛋白质组学，不断加深人们对于生命的物质本质的认识。基因检测在结直肠癌诊断治疗中的作用（1）为筛查提供依据（2）尽早诊断（3）为治疗方案提供优化（4）指导用药结直肠癌与基因检测结直肠癌与基因检测基因检测在结直肠癌诊断治疗中的作用（1）评估遗传风险（2）评估化药的疗效及副作用（3）指导靶向药物使用（4）指导免疫治疗结直肠癌基因检测与遗传风险评估发病前十位恶性肿瘤数据结直肠癌遗传风险评估风险评估/遗传咨询国家癌症中心调查数据显示，2015年全国预计新增
3、大肠癌376300例，死亡191000例，均位居第五（ Cancer statistics in China,2015,CA-CancerJClin.2017）。大部分大肠癌呈散发，但家族性肿瘤综合征在肠癌中也很常见。估计约有10-30%的患者具有家族聚集现象，其中5-6%与研究较为明确的多种遗传综合征明确相关-详细的家族史-详细的医学和手术治疗史-相关的表现进行直接检查-风险咨询-教育支持-遗传检测讨论-知情同意遗传学特点连续（或间断）几代中发生大肠癌（垂直遗传）男女遗传度相等，即一级亲属携带几率为50%患者及亲属相关器官的肿瘤易感性提高发病年龄早多处原发癌遗传综合征 相关基因受影响器官结直
4、肠 卵巢 乳腺子宫胃胰腺其他林奇综合征MLH1MSH2MSH6PMS2EPCAM家族性腺瘤息肉病APCMUTYH相关息肉病MUTYH错构瘤综合征PTEN黑斑息肉综合征STK11李法美尼综合征TP53幼年息肉综合征SMAD4BMPR1A为什么要关注遗传性大肠癌一、重视度低、知名度低二、遗传性结直肠癌并不罕见-10%-25%结直肠癌患者有家族史-近10%患者有明确致病基因三、临床表现复杂：表现为综合征-相同表型不同基因型-相同基因型不同表型NCCN指南建议：1、大约20%的结直肠癌伴有家族聚集性，新诊断的腺瘤或浸润性癌患者，其一级亲属患结直肠癌的风险增加。2、对于遗传性结直肠癌，要求患者通常在进行
5、基因测序前进行2轮的筛选：首先基于家族史，其次是对肿瘤组织进行初始检测。3、为了甄别那些可能属于遗传性结直肠癌的患者，可以对结直肠癌标本进行2项初始检测：免疫组织化学检测错配修复蛋白表达(MMR)；分析微卫星不稳定性(MSI)。为什么要关注遗传性大肠癌Lynch综合征Lynch综合征（林奇综合征），又称遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC），占结直肠癌患者2-4%，一种呈常染色体显性遗传的家族性肿瘤综合征，主要由错配修复基因（mismatchrepairgene，MMR）缺失引起(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM），hMLH1和hMSH2突变约占检出的种系突变的90，hMSH
6、6突变约占7-10，hPMS2突变占不到5。患者患者MMR基因缺失，主要是由基因突基因缺失，主要是由基因突变或启或启动子甲基化引起子甲基化引起，其中MLH1和MSH2基因突变占所有基因改变的90以上。MMR基因突变或启动子甲基化可导致MMR基因功能缺失，从而引起含有错配碱基、核苷酸插入或缺失的DNA分子不能正常修复，最终引起广泛的MSI。MMR蛋白IHC结果判读标准IHC结果MMRMSIMLH1或MSH2蛋白缺失dMMRMSI-H正常的蛋白表达pMMRMSI-L/MSSLynch综合征dMMR：MMR基因缺失；pMMR：MMR基因正常；MSI-H：高度微卫星不稳定；MSI-L：低度微卫星不稳定
7、；MSS：微卫星稳定。微卫星不稳定性（MSI）是指DNA甲基化或者基因突变致错配修复基因缺失，从而导致微卫星重复序列插入或缺失，继而长度改变，与肿瘤的发生密切相关。约15%的结直肠癌中存在MSI，主要是微卫星序列碱基对的替换和移码突变。散发性肠癌中最常见的就是hMLH1基因启动子区高甲基化，导致MSI的发生。Lynch综合征MSI检测MSI不稳定标记的比例阳性标记数（Bethesda工作组）MSI-H40%2/5MSI-LTp.Thr172Met rs74531854杂合良性多态性PMS2NM_000535.6c.1621AGp.Lys541Glu rs2228006纯合良性多态性PMS2NM
8、_000535.6c.1454CAp.Thr485Lysrs1805323杂合良性多态性MUTYHNM_001128425.1 c.1014GCp.Gln338His rs3219489杂合良性多态性APCNM_000038.5c.5465TAp.Val1822Asp rs459552纯合良性多态性BMPR1ANM_004329.2c.4CAp.Pro2Thrrs11528010杂合良性多态性AXIN2NM_004655.3c.148CTp.Pro50Serrs2240308杂合良性多态性MLH3NM_001040108.1 c.2476AGp.Asn826Asp rs175081纯合良性多态
9、性EPCAMNM_002354.2c.344TCp.Met115Thr rs1126497杂合良性多态性PMS2NM_000535.6c.1408CTp.Pro470Ser rs1805321杂合良性多态性MLH1NM_000249.3c.1151TAp.Val384Asp rs63750447杂合良性多态性MLH3NM_001040108.1 c.2531CTp.Pro844Leu rs175080杂合良性多态性说明：明： 已知致病突已知致病突变，表示该突变在现有的研究报道中与疾病有关，致病机理明确，遗传统计学意义显著，有相关功能验证。疑似致病突疑似致病突变，是指功能预测可能是致病的，但还未
10、有确凿的临床证据。临床意床意义未明未明表示该变异有研究报道，但与关系不明的变异。疑似良性多疑似良性多态性性是指该变异有研究报道是良性的，但还未有确凿的临床证明。良性多良性多态性性是指该变异在临床研究表明不能导致疾病，与疾病没有关系结直肠癌化疗与基因检测大肠癌综合治疗的几种模式传统模式：传统模式： 手术治疗手术治疗手术治疗术后辅助化疗（结肠癌）手术治疗术后辅助化疗（结肠癌）手术术后放化疗（直肠癌）手术术后放化疗（直肠癌）术前新辅助放化疗手术术后辅助化疗术前新辅助放化疗手术术后辅助化疗（直肠癌）（直肠癌）术前新辅助化疗手术治疗术后辅助化术前新辅助化疗手术治疗术后辅助化疗（肠癌肝转移）疗（肠癌肝转移
11、）手术术后辅助化疗手术术后辅助化疗 靶向治疗靶向治疗/免疫治疗免疫治疗（晚期肠癌）（晚期肠癌）CSCO2019大肠癌术后辅助化疗推荐病理分期分层I级推荐II级推荐III级推荐I期T1-2N0M0观察（1A类证据）II期低危（T3N0M0，dMMR）观察（1A类证据）普危（T3N0M0，pMMR且无高危因素）单药氟尿嘧啶化疗（1A类证据）观察高危（T3N0M0/pMMR伴高危因素，或T4N0M0）联合化疗（1A类证据）单药氟尿嘧啶化疗（限pMMR患者）（1B类证据）观察（3类证据）III期T任何N+M0联合化疗（1A类证据）单药氟尿嘧啶化疗（1B类证据）除临床试验外，不推荐在辅助化疗中使用如下药
12、物：伊立替康、替吉奥、TAS-102、所有的靶向药物（包括贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、阿柏西普、瑞戈非尼、呋喹替尼等）和所有的免疫检查点抑制剂（pembrolizumab 和nivolumab 等）分层分层I级推荐II级推荐III级推荐适合强烈治疗（RAS和BRAF均野生型）原发灶位于左侧结直肠FOLFOX/FOLFIRI西妥昔单抗（2A类证据）FOLFOX/CapeOX/FOLFIRI贝伐珠单抗（2A类证据）；FOLFIRI贝伐珠单抗（2A类证据）其他局部治疗（2B类证据）原发灶位于右侧结直肠FOLFOX/CapeOX/FOLFIRI贝伐珠单抗（2A类证据）；FOLFIRI贝伐珠单抗（
13、2A类证据）FOLFIRI西妥昔单抗（2B类证据适合强烈治疗（RAS或BRAF突变型）无FOLFOX/CapeOX/FOLFIRI贝伐珠单抗（2A类证据）；FOLFIRI贝伐珠单抗（2A类证据）其他局部治疗（2B类证据）CSCO2019关于潜在可切除mCRC转化治疗推荐CSCO2019关于mCRC姑息治疗推荐姑息治疗一线分层分层I级推荐II级推荐III级推荐适合强烈治疗（RAS和BRAF均野生型）原发灶位于左侧结直肠FOLFOX/FOLFIRI西妥昔单抗（1A类证据）FOLFOX/CapeOX/FOLFIRI贝伐珠单抗（1A类证据）；FOLFOXIRI贝伐珠单抗（1B类证据）其他局部治疗（2B
14、类证据）原发灶位于右侧结直肠FOLFOX/CapeOX/FOLFIRI贝伐珠单抗（1A类证据）；FOLFIRI贝伐珠单抗（2A类证据）FOLFOXIRI西妥昔单抗（1B类证据）；FOLFOX/FOLFIRI西妥昔单抗（贝伐珠单抗有禁忌者）（2A类证据）CSCO2019关于mCRC姑息治疗推荐姑息治疗一线分层分层I级推荐II级推荐III级推荐不适合强烈治疗（RAS和BRAF均野生型）无氟尿嘧啶类单药贝伐珠单抗(1A类证据）西妥昔单抗单药（左半结直肠）（2B类证据）；减量的两药化疗（FOLFOX/FOLFIRI）西妥昔单抗（2B类证据）；减量的两药化疗（FOLFOX/CapeOX/FOLFIRI)
15、贝伐珠单抗（2B类证据）；免疫检查点抑制剂（PD-1单抗）（MSI-H或dMMR）（2A类证据）其他局部治疗（3类证据）不适合强烈治疗（RAS或BRAF突变型）无氟尿嘧啶类单药贝伐珠单抗(1A类证据）减量的两药化疗（FOLFOX/CapeOX/FOLFIRI)贝伐珠单抗（2B类证据）；免疫检查点抑制剂（PD-1单抗）（MSI-H或dMMR）（2A类证据）其他局部治疗（3类证据）CSCO2019关于mCRC姑息治疗推荐姑息治疗二线分层分层I级推荐II级推荐III级推荐一线接受奥沙利铂治疗（RAS和BRAF均野生型）FOLFIRI靶向药物（西妥昔单抗或贝伐珠单抗）（2A类证据）伊立替康西妥昔单抗（
16、2A类证据）；伊立替康+雷替曲塞（氟尿嘧啶类不能耐受）（2A类证据）；伊立替康+卡培他滨贝伐珠单抗（1B类证据）；免疫检查点抑制剂（PD-1单抗）（MSI-H或dMMR）（2A类证据）其他局部治疗（3类证据）一线接受伊立替康治疗（RAS和BRAF均野生型）FOLFOX靶向药物（西妥昔单抗或贝伐珠单抗）（2A类证据）；CapeOX贝伐珠单抗（1A类证据）伊立替康+西妥昔单抗（2A类证据）；奥沙利铂+雷替曲塞（氟尿嘧啶类不耐受）（2A类证据）；免疫检查点抑制剂（PD-1单抗）（MSI-H或dMMR）（2A类证据）其他局部治疗（3类证据）一线接受奥沙利铂治疗（RAS或BRAF突变型）FOLFIRI贝
17、伐珠单抗（1A类证据）伊立替康贝伐珠单抗（2A类证据）；伊立替康+雷替曲塞（氟尿嘧啶类不能耐受）（2A类证据）；伊立替康+卡培他滨贝伐珠单抗（1B类证据）；免疫检查点抑制剂（PD-1单抗）（MSI-H或dMMR）（2A类证据）其他局部治疗（3类证据）；伊立替康+西妥昔单抗+维莫非尼（RAS野生/BRAFV600E突变）（2B类证据）CSCO2019关于mCRC姑息治疗推荐姑息治疗三线分层I级推荐II级推荐III级推荐已接受过奥沙利铂和伊立替康治疗（RAS和BRAF均野生型）西妥昔单抗伊立替康（之前未行西妥昔单抗治疗）（1A类证据）；瑞戈非尼（1A类证据）；呋喹替尼（1A类证据）临床研究；免疫检
18、查点抑制剂（PD-1单抗）（MSI-H和dMMR）（2A类证据）雷替曲塞（既往未接受此治疗）（3类证据）；最佳支持治疗；其他局部治疗（3类证据）已接受过奥沙利铂和伊立替康治疗（RAS或BRAF突变型）瑞戈非尼（1A类证据）；呋喹替尼（1A类证据）临床研究；免疫检查点抑制剂（PD-1单抗）（MSI-H和dMMR）（2A类证据）雷替曲塞（既往未接受此治疗）（3类证据）；最佳支持治疗；其他局部治疗（3类证据）；伊立替康+西妥昔单抗+维莫非尼（RAS野生/BRAFV600E突变）（2B类证据）大肠癌常见化疗方案CapeOX奥沙利铂130mg/m2IV，第一天*卡培他滨1000 mg/m2，每天两次口服
19、，第114天，随后休息7天每3周重复mFOLFOX6奥沙利铂85mg/m2静脉输注，第1天*LV400mg/m2静脉输注，第1天*5-FU400mg/m2静脉推注，第1天，然后1200mg/m2/d2天持续静脉输注，（总量2400mg/m2，输注4648小时）每2周重复mFOLFOX7奥沙利铂130mg/m2静脉输注，第1天*LV400mg/m2静脉输注，第1天*5-FU1200mg/m2/d2天持续静脉输注（总量2400mg/m2，输注4648小时）每2周重复（NCCN2018指南）大肠癌常见化疗方案FOLFIRI 伊立替康180mg/m2静脉输注大于30-90分钟，第1天LV400mg/m
20、2静脉输注2小时，配合伊立替康注射时间，第1天5-FU400mg/m2静脉推注，第1天，然后1200mg/m2/d2天持续静脉输注（总量2400mg/m2，输注4648小时）每2周重复FOLFOXIRI伊立替康165mg/m2静脉输注，第一天，奥沙利铂85mg/m2静脉输注，第一天，LV400mg/m2第一天，5-FU1600mg/m2/dx2天（总量3200mg/m2大于48小时）从第一天起持续输注每两周重复此处所列5-FU剂量来自于欧洲的研究。有证据表明北美的患者对5-FU的耐受性较差。强烈推荐北美患者采用与FOLFOX或FOLFIRI方案相同的5-FU剂量。（NCCN2018指南）名称分
21、类作用机制对细胞周期敏感半衰期奥沙利铂DNA交联类烷化剂细胞周期非特异性40h5-FUDNA前体嘌呤类似物S期10minS-113h卡培他滨DNA前体嘌呤类似物S期3-4h伊立替康拓扑异构酶抑制剂抑制拓扑异构酶IS期6-12h大肠癌常见化疗方案铂类奥沙立铂毒理：通过产生水化衍生物作用于DNA，形成链内和链间交联，从而抑制DNA的合成，产生细胞毒作用和抗肿瘤活性。铂类药物耐药机制主要包括：DNA修复能力增强药物，解毒增加，减少药物摄取积聚大肠癌化疗与基因检测铂类研究表明ERCC1，XRCC1，和GSTP1基因多态性及mRNA表达与毒副作用与用药效果密切相关ERCC1：DNA切除修复交叉互补基因1
22、，其是核苷酸切除修复(NER)通路中的关键性酶,正常表达是维持修复酶功能的分子基，反应患者对铂类药物敏感性。XRCC1：参与因电离辐射和氧化损伤引起的BER(碱基切除修复途径)和单键断裂修复,对维持基因的稳定性起着关键作用,同时与铂类药物抵抗有关。GSTP1：谷胱甘肽转移酶P1是细胞抗损伤,抗癌变的主要解毒系统，GSTP1基因多态性的存在可引起其表达的相应酶的活性不同,导致解毒功能发生改变,与铂类化疗的疗效密切相关（亦与很多其他化疗药药效相关）大肠癌化疗与基因检测药物基因检测位点检测结果结果解读铂类药物（卡铂、顺铂、奥沙利铂）XRCC1rs1799782T/T药物敏感性高T/C药物敏感性高C/
23、C药物敏感性低rs25487G/G药物敏感性高G/A药物敏感性低A/A药物敏感性低ERCC1rs11615C/C药物敏感性高C/T药物敏感性低T/T药物敏感性低GSTP1rs1695G/G药物敏感性高G/A药物敏感性高A/A药物敏感性低ERCC1mRNA表达水平大肠癌化疗与基因检测氟尿嘧啶类药物5-Fu、卡培他滨、S-1毒理：5-Fu或5-Fu前体进入体内后经代谢，产生5-Fu，在细胞内转化为有效的氟尿嘧啶脱氧核苷酸后，通过阻断脱氧核糖尿苷酸受细胞内胸苷酸合成酶转化为胸苷酸，而干扰DNA、RNA的合成。大肠癌化疗与基因检测氟尿嘧啶类研究表明DPYD，MTHFR、TYMS基因多态性与mRNA表达
24、毒副作用与用药效果密切相关DPYD：二：二氢嘧啶脱脱氢酶基因，基因，编码二二氢嘧啶脱脱氢酶（DPD），其），其为5-Fu代代谢关关键酶MTHFR：亚甲基四氢叶酸还原酶，MTHFR还原5,10-亚甲基四氢叶酸为5-甲基四氢叶酸，前者为胸苷酸重要原料，后者为体内主要甲基供体。TYMS：胸苷酸合酶（TS）是嘧啶核苷酸合成的限速酶，它是5-FU发挥细胞毒作用的目标酶。大肠癌化疗与基因检测药物基因检测位点检测结果结果解读氟尿嘧啶类药物（5-Fu、卡培他滨、S-1）DYPDrs3918290G/G毒副作用弱G/A毒副作用中A/A毒副作用强MTHFRrs1801133T/T药物敏感性高C/T药物敏感性低C/
25、C药物敏感性低TYMSmRNA表达水平大肠癌化疗与基因检测DNA拓扑异构酶抑制剂（喜树生物碱）伊立替康毒理：半合成的喜树碱类可溶性衍生物，在肝脏内能迅速水解为有活性的代谢物SN-38，后者为拓扑异构酶抑制剂，可抑制DNA单链断裂后修复，干扰DNA的复制与转录，导致肿瘤细胞死亡。代谢：SN-38的代谢主要是经尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶家族，特别是肝脏内的UGT1A1灭活为葡萄糖醛酸产物(SN-38G)，然后经胆汁排泄入肠道，在肠道细菌-葡萄糖醛酸酶作用下转换为SN-38，引发肠黏膜损伤；而肠道内的UGT1A1又可再度催化SN-38为SN-38G，解除肠粘膜损害DNA拓扑异构酶抑制剂（喜树生物碱）
26、研究表明UGT1A1基因突变与毒副作用与用药效果密切相关UGT1A1：UGT1A1启启动子不典型子不典型TATA盒区域包含盒区域包含7个个TA重复重复序列，序列，该变异型与异型与UGT1A1表达下降有关，并表达下降有关，并导致伊立替康活致伊立替康活性代性代谢产物物SN-38水平水平显著增加，从而著增加，从而发生腹泻生腹泻/中性粒中性粒细胞胞减少的几率减少的几率显著增加。著增加。UGT1A1*28 rs8175347）突）突变的的杂合合子个体子个体发生生严重不良反重不良反应的的风险较纯合子增加了合子增加了约7倍，因倍，因此建此建议患者在使用伊立替康前先患者在使用伊立替康前先检测UGT1A1基因型
27、，基因型，对UGT1A1纯合子基因型患者合子基因型患者应慎重考慎重考虑给药剂量量大肠癌化疗与基因检测药物基因检测位点检测结果结果解读DNA拓扑异构酶抑制剂（喜树生物碱）（伊立替康）UGT1A1rs8175347TA6/6毒副作用弱TA6/7毒副作用中TA7/7毒副作用强rs4148323G/G毒副作用弱G/A毒副作用强A/A毒副作用强rs35350960C/C毒副作用弱C/A毒副作用中A/A毒副作用强大肠癌化疗与基因检测名称检测基因检测结果意义奥沙利铂顺铂ERCC1XRCC1GSTP1ERCC1、XRCC1评估药物敏感性GSTP1评估药物毒副作用5-FU卡培他滨DPYDMTHFRDPYD评估毒
28、副作用MTHFR评估药物敏感性伊立替康UGT1A1评估毒副作用大肠癌化疗与基因检测病例药物基因检测位点参考值 检测结果临床意义氟尿嘧啶GSTP1rs1695A/AA/G药物疗效升高DPYDrs3918290C/CC/C酶活性正常，毒副反应风险正常卡培他滨DPYDrs3918290C/CC/C酶活性正常，毒副风险正常rs55886062A/AA/A酶活性正常，毒副风险正常伊立替康UGT1A1rs81753476/6TA6/7TA毒副反应风险升高（包括嗜中性白血球减少症、腹泻、乏力）rs4148323G/GG/G中性粒细胞减少症风险正常奥沙利铂ERCC1rs11615A/AA/G药物疗效升高，肾毒
29、风险降低GSTP1rs1695A/AA/G药物疗效升高结直肠癌靶向治疗与基因检测截止2018年10月已经获得FDA批准的结直肠癌靶向及免疫治疗药物列表：贝伐单抗（Avastin），西妥昔单抗（Erbitux），帕尼单抗（Vectibix），ziv-aflibercept（阿柏西普，Zaltrap），瑞戈非尼（Stivarga），Ramucirumab（雷莫芦单抗，Cyramza），Nivolumab（纳武单抗，Opdivo），Ipilimumab（伊匹单抗，Yervoy），呋喹替尼（爱优特）结直肠癌靶向药物药物相关基因西妥昔单抗（Cetuximab）KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、
30、EGFR、PTEN贝伐单抗（Bevacizumab）KDR瑞戈非尼（Regorafenib）RET、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、KIT、PDGFR-、PDGFR-、FGFR1、FGFR2、TIE2、DDR2、TrkA、Eph2A、RAF-1、BRAF、BRAFV600E、SAPK2、PTK5、Ab1和CSF1R呋喹替尼（Fruquintinib）VEGFR表达水平结直肠癌基因突变结直肠癌中常见基因突变30-40%3-5%10-15%15-18%13-19%exon 2：codon 12, 13exon 3/4：codon 61, 117, 146exon 2：codon 12,
31、13 exon 3：codon 61V600Eexons 9 and 20loss of functionHui-Yan Luo ，et al.World J Gastroenterol. Apr 14, 2014; 20(14): 38583874EGFR突变检测表皮生长因子受体（EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR）主要位于细胞膜上，属受体酪氨酸激酶家族。EGFR被配体激活后启动胞内该通路上的信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。EGFR下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/Ra
32、f/MEK/ERK-MAPK通路另一条是PI3K/Akt/mTOR通路。确定为复发或转移性结直肠癌时，推荐检测RAS、BRAF基因状态所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗（Cetuximab）和帕尼单抗（panitumumab）的治疗一些KRAS/NRAS野生型的患者同样无法受益于靶向药物，野生型BRAF对爱必妥/帕尼单抗的有效性是必须的。结直肠癌大约有5-9%的患者发生BRAF突变。EGFR不推荐作为常规检查项目NCCN结直肠癌临床实践指南2015结直肠癌诊疗指南（2015版）结直肠癌KRAS基因突变检测专家共识.中华病理
33、学杂志,2012年;9:635-636.临床意义原发瘤部位对EGFR单抗疗效预测的最强有力证据来自CALGB/SWOG80405研究。该研究结果显示对于全RAS野生型mCRC患者。原发瘤位于右侧（回盲部到肝曲）时，一线治疗接受含贝伐单抗的治疗患者相较西妥昔单抗治疗者，具有更长的OS（HR1.36;95%CI0.93-1.99;p=0.10）；而当原发瘤位于左侧时（脾曲到直肠），接受西妥昔单抗治疗者较贝伐单抗治疗者具有更长的OS（HR=0.77;95%CI0.59-0.99;p=0.04）。与贝伐单抗相比，左半患者接受西妥昔单抗治疗后OS被延长了（39.3月对比32.6月），但在右半患者中却缩短
34、了（13.6月对比29.2月）在49%82%的结直肠癌中存在EGFR的过表达。结直肠癌肿瘤细胞的EGFR检测无论是对西妥昔单抗还是帕尼单抗均无疗效预测价值。来自BOND-1试验的数据表明肿瘤细胞EGFR的免疫组化染色强度与对西妥昔单抗的治疗反应率之间并没有相关性。帕尼单抗的情况也相似。因此，并不推荐常规检测EGFR，也不能依据EGFR检测结果来推荐或排除西妥昔单抗或帕尼单抗的治疗。临床意义（NCCN2018指南）有大量文献表明KRAS基因第二外显子突变预示着对西妥昔单抗及帕尼单抗的治疗无效。近来更多的证据显示KRAS第二外显子以外的突变以及NRAS突变也可以预测对西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗无效
35、。因此，专家组强烈建议对所有转移性结直肠癌患者进行肿瘤组织（原发瘤或转移灶均可）的KRAS/NRAS基因突变检测。已知KRAS/NRAS突变的患者，均不应接受西妥昔单抗或帕尼单抗的治疗，不管单药还是与化疗联合，因为这些患者不但没有机会从治疗中获益，而且还将面临治疗的毒性和费用，得不偿失。临床意义（NCCN2018指南）哺乳动物基因组中普遍存在三种RAS癌基因家族成员：HRAS、KRAS、NRAS，这三种基因编码的蛋白质大约有90%的氨基酸同源序列，分子量均为21kDa，故称为RASp21蛋白，其在功能上与G蛋白相似，可与二磷酸尿苷(GDP)结合为非活性状态KRAS基因是RAS基因家族中三种癌基
36、因的一种，位于12号染色体上，含有4个编码外显子和1个5端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸的RAS蛋白。KRAS是表皮生长因子受体功能信号的下游分子，属膜结合型GTPGDP结合蛋白，通过GTP和GDP的相互转化作用有节制的调节KRAS基因对信号系统的开启和关闭，传递细胞生长分化信号。RAS基因与其靶向药物KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早中期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因状态基本保持一致。当KRAS基因催化活性区突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，导致RAS蛋白不依赖EGFR受体激活而持续活化，造成RAS信号通路的异常活化，影响细胞的生长、增殖和分化，促进细胞的恶性转化
37、，导致细胞增殖失控而癌变。KRAS基因最常见的突变方式为点突变，90的KRAS基因突变位于2号外显子的第12和13密码子位点，另有14为第61和146密码子突变。其中结直肠癌中第12密码子（约82）是最常见的突变位点。一般中国人群样本检测数据G12A高于G12S/C，西方人群相反。RAS基因与其靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗均通过直接抑制EGFR从而发挥抗肿瘤的作用。西妥昔单抗治疗的有效性受其下游基因KRAS状态的影响，突变型的KRAS无需接受上游EGFR信号即能够自动活化该通路并启动下游信号的转导。因此只有KRAS基因野生型的患者才能从抗EGFR的治疗中获益，而突变型的患者则不能。KRAS野生
38、型患者使用西妥昔单克隆抗体和帕尼单克隆抗体治疗效果确切，可显著提高患者的生存率和改善生活状态，建议使用；而KRAS的2号外显子的12号密码子和（或）13号密码子或其他密码子任意突变型患者使用西妥昔单抗和帕尼单克隆抗体抗治疗无效，建议不使用该类药物。临床实践表明，只有50%的野生型KRAS患者对抗EGFR治疗有效，提示EGFR下游信号通路其他分子的激活和变异可能影响了其治疗反应。因此，KRAS基因突变的检测仅用于预测结直肠癌对抗EGFR靶向药物的治疗效果。BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人类尤文肉瘤中发现并克隆确认的一种能转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列。BRAF基因与ARA
39、F、CRAF基因同属RAF家族，命名为鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，位于人染色体7q34，长约190kb，编码783个氨基酸的蛋白，相对分子质量为84436，有CR1、CR2和CR3三个保守区。BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路重要的转导因子，具有功能的编码区由2510对碱基组成，主要通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶来发挥作用，该酶将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡。RAS基因与其下游基因BRAF是位于KRAS下游级联信号通路上的一个重要蛋白，当BRAF基因发生
40、突变后，其编码生成的蛋白产物无需接受上游信号蛋白的活化便始终处于激活状态，启动下游细胞信号转导途径，引起细胞增殖，从而使EGFR抑制剂西妥昔单克隆抗体和帕尼单克隆抗体等疗效减弱或无效。BRAF基因可作为患者预后评价的独立性指标，BRAFV600E突变患者呈现预后更差的趋势。对于KRAS基因野生型但同时具有BRAF基因V600E突变的患者，抗EGFR单克隆抗体靶向药物治疗可能无效。回顾性亚组分析显示，无论BRAF基因V600E是否存在突变，一线治疗采用抗EGFR单克隆抗体联合有效的化疗药物都有可能使患者获益。目前有限的研究数据提示，一线治疗后病情进展的患者，如果存在BRAFV600E突变，使用抗
41、EGFR单克隆抗体的疗效欠佳。RAS基因与其下游基因PIK3CA基因与靶向药物PIK3CA是位于3号染色体上的原癌基因。PIK3CA基因编码的蛋白是PI3Ks的催化亚单位，PI3Ks是一种脂激酶家族，能特异性磷酸化磷脂酰肌醇的3位羟基，产生第二信使肌醇类物质。PI3Ks家族分I型、II型和III型，其中I型又分为IA和IB两个亚型，PIK3CA则是IA型的催化亚单位。PIK3CA基因的突变可以导致PI3Ks的催化活性异常增强，促使细胞发生癌变，与结直肠癌、成胶质细胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌相关。其重要致瘤机制为PI3K/AKT通路是细胞信号传导中一个重要通路，PI3Ks能特异性磷酸化磷脂酰肌醇的
42、3位羟基，产生第二信使肌醇类物质如PIP3，PIP3可促使AKT转移到细胞膜上并被PDK1/PDK2活化，AKT则是PI3K/AKT信号通路中核心因子，异常活化的AKT会导致肿瘤发生。PIK3CA突变约80%发生在螺旋区(Helical)和激酶区(Kinase)这两个热点区域，其中最常见的三个突变是外显子20上的H1047R，外显子9上的E542K和E545K。PIK3CA基因在结直肠癌中的阳性突变率相对较高，约15-20%，且往往与KRAS、NRAS、BRAF发生交叉突变。既往发表的荟萃分析研究结果显示PIK3CA突变的患者相对于野生型的患者化疗客观有效率(ORR)明显降低，并且有较差PFS
43、及OS的趋势。PIK3CA突变的CRC患者使用阿司匹林者能够显著延长总生存时间，而PIK3CA野生型者，则无受益。PIK3CA基因的激活突变可能导致结直肠癌患者对EGFR抗体类药物产生耐药。单克隆抗体帕尼单抗和西妥昔单抗靶向表皮生长因子受体(EGFR)，且已被证明对mCRC有治疗价值。EGFR介导的信号传导涉及两个主要的细胞内级联反应：一方面KRAS激活BRAF，其反过来触发丝裂原活化的蛋白激酶。另一方面，脂质激酶PIK3CA的膜定位抵消PTEN并促进AKT1磷酸化，从而激活平行的细胞内轴。KRAS的构成型激活绕过了相应的信号级联反应，因此携带KRAS突变的mCRC患者在临床上对帕尼单抗或西妥
44、昔单抗治疗具有抗性。研究学者进行了PIK3CA和KRAS的突变分析并评估了110例用抗EGFRmoAbs治疗的mCRC患者中的PTEN蛋白状态。观察到有15例(13.6)患者携带PIK3CA突变，32例患者(29.0)携带KRAS突变。PIK3CA突变与帕尼单抗或西妥昔单抗的临床耐药显着相关，且没有一个突变患者达到客观反应(P=0.038)，当仅分析KRAS野生型肿瘤时，统计学相关性更强(P=0.016)。而PIK3CA突变患者的无进展生存期也显示出更差的临床结果(P=0.035)12。PIK3CA基因与靶向药物PTEN基因 PTEN基因，又称为MMAC1和TEP1。定位于染色体10q23.3
45、，由9个外显子组成，编码由403个氨基酸组成的蛋白质，具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性，是第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，也是继p53和Rb基因之后，与肿瘤发生密切相关的一种抑癌基因，其主要机制因为PTEN是PI3K/Akt通路的主要负调控因子。PTEN蛋白可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展。有证据显示，PTEN蛋白还有协助控制细胞转移、细胞与与周围组织的粘附和血管发生等功能。此外，这种蛋白可能在维持细胞遗传信息的稳定性上具有重要作用。PTEN减少与转移性结肠直肠癌患者，肺癌和可能成胶质细胞瘤患者的抗EGFR治疗耐药性有关KDR基因 全名：Kinaseinsertdomai
46、nreceptor，也叫VEGFR-2（vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，血管内皮生长因子2）位于4号染色体功能：KDR则主要介导内皮细胞的增殖,导致血管通透性的增高,并阻止内皮细胞凋亡,维持内皮细胞的存活,与胚胎期内皮细胞的分化有关KDR与癌症的关系：肿瘤的生长和扩散依赖于血管生成。肿瘤血管生成对于肿瘤的发生、发展、转移及预后具有重要作用,肿瘤血管生成是一系列复杂的调控过程,其中VEGF及其受体发挥着重要作用KDR的生物学效应VEGF主要有三种受体即: VEGFR-1 ( Flt-1) 、VEGFR-2 ( Flk-1 /KDR) 、VEGFR
47、-3。Flt-1主要介导细胞骨架重排引起细胞迁移,并引起单核细胞趋化,与胚胎期内皮细胞形态形成有关; Flk-1 /KDR则主要介导内皮细胞的增殖,导致血管通透性的增高,并阻止内皮细胞凋亡,维持内皮细胞的存活,与胚胎期内皮细胞的分化有关; VEGFR-3的表达与内皮细胞形成静脉或淋巴管有关。大肠癌组织中KDR的表达阳性率显著高于正常大肠组织，Flk-1/KDR在癌巢边缘及坏死组织附近亦成弥漫性分布,纤维腺瘤中VEGF呈阴性或弱阳性表达微卫星不稳定性微卫星是短DNA序列的串联重复序列，在基因组中广泛存在。在肿瘤的整个基因组中，会有些微卫星有很多小的基因突变，导致有些微卫星发生不稳定，这种现象就是
48、微卫星不稳定性（microsatelliteinstability，MSI）。FDA已经批准了2种免疫治疗药物的适应证，正式将MSI作为一种有效的生物标记物（Biomarker）列入到临床实践中：2017年FDA批准了Pembrolizumab应用在成人和儿童，MSI-H或dMMR的，没有其他治疗选择的，不可切除或转移性实体瘤患者。2017年8月，FDA又批准了nivolumab在MSI-H或dMMR结直肠癌中的相似适应证。MSI与结直肠癌的发生发展及5-FU治疗获益密切相关，针对II期结肠癌患者进行的大样本随机临床研究发现，MSI-H患者较MSS或MSI-L患者的预后更好，但MSI-H患者不
49、能从5-FU辅助治疗中获益，而MSS和MSI-L患者可从5-FU辅助治疗中获益。因此，MSI同样可作为预测II期结肠癌患者预后以及是否可从5-FU辅助治疗中获益的指标。- 63 -MMR/MSIMMR：错配修复蛋白通路：错配修复蛋白通路检测方法检测方法IHC： MMR-deficient(dMMR) MMR-proficient(pMMR)PCR：MSI-H(微卫星高度不稳定微卫星高度不稳定) MSI-L(微卫星低度不稳定微卫星低度不稳定) MSS(微卫星稳定微卫星稳定)MMR与与MSI一致率一致率90% dMMR=MSI-H pMMR=MSI-L/MSSPD-1/PD-L1免疫疗法是当前备受
50、瞩目的新一类抗癌免疫疗法，旨在利用人体自身的免疫系统抵御癌症，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路使癌细胞死亡，具有治疗多种类型肿瘤的潜力，有望实质性改善患者总生存期（OS）。NCT01876511研究结果表明，PD-1单抗治疗对MSI-H的mCRC表现出高缓解率。如图：黑线、红线分别代表MSI-H和MSS的患者，无论是从无进展生存期还是总体生存率来看，同样是接受Keytruda治疗的情况下，具有MSI-H特征的比具有MSS(微卫星稳定性)特征的mCRC患者生存期更长。基因名称突变外显子/碱基变化/氨基酸变化突变率(%) 已批准应用的靶向药物针对癌种获益情况KRASExon2c.35GTp.G
51、ly12Val47.26西妥昔单抗/帕尼单抗结直肠癌可能耐药PIK3CAExon10c.1633GAp.Glu545Lys13.04西妥昔单抗/帕尼单抗结直肠癌可能耐药基因检测与肿瘤免疫治疗 调动机体的免疫系机体的免疫系统，增，增强抗抗肿瘤免疫反瘤免疫反应，杀伤肿瘤瘤细胞胞免疫治免疫治疗概念概念 1.传统细胞因子胞因子类药物物 可及性可及性强 抗抗肿瘤作用瘤作用较弱弱 药物使用物使用强度不度不统一一 2.特异性抗体特异性抗体类药物物 临床床验证阶段（大段（大陆） （PD-1、PD-L1、CTLA-4 等）等） 价格高价格高 3.过继性免疫性免疫细胞胞类 限于批准的限于批准的临床研究（大床研究（
52、大陆） （CAR-T、DC、CIK 等）等） 价格昂价格昂贵（境外）（境外）目前免疫治疗的可及性免疫治疗效果预测免疫治疗效果预测 一、遗传学标记肿瘤突变负荷（肿瘤突变负荷（tumormutationburden,tumormutationburden,TMBTMB；tumormutationload,TMLtumormutationload,TML）新抗原（新抗原（neoantigenneoantigen）微卫星不稳定（微卫星不稳定（microsatelliteinstability,microsatelliteinstability,MSIMSI）错配修复（错配修复（mismatchrepa
53、irmismatchrepair，MMRMMR）检测检测检测下一代基因测序（下一代基因测序（NGSNGS）全基因组测序（全基因组测序（WGSWGS）全外显子测序（全外显子测序（WESWES）分析分析分析驱动基因（驱动基因（DrivergeneDrivergene）错配修复基因（错配修复基因（mismatchrepairgenemismatchrepairgene）突变组学（突变组学（mutanomemutanome）突变负荷（突变负荷（TMBTMB）新抗原（新抗原（neoantigenneoantigen）评价评价 dMMRdMMRdMMR pMMRpMMRpMMR MSI-HMSI-HMSI
54、-H MSI-LMSI-LMSI-L TMB-HTMB-HTMB-H TMB-LTMB-LTMB-L根据相关的根据相关的T T细胞类型可将大肠癌分为三种类型细胞类型可将大肠癌分为三种类型分型T细胞浸润免疫学意义MSI状态临床意义炎症性（HotTumor）CD8+T细胞浸润，但为非功能性加速T细胞应答或解除T细胞应答抑制MSI-H更可能对单独PD-L1/PD-1通路抑制剂治疗有响应（5%？）免疫排斥CD8+T细胞积聚，但未有效浸润使T细胞与肿瘤细胞产生关联MSI-L/MSS大部分mCRC肿瘤无T细胞，对PD-L1/PD-1通路抑制剂单独治疗无响应免疫荒漠（ColdTumor）CD8+T细胞在肿瘤
55、及其周边缺失增加抗原特异性T细胞数量或增加抗原递程MSSCTLA-4抑制剂（CTLA4 inhibitor）ipilumimabtremelimumabPD-1抑制剂（PD-1 inhibitor）nivolumabpembrolizumabPD-L1抑制剂（PD-L1 inhibitor）atezolizumabdurvalumabavelumab Lee S. Schwartzberg. Post-ASCO Immunotherapy Highlights 免疫检查点抑制剂免疫检查点抑制剂（ImmunecheckpointinhibitorsImmunecheckpointinhibito
56、rs）展望基因检测将为未来的抗体偶联药物提供用药指导 ctDNA ctDNA（液体活检）（液体活检） 新一代肿瘤标志新一代肿瘤标志ctDNA不仅可以诊断实体肿瘤，而且能够监测治疗反应以及探查微小残留病灶、靶向治疗耐药突变，可能是优选的无创肿瘤筛查方法。 美国斯坦福大学MaximilianDiehn教授ctDNActDNA是一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标志物，适用多种不同是一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标志物，适用多种不同的实体肿瘤的实体肿瘤。未来，广泛的成像和侵入性的组织活检将会被替代，液体活检可能被用于指导癌症治疗决策，以及用于可能尚未成像的肿瘤筛查。美国约
57、翰霍普金斯大学LuisDiaz博士ctDNA(Circulating Tumor DNA)cfDNA（cellfree DNA），或者叫血），或者叫血浆游离游离DNA，是血是血浆中游离存在的中游离存在的DNA，它，它们有的来自于正常有的来自于正常细胞，有的来自于异常胞，有的来自于异常细胞（如胞（如肿瘤瘤细胞），胞），还有部分来自于我有部分来自于我们外部（如病外部（如病 毒毒DNA）。）。人人们发现cfDNA中中 携携带肿瘤特有突瘤特有突变的那一小部的那一小部分分DNA，确确，确确实实是由是由肿瘤瘤细胞胞释放出来的放出来的。这种携种携带了突了突变信息的循信息的循环DNA是是肿瘤的瘤的标志，志，c
58、tDNA的研究的研究终于与于与肿瘤关瘤关联起来。起来。ctDNA来源：来源：1、来自于坏死的、来自于坏死的肿瘤瘤细胞；胞；2、来自、来自于凋亡的于凋亡的肿瘤瘤细胞；胞；3、来自于、来自于肿瘤瘤细胞分泌的外胞分泌的外排体。排体。突突变类型：型：点突点突变（SNV），短的插入缺失），短的插入缺失（InDel），拷），拷贝数数变异（异（CNV），），结构构变异异（SV）等等）等等。发现过程：发现过程：7070年代年代LeonLeon等研究表明癌症患者外周等研究表明癌症患者外周血清血清DNADNA水平大大高于正常人。水平大大高于正常人。19891989年年StrounStroun等发现血液游离等发现血
59、液游离DNADNA具有肿瘤细胞具有肿瘤细胞DNADNA的一些特征。的一些特征。5 5年后研究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到癌年后研究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到癌基因的突变，与原发瘤一致。基因的突变，与原发瘤一致。不同不同肿瘤和分期均可瘤和分期均可释放放ctDNActDNAu发现不同的癌症有不同的癌症有较大的差异大的差异u卵巢癌，卵巢癌，结直直肠癌等几乎能百分之百癌等几乎能百分之百检测到到ctDNAu脑肿瘤的瘤的检出率不到出率不到10%这或或许和和不同不同组织的特性，如血的特性，如血脑屏障有关屏障有关图1：不同癌症的不同癌症的ctDNA检出情况出情况u在几乎所有种在几乎所有种类的癌症中，
60、都的癌症中，都检测到了到了ctDNA所所带有的有的标志性突志性突变u并且并且肿瘤越晚期，病情越瘤越晚期，病情越严重，重，肿瘤的瘤的恶性程度性程度越高，越高， ctDNA特有突特有突变的的频率就越高。率就越高。u一一项针对15种癌症种癌症进行的行的ctDNA测序研究序研究显示，示，分分别有有47%，55%，69%，82%的的I-IV期癌症病人中期癌症病人中能能检测到高于一定到高于一定频率的率的ctDNA突突变；u而另一而另一项使用更高灵敏度使用更高灵敏度测序技序技术的研究的研究则表示，表示，对于于II期以上的病人，均能期以上的病人，均能100%检测到突到突变。图2：不同分期癌症的不同分期癌症的ctDNA检出情况出情况:谢谢！
