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1、五、神五、神经经生物学常用的研究方法生物学常用的研究方法（一）形（一）形态态学方法学方法（二）生理（二）生理药药理学方法理学方法（三）生物化学方法（三）生物化学方法（四）（四）电电生理学方法生理学方法（五）（五）分子生物学方法分子生物学方法（六）（六）脑脑成像（成像（Brainimaging）技）技术术.（一）形（一）形态态学方法学方法1、束路追踪法、束路追踪法2、免疫、免疫组织组织化学法化学法3、原位、原位杂杂交法交法4、受体定位法、受体定位法.束路追踪法束路追踪法研究神研究神经经元之元之间间的的纤维联纤维联系是神系是神经经科学研究科学研究领领域域的一个基本的一个基本问题问题，其研究方法主要
2、有三：，其研究方法主要有三：（1）利用神）利用神经经元元轴浆轴浆运运输现输现象的追踪法，是目前象的追踪法，是目前应应用用最广者；最广者；（2）利用神）利用神经经元胞体受元胞体受损损或或轴轴突离断后突离断后远侧轴远侧轴突的突的变变性，或性，或轴轴突切断后胞体的反突切断后胞体的反应应特性的特性的变变性追踪法；性追踪法；（3）利用某些）利用某些荧荧光染料在神光染料在神经细经细胞胞质质膜膜扩扩散的神散的神经经元元质质膜膜荧荧光追踪法。光追踪法。.（1）轴浆轴浆运运输输追踪法追踪法轴浆轴浆运运输输：神：神经经元有元有长长短不等的短不等的轴轴突，由于突，由于轴轴突内缺突内缺乏参与蛋白乏参与蛋白质质合成的核
3、糖体，所以需要从合成的核糖体，所以需要从细细胞体不断地将胞体不断地将各种成分运各种成分运输输至至轴轴突及其分支以突及其分支以维维持其代持其代谢谢；在神；在神经经末梢末梢释释放的神放的神经肽经肽及合成及合成经经典典递质递质的的酶酶也需在胞体合成；从末也需在胞体合成；从末梢也有影响梢也有影响细细胞代胞代谢谢的物的物质质如神如神经营经营养因子等逆向养因子等逆向传传送至送至胞体。不同物胞体。不同物质质的运的运输输速度不同。速度不同。u顺顺行运行运输输：从胞体向：从胞体向轴轴突及其突及其终终末的运末的运输输。u逆行运逆行运输输：从：从轴轴突及其突及其终终末向胞体的运末向胞体的运输输。.常用方法：常用方法
4、：a辣根辣根过过氧化物氧化物酶酶追踪法追踪法1971年，年，Kristenson和和Olsson首先首先报报道辣根道辣根过过氧化物氧化物酶酶（horseradishperoxidase，HRP）可被神）可被神经经末梢末梢摄摄取，取，经轴浆经轴浆逆行运逆行运输输至神至神经经元胞体，然后用元胞体，然后用组织组织化学方法即可化学方法即可显显示出神示出神经经元的元的轮轮廓，从而廓，从而创创建了建了HRP追踪神追踪神经经元示踪技元示踪技术术，即，即HRP法。法。HRP即可作逆行追踪即可作逆行追踪剂剂使用，也可作使用，也可作顺顺行追踪行追踪剂剂使用。使用。基本步基本步骤骤：将将HRP注射至注射至实验动实验
5、动物中枢核物中枢核团团或周或周围围器官、器官、神神经经的一定部位；存活一定的一定部位；存活一定时间时间后灌注、固定后灌注、固定动动物，取材物，取材作冰作冰冻冻切片；然后用双氧水（切片；然后用双氧水（H2O2）及呈色）及呈色剂剂四甲基四甲基联联苯苯胺（胺（TMD）或二氨基）或二氨基联联苯胺（苯胺（DAB）显显示示HRP反反应产应产物。物。.将将HRP注射于周注射于周围围神神经经感感觉觉末梢末梢或神或神经经干逆向干逆向标记标记背根神背根神经节细经节细胞后，胞后，HRP还还可可进进一步沿背根一步沿背根节节细细胞的中枢突胞的中枢突顺顺向向标记标记其在脊髓其在脊髓的中枢的中枢终终止部位，称作跨止部位，称
6、作跨节标记节标记。.HRP：1.游离游离HRP：通通过过非特异性整体胞非特异性整体胞饮饮的方式被的方式被摄摄入入2.结结合合HRP：通：通过过与与细细胞膜的特异性受体胞膜的特异性受体结结合的介合的介导进导进入神入神经经元元麦芽凝集素（麦芽凝集素（WGA）-HRP霍乱毒素（霍乱毒素（CT）-HRP优优点：灵敏度高，用量点：灵敏度高，用量较较少，少，HRP在胞内降解在胞内降解时间时间明明显显延延长长，能清晰地能清晰地显显示包括示包括细细微分支在内的整个神微分支在内的整个神经经元的全貌。元的全貌。注意：因注意：因为为HRP到达到达预预定部位的定部位的时间时间取决于运取决于运输输速度和距离，运速度和距
7、离，运输输速度因速度因动动物及物及纤维纤维种种类类而异。同而异。同时时HRP被运至胞体后即被送入溶被运至胞体后即被送入溶酶酶体内水解。因此在聚集和降解两个相反的体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过过程中求得最佳存活期必程中求得最佳存活期必须须具体具体测试测试。呈色呈色剂剂：1.二氨基二氨基联联苯胺苯胺(DAB):DAB作作为为供供氢氢体，体，HRP在在H2O2存存在的情况下，能使在的情况下，能使DAB发发生氧化，生成不溶性棕褐色反生氧化，生成不溶性棕褐色反应产应产物沉淀，物沉淀，定位在抗原所在定位在抗原所在处处。2.二二盐盐酸酸联联苯胺苯胺(BDHC)3.邻邻-联联茴香胺茴香胺(OD)4.四
8、甲基四甲基联联苯胺苯胺(TMB)用途：用途：研究研究脏脏器的神器的神经经支配、中枢内核支配、中枢内核团间团间的的联联系等。系等。还还可与免疫可与免疫组织组织化学、化学、电镜电镜技技术术等等结结合。合。.HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat1040.HRP labelling neurons in dLGN40.b荧荧光素追踪法光素追踪法-主要作逆向追踪主要作逆向追踪1977年，荷年，荷兰兰著名神著名神经经解剖学家解剖学家Kuypers及其同事首及其同事首先先发现发现部分部分荧荧光化合物可被神光化合物可被神经纤维经纤维的末梢的末梢摄
9、摄取，并通取，并通过过轴浆轴浆流逆行运流逆行运输输到各自的神到各自的神经经元胞体，切片后在元胞体，切片后在荧荧光光显显微微镜镜下可直接下可直接观观察到察到这这些胞体的定位，从而建立了研究神些胞体的定位，从而建立了研究神经经纤维联纤维联系的系的荧荧光素逆行追踪法。光素逆行追踪法。原原理：理：将将荧荧光物光物质质注射至神注射至神经经元的元的轴轴突分布区突分布区,经经分支分支的末梢吸收后，循的末梢吸收后，循轴轴突逆行突逆行输输送至胞体。在送至胞体。在荧荧光光显显微微镜镜下下可看到胞体内呈可看到胞体内呈现荧现荧光光标记标记物。物。.荧荧光素追踪光素追踪剂剂是一种暴露在一定激是一种暴露在一定激发发波波长
10、长光照下，以一定光照下，以一定发发射波射波长发长发出一定出一定颜颜色色荧荧光的化合物。每一种光的化合物。每一种荧荧光素都有光素都有各自的激各自的激发发波波长长和和发发射波射波长长，不同的，不同的发发射波射波长长决定了决定了这这些些荧荧光素光素发发出的出的荧荧光光颜颜色各异。色各异。不同不同荧荧光素在神光素在神经经元内的元内的标记标记特征不同：特征不同：绝绝大多数大多数标记细标记细胞胞质质，如，如荧荧光金（光金（Furogold，灵敏度，灵敏度高，能高，能较较好好显显示示树树突分支，只突分支，只标记标记胞胞浆浆；在胞体内分解慢，；在胞体内分解慢，甚至在注射后存活甚至在注射后存活2个月个月标记标记
11、强强度仍无明度仍无明显变显变化；比化；比较较耐耐紫外紫外线线的照射，褪色比的照射，褪色比较缓较缓慢；可以慢；可以经经受受许许多多组织组织学染色学染色处处理，因而可以和理，因而可以和HRP、免疫、免疫组织组织化学等化学等结结合使用），合使用），fastbule（固固蓝蓝）等。）等。只有少数只有少数仅标记细仅标记细胞核，如胞核，如nuclearyellow（核黄（核黄）,diamidinoyellow（双（双脒脒基黄）等。基黄）等。.FastbluelabellingneuronsDRGSpinalcord2020.Fast Blue LadellingGanglion Cells of Reti
12、na 20.优优点：可靠性，灵敏性，点：可靠性，灵敏性，利用其不同利用其不同颜颜色可同色可同时时追踪和追踪和显显示多重神示多重神经联经联系系。因此可。因此可选择选择一一种或两种以上的种或两种以上的荧荧光素分光素分别对别对神神经经元元进进行行单标单标、双、双标标或多重或多重标记标记。双重双重标记标记和多重和多重标记标记可用来可用来研究神研究神经经元元轴轴突的分支投射。突的分支投射。若在若在脑脑内不同核内不同核团团或区域分或区域分别别注射两种（或三种）不同注射两种（或三种）不同荧荧光，在同一神光，在同一神经经元元胞体内能胞体内能观观察到两种（或三种）不同察到两种（或三种）不同颜颜色的色的荧荧光，即
13、光，即说说明明该该神神经经元的元的轴轴突分支分突分支分别别投射到注射投射到注射这这些些荧荧光光剂剂的两个（或三个）的两个（或三个）脑脑内不同核内不同核团团或区域。或区域。需要注意的是各种需要注意的是各种荧荧光素逆行运光素逆行运输输的速度不同，所以的速度不同，所以动动物存活物存活时时间间也有差异。双重也有差异。双重标记标记是，有是，有时时需要做两次手需要做两次手术术先注射运先注射运输输慢的慢的荧荧光光素，素，过过一定的一定的时间时间后，再注射运后，再注射运输较输较快的快的荧荧光素。光素。缺缺点：激点：激发发光照射下很快褪光照射下很快褪灭灭，因此允，因此允许观许观察的察的时间较时间较短，保存短，保
14、存时时间间也有限。也有限。应应用：研究神用：研究神经经元的元的轴轴突分支至不同部位的投射。可与免疫突分支至不同部位的投射。可与免疫组织组织化化学学结结合，研究投射神合，研究投射神经经元的化学性元的化学性质质。.（2）变变性束路追踪法性束路追踪法利用神利用神经经元的元的轴轴突被突被损伤损伤之后，在之后，在损伤损伤的近的近侧侧端和端和远侧远侧端分端分别发别发生逆行和生逆行和顺顺行行溃变溃变；神；神经经元元胞体受胞体受损损后，其后，其发发出的出的轴轴突从胞体向突从胞体向终终末方向的末方向的远侧远侧端端发发生生顺顺行行溃变溃变，来研究，来研究纤维纤维的的联联系。系。.损伤损伤手段：手段：物理性方法物理
15、性方法锐锐器的切割、器的切割、电电凝、凝、电电离破坏、超声破坏等离破坏、超声破坏等特特点点：无无选选择择性性，除除了了损损伤伤神神经经元元和和发发出出的的纤纤维维以以外外，也能破坏通也能破坏通过过此此损伤损伤部位的部位的纤维纤维，导导致非特异性致非特异性标记标记。化学性破坏化学性破坏单单胺胺类类神神经经毒毒剂剂：6-羟羟多巴胺（可多巴胺（可选择选择性被儿茶酚胺性被儿茶酚胺类类神神经经元元摄摄入，入，经过经过自氧化形成若干具有自氧化形成若干具有细细胞毒性的胞毒性的产产物。物。由于整个神由于整个神经经元的元的细细胞膜均可胞膜均可摄摄入入6-羟羟多巴胺，故儿茶酚多巴胺，故儿茶酚胺胺类类神神经经元的任
16、何部位都可被元的任何部位都可被6-羟羟多巴胺破坏。不易通多巴胺破坏。不易通过过血血脑脑屏障，因此如欲造成中枢性破坏，需做屏障，因此如欲造成中枢性破坏，需做脑脑室或室或脑脑内注内注射）、射）、6-羟羟多巴、多巴、5,6-双双羟羟色胺和色胺和5,7-双双羟羟色胺（色胺（选择选择性性破坏破坏5-羟羟色胺能神色胺能神经经元）元）胆碱胆碱类类神神经经毒毒剂剂：乙基胆碱氮芥丙：乙基胆碱氮芥丙啶啶正离子正离子兴奋兴奋性氨基酸：海人酸和性氨基酸：海人酸和鹅鹅高蕈氨酸（能高蕈氨酸（能够够非非选择选择性性损伤损伤神神经经元的胞体，而不元的胞体，而不损伤轴损伤轴突，故无突，故无过过路路纤维纤维受受损问损问题题）.研
17、究方法：研究方法：20世世纪纪从从40年代，年代，镀银镀银染色法，根据染色法，根据银银染染溃变纤维溃变纤维的形的形态变态变化来判断、追踪化来判断、追踪溃变纤维溃变纤维的方法。的方法。20世世纪纪从从50年代，年代，Nauta法，一种改法，一种改进进的的溃变镀银溃变镀银法，能抑法，能抑制正常制正常纤维纤维的染色而的染色而仅仅染出染出溃变纤维溃变纤维。20世世纪纪70年代，年代，变变性束路追踪法逐性束路追踪法逐渐渐被被轴浆轴浆运运输输追踪法所代追踪法所代替。替。可与逆行可与逆行标记标记法、法、顺顺行行标记标记法、免疫法、免疫组织组织化学、原位化学、原位杂杂交等技交等技术结术结合运用。合运用。.（3
18、）神）神经经元元质质膜膜荧荧光染色法光染色法这类这类染料是利用它染料是利用它们们能溶于能溶于细细胞膜脂胞膜脂层层内并在膜内内并在膜内扩扩散的散的特点。可用在活体或固定的特点。可用在活体或固定的标标本上追踪本上追踪纤维联纤维联系。系。这类这类染料中染料中DiI、DiA和和DiO最常用。最常用。主要主要优优点是可用于固定点是可用于固定标标本，一些本，一些难难以在活体注射的小核以在活体注射的小核团团在固定在固定标标本上常比本上常比较较容易做到。容易做到。缺点是其在膜内缺点是其在膜内扩扩散的速度很慢，而且有效距离比散的速度很慢，而且有效距离比较较短，短，因此最适用于胚胎或小因此最适用于胚胎或小动动物。
19、物。.免疫免疫组织组织（细细胞）化学法胞）化学法20世世纪纪70年代，免疫年代，免疫组织组织化学技化学技术术被引入被引入脑脑研究研究领领域，域，它以特异性它以特异性强强、灵敏度高的特点，使神、灵敏度高的特点，使神经经元内所含的神元内所含的神经经活性物活性物质质、受体和、受体和转转运体可运体可视视化，化，给给形形态态学研究开辟了新学研究开辟了新的途径。的途径。.基本原理基本原理 利用免疫学中利用免疫学中抗原与抗体特异性抗原与抗体特异性结结合合的特点的特点以及以及组织组织化学化学的原理，在的原理，在组织组织或或细细胞胞标标本中加入本中加入特定的特定的标记标记抗体抗体，然后，然后对标记对标记物物进进
20、行行显显示，从而示，从而对组织对组织或或细细胞内的抗原物胞内的抗原物质进质进行定性、定位或定行定性、定位或定量研究。量研究。免疫酶技术显显示示Caspase-3免疫荧光技术显显示示MOR.因因为为抗原与抗体的抗原与抗体的结结合是高度特异的，所以免疫合是高度特异的，所以免疫组织组织化学化学方法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。方法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。免疫免疫组织组织化学的抗原通常是化学的抗原通常是肽肽或蛋白，有数量不等的抗原或蛋白，有数量不等的抗原决定簇。抗原决定簇由暴露于抗原表面、在空决定簇。抗原决定簇由暴露于抗原表面、在空间间上相上相邻邻的的3-8个氨基酸个氨基酸组组成。一个抗
21、原上可以有多个抗原决定簇。成。一个抗原上可以有多个抗原决定簇。故由此而故由此而产产生的抗血清中可能含有生的抗血清中可能含有针对针对不同决定簇的多克不同决定簇的多克隆抗体。用隆抗体。用杂杂交瘤技交瘤技术术可以制成可以制成针对单针对单个决定簇的个决定簇的单单克隆克隆抗体。抗体。抗体抗体仅识别仅识别特定的抗原决定簇，而不特定的抗原决定簇，而不识别识别抗原本身，因此抗原本身，因此不同物不同物质质只要有相同的抗原决定簇，均可被同一抗体只要有相同的抗原决定簇，均可被同一抗体识别识别，所以在免疫所以在免疫组织组织化学法中化学法中应应注意抗体的特异性及交叉反注意抗体的特异性及交叉反应应。. 抗体（抗体（ant
22、ibody,Ab）机体免疫机体免疫细细胞被抗原激活后，由分化成熟的胞被抗原激活后，由分化成熟的终终末末B细细胞胞浆浆细细胞合成、分泌的一胞合成、分泌的一类类能与相能与相应应抗原特异性抗原特异性结结合的具有免疫功合的具有免疫功能的球蛋白。是介能的球蛋白。是介导导体液免疫的重要效体液免疫的重要效应应分子。分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由两条相同的重链（heavychain,H）和两条相同的轻链（lightchain,L）借二硫键连接而成。在氨基端，重链的1/4和轻链的1/2氨基酸序列变化很大，为可变区（variableregion,V）；其他部分氨基酸序列相对恒定，为恒定区（constant
23、region,C）。.Fab即即抗原抗原结结合片段合片段（fragment antigen binding），由一条完整），由一条完整的的轻链轻链和部分重和部分重链链（VH和和CH1）组组成。成。该片段具有片段具有单价抗体活性，价抗体活性，能与能与一个相一个相应的抗原决定族特异性的抗原决定族特异性结合合。Fc即即可可结结晶片段晶片段（fragment crystalline），），Fc段含有两条重段含有两条重链链C端的一半，包含端的一半，包含CH2和和CH3两个两个功能区，它无抗体活性。功能区，它无抗体活性。Ig在异种在异种间间免疫所具有的抗原性主要存在于免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段段，
24、同，同时时Fc段段还还具有活化具有活化补补体、体、亲细亲细胞、通胞、通过过胎胎盘盘和介和介导导与与细细菌蛋白菌蛋白结结合等生物学活性。合等生物学活性。用木瓜蛋白用木瓜蛋白酶酶水解水解IgG分子，可将其分子，可将其裂解裂解为为两个完全相同的两个完全相同的Fab和一个和一个Fc片段。片段。 . 多克隆抗体多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb） 大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克多克隆抗体是多个抗原决定簇刺隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴激机体后，由多个免疫
25、淋巴细细胞分泌的胞分泌的多种抗体的混多种抗体的混合物合物。 PcAb 特异性差，易出现交叉反应。.由由单单一克隆一克隆B B细细胞胞杂杂交骨髓瘤交骨髓瘤细细胞胞产产生的，只生的，只识别识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。 单单克隆抗体克隆抗体（
26、monoclonalantibody,McAb）.组织组织（细细胞）化学是介于胞）化学是介于细细胞学与化学之胞学与化学之间间的一的一门门科科学。学。细细胞化学的目的是使用胞化学的目的是使用细细胞学和化学的方法使胞学和化学的方法使细细胞胞（组织组织）内的某些化学成分）内的某些化学成分发发生反生反应应，在局部形成有色反，在局部形成有色反应应物，藉此物，藉此对对各种活性物各种活性物质质在在显显微微镜镜水平水平进进行定性、定位行定性、定位和定量分析。和定量分析。 酶酶组织组织化学：利用化学：利用酶酶对对底物的催化作用，使底物底物的催化作用，使底物发发生生颜颜色色变变化，其次化，其次对该对该酶酶进进行定
27、位、定量分析。行定位、定量分析。.在在应应用用组织组织化学技化学技术显术显示示组织组织和和细细胞内化学物胞内化学物质质及定位和及定位和定量以及代定量以及代谢谢状状态时态时，需要，需要满满足以下要求：足以下要求：保持保持组织组织和和细细胞形胞形态结态结构的良好状构的良好状态态，以便反，以便反应产应产物的定物的定位精确。如果形位精确。如果形态结态结构破坏而失真，构破坏而失真，则则定位困定位困难难。具具备备一定的特异性，以便一定的特异性，以便获获取正确的取正确的实验结实验结果。果。具具备备一定的灵敏性，以便含量极微的物一定的灵敏性，以便含量极微的物质质也能被也能被显显示出来。示出来。生成的反生成的反
28、应产应产物必物必须须是有色沉淀，是有色沉淀，颗颗粒微粒微细细不溶，定位于不溶，定位于原位。反原位。反应应物沉淀的物沉淀的颜颜色深度与相色深度与相应应物物质质含量或含量或酶酶的活性的活性具有一定的量效关系。具有一定的量效关系。反反应产应产物具有物具有稳稳定性，以便于重复定性，以便于重复观观察察要有重复性。要有重复性。选择选择的的试剂试剂必必须须是分析是分析纯纯，对对被被检测检测物物质质或或酶酶应应无任何影无任何影响；响；实验实验所用器皿必所用器皿必须须清清洁洁无无污污染染杂质杂质，使用的蒸，使用的蒸馏馏水水应应为为双蒸水。双蒸水。为为了保了保证实验证实验的可靠性、科学性，防止假阳性的的可靠性、科
29、学性，防止假阳性的发发生，必生，必须须同同时时作作对对照照实验实验。.免疫免疫组织组织化学的技化学的技术术分分类类根据根据AgAb结结合方式分成：合方式分成：直接法直接法间间接法接法多多层层法法根据染色方式分成：根据染色方式分成：贴贴片染色片染色漂浮染色漂浮染色.按按标记标记物的性物的性质质分成：分成：u免疫免疫荧荧光技光技术术（免疫（免疫荧荧光法）光法）u免疫免疫酶酶技技术术（酶酶标标抗体法、抗体法、桥桥法、法、PAD法、法、ABC法）法）u免疫金属技免疫金属技术术（免疫（免疫铁铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）金法）标记标记物物必要性：必要性：组织细组织细胞内胞
30、内AgAb结结合反合反应应一般是不可一般是不可见见的，若的，若在在镜镜下下检测检测，则则必必须须具有可具有可视视性性标记标记物。所以需要用物。所以需要用标记标记的的方法将某种方法将某种标记标记物（如物（如酶酶、荧荧光素）光素）结结合到抗体上，再用合到抗体上，再用组组织织化学方法化学方法显显示此示此标记标记物或在物或在荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察荧荧光素光素发发出出的的荧荧光。光。.常用常用标记标记物物荧荧光素：最常用的是异硫一光素：最常用的是异硫一氰氰酸酸荧荧光素（光素（Fluoresceinisothiocyanate,FITC）荧荧光光显显微微镜镜下呈下呈绿绿色色荧荧光；光；Texas
31、red荧荧光光显显微微镜镜下下发红发红色色荧荧光光酶酶：辣根：辣根过过氧化物氧化物酶酶、碱性磷酸、碱性磷酸酶酶。生物素：生物素：Biotin铁铁蛋白金等：主要蛋白金等：主要应应用于免疫用于免疫电镜电镜。其他：如同位素（因涉及其他：如同位素（因涉及污污染和防染和防护难护难一般不用）一般不用）.应应用用凡是凡是组织细组织细胞内具有抗原性的物胞内具有抗原性的物质质，如，如肽类肽类、激素、神、激素、神经递质经递质、细细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织组织化化学方法学方法显显示，因而目前在基示，因而目前在基础础与与临临床科研中被广泛床科研中被广泛应应用。最用。
32、最近几年，分子生物学研究异常活近几年，分子生物学研究异常活跃跃，但最，但最终还终还要要归归到形到形态态上上来。用免疫来。用免疫组织组织化学方法化学方法对对所研究的大分子分子所研究的大分子分子进进行定位，行定位，进进而深入研究其功能。而深入研究其功能。.免疫免疫组织组织化学染色的基本化学染色的基本过过程程固定：由于在固定：由于在进进行免疫行免疫组织组织化学反化学反应时应时，蛋白，蛋白质质或或肽类肽类在在体内易分解，并从活体存在的部位流失，而必体内易分解，并从活体存在的部位流失，而必须须尽可能在尽可能在接近活体的状接近活体的状态态下，在尽可能短的下，在尽可能短的时间时间内用固定内用固定剂剂将之交将
33、之交联联起来，在原位固定那些物起来，在原位固定那些物质质。常用的固定液包括。常用的固定液包括甲甲醛醛、多聚甲多聚甲醛醛、戊二、戊二醛醛等。等。制片：切片（冰制片：切片（冰冻冻切片切片对对抗原保存性好，石蜡切片，抗原保存性好，石蜡切片，树树脂切片，震脂切片，震动动切片）、切片）、铺铺片（片（视视网膜）、网膜）、细细胞爬片胞爬片反反应应.固定固定方法：推注，滴注方法：推注，滴注滴注步滴注步骤： 1 1、开胸、开胸 2 2、暴露心、暴露心脏 3 3、自心尖剪开左心室、自心尖剪开左心室 4 4、插入灌流、插入灌流针至主至主动脉弓脉弓 5 5、固定灌流、固定灌流针 6 6、快速注入冲洗液（有、快速注入冲
34、洗液（有时可免）可免） 7 7、先快后慢注入固定液、先快后慢注入固定液 8 8、慢注、慢注毕，将，将动物装入含物装入含 有少量固定液的塑料袋有少量固定液的塑料袋 置置4C4C冰箱内静置冰箱内静置2h2h后取材后取材.染色方法染色方法ABC法法PAP法法.荧荧光光标记标记免疫免疫组织组织化学化学酶酶联联免疫免疫组织组织化学化学.1 1、免疫、免疫荧荧光光细细胞化学染色方法胞化学染色方法（1 1）直接法）直接法 荧荧光素直接光素直接标记标记在特异性第一抗体上，在特异性第一抗体上，荧荧光素光素标记标记的抗体直接与的抗体直接与组织组织切片上相切片上相应应的抗原的抗原结结合，一次孵育成功，在合，一次孵育
35、成功，在荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察检测检测抗原。抗原。 优优点：点：简单简单，时间时间短，特异性短，特异性强强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不（不经济经济）。）。应应用：基本不用了用：基本不用了.（2 2）间间接法接法 先用第一抗体孵育先用第一抗体孵育组织组织切片，在第一抗体切片，在第一抗体与与组织组织中的抗原中的抗原结结合后，再用合后，再用荧荧光素光素标记标记的第的第二抗体孵育，第二抗体是抗二抗体孵育，第二抗体是抗产产生第一抗体的生第一抗体的动动物（如兔、羊、小鼠等）的物（如兔、羊、小鼠等）的IgGIgG的抗体。通的抗体。通过过上上述步述步骤骤用用荧荧光素
36、光素标记标记的第二抗体与第一抗体的第二抗体与第一抗体结结合的方法来合的方法来间间接接显显示抗原所在的部位。示抗原所在的部位。 优优点：点：较较直接法灵敏，而且只需直接法灵敏，而且只需标记标记一种抗一种抗IgG抗体即可抗体即可鉴鉴定多种定多种抗原抗原。.免疫免疫荧荧光双光双标记标记法法（1）直接法）直接法甲甲荧荧光光标记标记的的抗甲抗原抗体抗甲抗原抗体乙乙荧荧光光标记标记的的抗乙抗原抗体抗乙抗原抗体甲抗原甲抗原乙抗原乙抗原.（2）间间接法接法甲抗原甲抗原乙抗原乙抗原抗甲抗原抗体抗甲抗原抗体抗乙抗原抗体抗乙抗原抗体乙乙荧荧光光标记标记的的第第二抗体（二抗）二抗体（二抗）甲甲荧荧光光标记标记的的第第
37、二抗体（二抗）二抗体（二抗）.两种第一抗体需来自不同种属的两种第一抗体需来自不同种属的动动物。将两种第一抗物。将两种第一抗体混合后与体混合后与组织组织孵育，然后用不同孵育，然后用不同荧荧光素（如光素（如FITC和和TexasRed）标记标记的二抗混合孵育，各自与其一抗的二抗混合孵育，各自与其一抗结结合。合。两种两种荧荧光素在光素在荧荧光光显显微微镜镜下下发发出不同出不同荧荧光，可以更光，可以更换滤换滤色色片系片系统统分分别进别进行行观观察。察。.免疫免疫荧荧光双光双标记标记法法的的应应用：用：1.1.将两种抗体分将两种抗体分别别用不同的用不同的荧荧光素加以光素加以标记标记，用来，用来显显示含有
38、不同示含有不同成分的两种成分的两种细细胞在同一区域的定位模式胞在同一区域的定位模式激光激光扫扫描共聚焦描共聚焦显显微微镜镜观观察察.免疫免疫荧荧光双光双标记标记法法的的应应用：用：2. 2. 将两种抗体分将两种抗体分别别用不同的用不同的荧荧光素加以光素加以标记标记，用来定位同一，用来定位同一细细胞内存在的两种不同成分胞内存在的两种不同成分.2 2、免疫、免疫酶酶组织组织化学染色方法化学染色方法 用用酶酶标记标记抗体和用抗体和用组织组织化学方法化学方法显显示示结结果，果，间间接的接的对对抗原物抗原物质进质进行定位。行定位。酶酶类标记类标记物物满满足的条件：足的条件：酶酶催化底物必催化底物必须须是
39、特异的，并容易被是特异的，并容易被显显示（示（产产物易于物易于镜镜下下观观察）；察）；酶酶反反应应形成的形成的终产终产物必物必须须是是稳稳定的沉淀，不能从定的沉淀，不能从酶酶活性活性部位向周部位向周围组织围组织弥散；弥散；容易容易获获取（取（纯纯）；）；中性中性pHpH值时值时，具有，具有稳稳定性；定性；酶酶标记标记至抗体上不影响至抗体上不影响酶酶和抗体的活性。和抗体的活性。 .常用常用酶酶类标记类标记物物辣根辣根过过氧化物氧化物酶酶（horseradishperoxidase,HRP），），H2O2和和DAB（diaminobenzidine,二氨基二氨基联联苯胺）苯胺）为为其常其常用底物，
40、用底物，产产物物为稳为稳定的棕黄色沉淀定的棕黄色沉淀.碱性磷酸碱性磷酸酶酶（alkalinephosphatase,AP）：）：BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-磷酸磷酸盐盐)和和NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四氮，四氮唑蓝唑蓝）是是AP的常用底物的常用底物组合，其中，合，其中，NBT作作为氧化氧化剂,BCIP作作为AP底物。底物。BCIPBCIP被AP水解成一种蓝色的中间物，后者然后被NBT氧化形成二聚体（不溶性紫蓝色沉淀）。.（1 1）PAPPAP法法过过氧化物氧化物酶酶抗抗过过氧化
41、物氧化物酶酶（Peroxidaseanti-peroxidasemethod,PAP）法）法PAP作作为为特异性特异性显显色基色基团团。每个。每个PAP复合物含个抗复合物含个抗HRP的的IgG分子及个分子及个HRP分子。分子。DAB作作为为供供氢氢体，体，HRP在在H2O2存在的情况下，能使存在的情况下，能使DAB发发生氧生氧化，生成不溶性棕褐色反化，生成不溶性棕褐色反应产应产物沉淀，定位在抗原所在物沉淀，定位在抗原所在处处。首先，特异性第一抗体（多首先，特异性第一抗体（多为为兔、羊或小鼠兔、羊或小鼠IgG）孵育）孵育组织组织切片。切片。其次用抗第一抗体的抗体（如其次用抗第一抗体的抗体（如羊抗
42、兔羊抗兔IgG或或驴驴抗小鼠抗小鼠IgG）作）作桥桥接。接。然后用然后用PAP复合物与复合物与桥桥抗体抗体结结合。合。最后，用最后，用HRP的底物来的底物来显显示示PAP复合物。复合物。.优优点：灵敏度高，所用第一抗体的点：灵敏度高，所用第一抗体的浓浓度可低于度可低于间间接接荧荧光法光法倍左右，并可倍左右，并可长长期保存。期保存。注意：注意：桥桥抗体抗体IgG分子有两个分子有两个Fab段，一个与第一抗体段，一个与第一抗体结结合，另一个与合，另一个与PAP复合物复合物结结合。合。桥桥抗体的两个抗体的两个Fab段是相段是相同的，因此第一抗体及同的，因此第一抗体及PAP复合物中的抗复合物中的抗HRP
43、抗体必抗体必须须来来自同一种自同一种动动物。物。.（2 2）ABC法法卵白素卵白素-生物素生物素-HRP复合物染色法复合物染色法（Avidinbiotinylatedhoreseradishperoxidasecomplexmethod，ABC法法）Avidin：卵白素卵白素，一种糖蛋白，每个分子上有，一种糖蛋白，每个分子上有4个与生物素个与生物素亲亲和力极高的和力极高的结结合位点，可以合位点，可以结结合合4个生物素。个生物素。Biotin：生物素，：生物素，为为一小分子一小分子维维生素，易于很多生物分子交生素，易于很多生物分子交联联。ABC是是卵白素卵白素-生物素生物素结结合的合的HRP复合
44、物复合物的的简简称，每一个称，每一个卵卵白素分子上白素分子上结结合个合个带带HRP的生物素，留出一个能与其的生物素，留出一个能与其他生物素他生物素结结合的空位合的空位。ABC复合物复合物HRP卵白素卵白素生物素生物素.ABC法是在第一抗体反法是在第一抗体反应应后，用生物素后，用生物素结结合的合的IgG抗体抗体（biotinylatedIgG）桥桥接。然后用接。然后用ABC孵育，使孵育，使桥桥抗上抗上的生物素与的生物素与ABC中卵白素上的空位中卵白素上的空位结结合。最后仍用合。最后仍用HRP的的底物呈色。底物呈色。B-IgGABCHRP卵白素卵白素生物素生物素优优点：由于生物素与卵白素点：由于生
45、物素与卵白素间间的的亲亲和力极和力极强强，故，故ABC法法比比PAPPAP法灵敏度更高法灵敏度更高。操作。操作时间时间短，可短，可长长期保存。期保存。注意：注意：ABC复合物与复合物与桥桥抗体之抗体之间间是通是通过过生物素生物素结结合的，合的，因此因此ABC复合物没有种属特异性，可适合于任何种复合物没有种属特异性，可适合于任何种类类的第的第一抗体。当然生物素一抗体。当然生物素结结合的第二抗体必合的第二抗体必须须是是针对针对第一抗体第一抗体属性的。属性的。.荧荧光光显显微微镜镜在照明系统的光源中使用高压汞灯提供全波段激发光为延长汞灯寿命，打开后不可立即关闭（至少15min），以免水银蒸发不完全而
46、损坏电极；汞灯关闭后则不可马上打开（至少30min），否则灯内汞蒸汽尚未恢复液态，内阻极小，再次施加电压会引起短路，导致汞灯爆炸。.激光共聚焦激光共聚焦显显微微镜镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。分辨率，是普通光学显微镜的3倍。用于观察细胞形态、细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。.http:/ 聚丙稀微碳聚丙稀微碳纤电纤电极（极（细细胞，胞，脑脑片）片） 柱状碳柱状碳纤电纤电极（在体）极（在体）膜片膜片钳钳放大器（放大器（电压钳电压钳模式）模式）数据采集接口卡数据采集接口卡
47、计计算机系算机系统统.优优点点胞吐活胞吐活动动的的检测检测不受胞吞活不受胞吞活动动重叠的干重叠的干扰扰直接直接检测释检测释放的物放的物质质量化量化测测量量单单个囊泡的分泌个囊泡的分泌实时监测实时监测无无创伤测创伤测量量.局限性局限性可可检测检测的物的物质质：氧化：氧化电压电压小于小于1000mV的的递质递质分子（分子（肾肾上上腺素、去甲腺素、去甲肾肾上腺素、多巴胺、上腺素、多巴胺、5-羟羟色胺、色胺、组组胺、抗坏血胺、抗坏血酸等）。酸等）。谷氨酸、乙酰胆碱、GABA、胰岛素等不能被检测。碳碳纤电纤电极极测测量的只是直接与碳量的只是直接与碳纤电纤电极尖端相接触或距离小极尖端相接触或距离小于于5m
48、范范围围内的那些小泡分泌。内的那些小泡分泌。只能只能测测量胞吐但不能量胞吐但不能测测量胞吞。量胞吞。.恒恒电电位（安培法，位（安培法，amperometry）时间时间分辨率高分辨率高三角波循三角波循环电压环电压（伏特法，（伏特法，voltammetry）能能鉴别鉴别是哪种是哪种递质递质分子分子但但测测量灵敏度比安培法低量灵敏度比安培法低因此，如果已知因此，如果已知该细该细胞分泌的是哪一种胞分泌的是哪一种递质递质，一般都，一般都使用安培法来使用安培法来记录细记录细胞分泌。胞分泌。.碳碳纤电纤电极性能极性能测试测试1.电电学特性学特性测试测试电电极尖端极尖端缓缓慢浸入生理溶液中慢浸入生理溶液中,H
49、P=780mV。由于。由于电电极极极化作用极化作用,碳碳纤电纤电极的极的检测电检测电流流(Iamp)波形会有一上冲。波形会有一上冲。好的好的电电极由于其漏极由于其漏电电流很小流很小,在十几秒到几十秒后在十几秒到几十秒后电电流波流波形会降至形会降至10pA以内。以内。.2. 2. 电电极氧化性能极氧化性能测试测试.3. 3. 肾肾上腺嗜上腺嗜铬细铬细胞分泌的胞分泌的检测检测和判定和判定.伏安法的伏安法的优优点是点是时间时间分辨率高，伏安法分辨率高，伏安法电电极的反极的反应时应时间间短，可用于短，可用于检测脑检测脑内内单单胺胺递质递质快速的快速的动态变动态变化。伏安法化。伏安法的碳素的碳素纤维纤维
50、微微电电极（一般在极（一般在10-20m）远远比比脑脑内微透析中内微透析中的微透析管（大于的微透析管（大于200m）口径小，可减少）口径小，可减少脑组织脑组织的的损伤损伤及可及可检测脑检测脑内小核内小核团团的神的神经经活性物活性物质质。但微透析法中用。但微透析法中用HPLC检测样检测样品，有很高的特异性，而且一次可同品，有很高的特异性，而且一次可同时检测时检测多种神多种神经经活性物活性物质质，可同，可同时时了解不同物了解不同物质质的的动态变动态变化及它化及它们们之之间间的相互作用，的相互作用，这这是伏安法是伏安法难难以做到的。以做到的。.假假递质标记递质标记法：原理是法：原理是对对于特定的分泌
51、于特定的分泌细细胞，胞，寻寻找一种找一种该该细细胞的分泌小泡内本来不存在，但分泌小泡能胞的分泌小泡内本来不存在，但分泌小泡能够够自自动摄动摄取取的的“易氧化分子易氧化分子”。将。将该该易氧化物易氧化物质质放到放到细细胞外液中，待胞外液中，待分泌小泡分泌小泡摄摄取足取足够够易氧化分子后便可做易氧化分子后便可做CFECFE实验实验。电电极涂极涂层层法：原理是法：原理是对对于待于待测测量的特定量的特定递质递质，寻寻找一种能找一种能够选择够选择性性“催化催化”该递质该递质的化学物的化学物质质或生物或生物酶酶，并将，并将该该物物质质“镀镀”到到CFE CFE 电电极尖端，当极尖端，当递质递质分子到达分子
52、到达CFECFE电电极尖表极尖表面面时时，首先，首先经经“镀层镀层”物物质质催化而在小于催化而在小于1000mV1000mV条件下氧条件下氧化，氧化化，氧化电电流成流成为为涂涂层层CFECFE的信号。的信号。寻寻找高效率并且找高效率并且稳稳定定性性较较高的涂高的涂层层是本方法的关是本方法的关键键。.（4）微穿刺）微穿刺术术微穿刺微穿刺术术是利用中空是利用中空针针管切取管切取脑脑片中的特定核片中的特定核团团，用于，用于检测检测其化学成其化学成分，包括神分，包括神经递质经递质及其代及其代谢产谢产物等。物等。动动物物处处死后立即取出死后立即取出脑脑，迅速将，迅速将所需的所需的脑脑区作冷区作冷冻冻切片
53、。在切片。在显显微解剖微解剖镜镜下，确定下，确定脑脑片中要切取的片中要切取的脑脑核核团团的位置，然后用中空的位置，然后用中空针针管穿刺管穿刺脑脑片切取片切取样样品。然后，将品。然后，将样样品品进进行适行适当的当的处处理，如匀理，如匀浆浆、超声波破碎或提取等，最后、超声波破碎或提取等，最后进进行化学行化学测测定。定。能快速、能快速、简简便便获获取取脑脑核核团组织进团组织进行化学行化学测测定。定。微穿刺微穿刺术术广泛广泛应应用于神用于神经经科学的研究。用于了解神科学的研究。用于了解神经递质经递质、神、神经肽经肽、酶酶和受体等在和受体等在脑脑区中的分布，区中的分布，测测定定这这些化学物些化学物质质在
54、在实验实验条件和病理条条件和病理条件下的改件下的改变变。优优点：操作点：操作简单简单快捷且非常可靠，有很高的解剖快捷且非常可靠，有很高的解剖结结构的分辨率，构的分辨率，样样品品经过经过适当适当处处理后可用理后可用许许多分析技多分析技术进术进行行测测定。定。缺点：缺点：组织样组织样品是在死后品是在死后获获得的；得的；样样品中的神品中的神经经元失去了元失去了传传入和入和传传出出的的联联系；在系；在处处理理过过程中如匀程中如匀浆浆等会引起缺氧。等会引起缺氧。.（5）脑脑片片离体研究神离体研究神经递质释经递质释放放过过程及其机制的重要手段。程及其机制的重要手段。过过程包括：程包括：脑脑片制片制备备：麻
55、醉后取：麻醉后取脑脑，将，将选择选择好的好的脑脑区切成区切成脑脑片。片。孵育：孵育：5 CO2、95O2饱饱和的和的缓缓冲液，冲液，37。标记脑标记脑片：孵育液中加入适量的含放射性同位素的神片：孵育液中加入适量的含放射性同位素的神经递质经递质或其前体或其前体标记脑标记脑片。片。脑脑片的神片的神经经末梢末梢对这对这些物些物质应质应具有高具有高亲亲和力和力摄摄取，使神取，使神经经末梢的末梢的递质贮库递质贮库被放射性物被放射性物质质选择选择地地标记标记。.灌流装置灌流装置释释放量的放量的测测定：定：基基础释础释放量放量去极化刺激引起的去极化刺激引起的释释放放量：量：电场电场刺激刺激高高钾浓钾浓度去极
56、化度去极化最后最后检测检测流出液和流出液和组组织织的放射活性，或用的放射活性，或用HPLC检测检测。.2、神、神经递质经递质功能的功能的测测定定突触前神突触前神经经末梢的末梢的递质递质是以量子式是以量子式释释放的，放的，其量很微小，因此在其量很微小，因此在进进行神行神经递质经递质功能功能测测定定时时，只能用最小而有效的只能用最小而有效的剂剂量模量模拟拟神神经递质经递质的生理效的生理效应应。（1）微）微电电泳：能将微量的神泳：能将微量的神经递质导经递质导入神入神经经元附近，元附近，观观察其作用。察其作用。（2）抗体微量注射）抗体微量注射.定定义义：借助微：借助微电电极通以一定的极通以一定的电电流
57、将解离物流将解离物质电质电泳到神泳到神经经元附元附近，近，观观察神察神经递质经递质或其他或其他药药物物对该对该神神经经元的作用。元的作用。基本原理：外加基本原理：外加电电流通流通过过含解离物含解离物质质溶液的微溶液的微电电极极时时，会将微，会将微电电极内的解离物极内的解离物质质从管尖从管尖释释放出来。例如在微放出来。例如在微电电极接正极，极接正极，动动物物头头皮接皮接负负极极时时，带带阳离子的物阳离子的物质质从微从微电电极中极中释释出。相反，微出。相反，微电电极极接接负负极，极，头头皮接正极（内向皮接正极（内向电电流）流）时时，微，微电电极极释释出的是出的是带负带负离子离子的物的物质质。微。微
58、电电泳泳时时解离物解离物质质从微从微电电极极释释出量，与它通出量，与它通过过的的电电荷量荷量成正比。因此，通常用微成正比。因此，通常用微电电极的极的电电流流强强度表示解离物度表示解离物质质的的释释放量。放量。方法：方法：1）拉制微）拉制微电电极：五管：每管尖端直径极：五管：每管尖端直径1-3 m,五管五管总总直径直径510 m.其中，一管其中，一管为纪录为纪录，一管，一管为对为对照，三管照，三管为药为药物。若需物。若需作作细细胞内胞内记录记录，则则有一管有一管应较应较其他管略其他管略长长，以便插入，以便插入细细胞内。胞内。（1）微微电电泳泳Microelectrophoresis.药药物管可根
59、据物管可根据实验实验需要，将神需要，将神经递质经递质或或药药物配成离子化溶液。物配成离子化溶液。为为此常用稀此常用稀释释的的NaOH溶液或溶液或HCl溶液制溶液制备备，并，并调调整溶液的整溶液的pH值值，使要作微，使要作微电电泳的物泳的物质质呈阳离子或阴离子，以便微呈阳离子或阴离子，以便微电电泳泳时时能能将所需要的解离物将所需要的解离物质导质导入所要入所要观观察的神察的神经经元。元。2）微）微电电极充极充满满溶液后，在立体定位溶液后，在立体定位仪仪帮助下，将微帮助下，将微电电极插至所需极插至所需要要观观察的察的脑脑核核团团内的神内的神经经元附近。微元附近。微电电泳泳仪仪上的上的输输出接出接头头
60、通通过过Ag-AgCl细丝细丝插入微插入微电电极各管中，另一共用接极各管中，另一共用接头连头连在在动动物物头头皮皮上，是每一管上，是每一管电电极与极与头头皮皮电电极之极之间间形成回路。然后，立即施加形成回路。然后，立即施加滞留滞留电电流防止自流防止自发发性外溢。微性外溢。微电电泳泳时选择时选择一定一定强强度（度（nA）的）的电电流通流通过过微微电电极，微极，微电电极中的解离物极中的解离物质释质释放量与通放量与通电电电电流流强强度成度成正比。正比。.多管微多管微电电泳方法具有三大特点。泳方法具有三大特点。第一，与离体第一，与离体实验实验相比，相比，应应用用这这种方法得到的种方法得到的实验结实验结
61、果能果能够够提供整体条件下目提供整体条件下目标细标细胞功能状胞功能状态态的信息。的信息。第二，第二，药药物的作用范物的作用范围围很小，可以精确定位到一个或几个很小，可以精确定位到一个或几个细细胞的反胞的反应应，所以用来研究，所以用来研究药药物物对单对单个神个神经细经细胞的直接作用。胞的直接作用。第三，可以通第三，可以通过过改改变变微微电电泳泳电电流的大小来流的大小来调节调节所施加所施加药药物的物的量。量。.Microionphoresis:This methods enables a researcher to apply very small amounts of drugs or neur
62、otransmitter candinates to the surface of neurons.应应用：将神用：将神经递质经递质或或药药物越物越过过血血脑脑屏障直接作用于神屏障直接作用于神经经元，元，甚至突触前膜和后膜，甚至突触前膜和后膜，观观察察这这些些递质递质和和药药物物对对它它们们的作用。的作用。可以直接可以直接对对所所记录记录的神的神经细经细胞施加多种受体的激胞施加多种受体的激动剂动剂或拮或拮抗抗剂剂，确定，确定该该神神经细经细胞膜上是否存在胞膜上是否存在这这种受体，激活或阻种受体，激活或阻断断这这种受体引起神种受体引起神经细经细胞胞发发生生兴奋还兴奋还是抑制。另外，是抑制。另外，
63、还还可可将跨膜信号将跨膜信号传导传导通路中某些关通路中某些关键键因子如因子如G-蛋白、第二信使蛋白、第二信使等的激等的激动剂动剂或抑制或抑制剂剂通通过过微微电电泳方法施加到泳方法施加到记录记录的神的神经细经细胞胞处处，从而研究受体激活后的信号，从而研究受体激活后的信号传导传导通路。通路。.基本原理基本原理:抗体抗原中和反抗体抗原中和反应应。特异性抗体注射在某。特异性抗体注射在某一一脑脑区，可中和神区，可中和神经经末梢末梢释释出而出而进进入突触入突触间间隙的神隙的神经经肽肽，防止其与受体，防止其与受体结结合。因此，用此方法可解合。因此，用此方法可解释释消除消除该该神神经肽经肽的生理效的生理效应应
64、的的结结果，从而推果，从而推测测内源性神内源性神经递经递质质的作用。的作用。中枢内直接注射法包括：中枢内直接注射法包括：脑脑室内注射，通室内注射，通过脑过脑内埋内埋植慢性套管和脊髓蛛网膜下腔慢性插管植慢性套管和脊髓蛛网膜下腔慢性插管进进行恒速微量行恒速微量注射等方法，或通注射等方法，或通过过玻璃微玻璃微电电极向被极向被纪录纪录的神的神经经元附元附近微量注射。近微量注射。（2）抗体微量注射）抗体微量注射.3、行、行为为学方法学方法经经典条件反射典条件反射操作式条件反射操作式条件反射动动物必物必须须完成某种运完成某种运动动或操作后才能得到或操作后才能得到强强化。例如，化。例如，将大鼠放入将大鼠放入
65、实验实验箱内，当它在走箱内，当它在走动动中偶然中偶然踩踩杠杆杠杆时时即喂食，即喂食，以以强强化化这这一操作，如此重复多次，大鼠即学会自一操作，如此重复多次，大鼠即学会自动踩动踩杠杆杠杆而得食。而得食。踩踩杠杆杠杆这样这样一个特定的一个特定的动动作就是条件反作就是条件反应应，简简称称反反应应。操作式条件反射代表了反。操作式条件反射代表了反应应与与强强化之化之间间的关系。的关系。.（三）生物化学方法（三）生物化学方法神神经经科学中，生物化学方法的主要任科学中，生物化学方法的主要任务务是分是分离和分析神离和分析神经组织经组织以及与神以及与神经经活活动动有关的种有关的种类类繁繁多的化学多的化学组组分，
66、特分，特别别是是诸诸多的神多的神经递质经递质、调质调质、激素、生激素、生长长因子及其受体，因子及其受体，这这些物些物质质的含量极微，的含量极微，有些有些组组分很容易失去活性。因此，和其他分很容易失去活性。因此，和其他领领域比域比较较，更需要用温和的、高回收、高分辨和高灵敏，更需要用温和的、高回收、高分辨和高灵敏度的分离分析方法。度的分离分析方法。.1、层层析分离技析分离技术术2、放射免疫、放射免疫测测定法定法3、酶酶联联免疫吸附法免疫吸附法4、免疫印迹法、免疫印迹法.层层析，也称析，也称为为色色谱谱分析，是一种分离技分析，是一种分离技术术，其基本原理是利用不同的物其基本原理是利用不同的物质质在
67、两个相（即固定在两个相（即固定相和移相和移动动相）之相）之间间具有不同的分配系数，即不同具有不同的分配系数，即不同物物质质和固定相和固定相缔缔合的合的紧紧密程度以及用液体（即移密程度以及用液体（即移动动相）淋洗相）淋洗时时被洗脱的被洗脱的难难易程度的不同，而达到易程度的不同，而达到将将样样品中所含的各种物品中所含的各种物质质分离的目的。其分离的目的。其优优点是点是分离条件温和，有利于保持生物活性，并适合于分离条件温和，有利于保持生物活性，并适合于大量制大量制备备。1、层层析分离技析分离技术术.层层析析法法进进行行时时有有两两个个相相，一一个个相相称称为为固固定定相相(Stationarypha
68、se)，通通常常为为表表面面积积很很大大的的或或多多孔孔性性固固体体；另另一一相相称称为为流流动动相相(Mobilephase)，是是液液体体或或气气体体。当当流流动动相相流流过过固固定定相相时时，由由于于物物质质在在两两相相间间的的分分配配情情况况不不同同，经经过过多多次次差差别别分分配配而而达达到到分分离离，或或者者说说，易易分分配配于于固固定定相相的的物物质质移移动动速速度度慢慢，易易分分配配于于流流动动相相中中的的物物质质移移动动速速度度快快，因而得到逐步分离。因而得到逐步分离。.层层析分离法基本原理析分离法基本原理.层层析技析技术术的分的分类类1.按两相所按两相所处处的的状状态态分分
69、类类以以液液体体作作为为流流动动相相的的层层析析称称为为液液相相层层析析，以以气气体体作作为为流流动动相相的称的称为为气相气相层层析析。其其固固定定相相也也可可有有两两种种状状态态，一一种种是是以以固固体体作作为为吸吸附附剂剂的的固固定定相相，另另一一种种是是以以涂涂布布在在固固体体载载体体表表面面的的液液体体作作为为固定相。固定相。.层层析析气相气相层层析（析（gas-chromatography）液相液相层层析（析（liquid-chromatography）气气-固固层层析（析（gas-solidchromatography）气气-液液层层析（析（gas-liquidchromatogr
70、aphy）液液-固固层层析（析（liquid-solidchromatography）液液-液液层层析（析（liquid-liquidchromatography）.2.按操作技按操作技术术形式分形式分类类.柱柱层层析析（columchromatography）-将将固固定定相相装装在在层层析析柱柱中中，使使样样品品朝朝着着一一个个方方向向移移动动，通通过过各各组组分随流分随流动动相流相流动动而得到分离的方法。而得到分离的方法。纸层纸层析析（paperchrmatography）-用用纸纸作作为为液液体体的的载载体体，样样品品点点在在纸纸上上随随后后展展开开达达到到分分离离鉴鉴定的方法。定的方
71、法。薄薄层层层层析析（thinlayperchromatography）-将将适适当当的的吸吸附附剂剂在在玻玻璃璃板板或或其其他他材材料料薄薄板板上上铺铺成成薄薄层层，样样点在上面随后用流点在上面随后用流动动相展开达到分离相展开达到分离鉴鉴定的方法。定的方法。.3.按按层层析析过过程的机制可分程的机制可分为为吸附吸附层析析(adsorptionchromatography)-利利用用吸吸附附剂剂对对不不同同组组分分吸吸附附能能力力的的不不同同加加以以分分离离的的方法。方法。离子交离子交换层换层析析（ion-exchangechromatography）-利利用用离离子子交交换换剂剂与与各各组组
72、分分之之间间的的离离子子亲亲和和力力不不同同而而进进行行层层析分离的方法。析分离的方法。凝胶凝胶层层析析（gelchromatography）-利利用用不不同同组组分分之之间间分分子子大大小小不不同同，在在通通过过凝凝胶胶介介质质时时所受到的阻滞作用的差异而所受到的阻滞作用的差异而进进行分离的方法。行分离的方法。亲亲和和层层析析（affinitychromatography）-利利用用生生物物大大分分子子之之间间特特有有亲亲和和力力的的不不同同进进分分离离纯纯化化的的方法。方法。. 吸附吸附柱柱层层析析 是以是以固体吸附固体吸附剂剂为为固定相固定相，以，以有机溶有机溶剂剂或或缓缓冲液冲液为为流
73、流动动相相构成柱状的一种构成柱状的一种层层析方法。析方法。 常用的吸附常用的吸附剂剂有：极性的和非极性的两种有：极性的和非极性的两种 极性的有：极性的有：羟羟基磷灰石、硅胶、氧化基磷灰石、硅胶、氧化铝铝、人造沸石等、人造沸石等; ; 非极性的有：活性炭等。非极性的有：活性炭等。.基本原理基本原理在吸附在吸附层层析法中，使用的固定相基析法中，使用的固定相基质质是是颗颗粒状的吸附粒状的吸附剂剂。在吸附在吸附剂剂的表面存在着的表面存在着许许多随机分布的吸附位点；多随机分布的吸附位点；吸附位点通吸附位点通过过范德瓦范德瓦尔尔力力( (中性分子彼此距离非常近中性分子彼此距离非常近时时，产产生的一种微弱生
74、的一种微弱电电磁引力磁引力) )和和静静电电引力引力与蛋白与蛋白质质和核酸和核酸等等等等生物生物分子分子结结合合； 其其结结合力的合力的大小大小大小大小与各种生物分子的与各种生物分子的结结构构和吸附和吸附剂剂的的性性质质有密有密切关系。切关系。 .例如例如 把含把含结结构不同的构不同的A A、B B二二种物种物质质的混合溶液加至装的混合溶液加至装有吸附有吸附剂剂的的层层析柱；析柱； 而后，注入适宜的洗脱而后，注入适宜的洗脱剂剂，控制速度，控制速度让让其下流；其下流； 便可借助便可借助A A、B B两种物两种物质对质对吸附吸附剂结剂结合力的差异性，合力的差异性，将它将它们们二者分离。二者分离。
75、假如吸附假如吸附剂对剂对A A的的结结合合力小于力小于B B时时，则则B B留在柱子留在柱子上部，上部，A A移至柱子的下部。移至柱子的下部。 . A A、B B二物二物质质在柱上得以分离，是由于在柱上得以分离，是由于A A、B B二物二物质质在固定相在固定相( (吸附吸附剂剂) )与流与流动动相相( (洗脱洗脱剂剂) )之之间间的分配系数的分配系数( (即物即物质质在固定相中的在固定相中的浓浓度除以它在流度除以它在流动动相中的相中的浓浓度度) )不同所致。不同所致。 如果如果A A物物质质分配系数小于分配系数小于B B物物质时质时，则则A A在柱子上移在柱子上移动动的速度大于的速度大于B B
76、。 . 离子交离子交换层换层析析 离子交离子交换层换层析析是利用离子交是利用离子交换剂换剂上的可交上的可交换换离子与周离子与周围围介介质质中被分离的各种离子中被分离的各种离子间间的的亲亲和力不同，和力不同，经过经过交交换换平平衡达到分离的目的的一种柱衡达到分离的目的的一种柱层层析法。析法。 离子交离子交换层换层析具有灵敏度高，重复性、析具有灵敏度高，重复性、选择选择性好，分性好，分析速度快等析速度快等优优点，是当前最常用的点，是当前最常用的层层析法之一。析法之一。.离子交离子交换剂换剂与水溶液中离子或离子化合物的反与水溶液中离子或离子化合物的反应应主要是以离子交主要是以离子交换换方式方式进进行
77、。所行。所进进行的离子交行的离子交换换反反应应是可逆的。假定以是可逆的。假定以RA代表阳离子交代表阳离子交换剂换剂，在溶液中解，在溶液中解离出来的阳离子离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子与溶液中的阳离子B+可可发发生可逆的生可逆的交交换换反反应应，反，反应应式式为为：RA+B+RB+A+该该反反应应能以极快的速率达到平衡，平衡的移能以极快的速率达到平衡，平衡的移动动遵循遵循质质量作用定律。量作用定律。离子交离子交换换反反应应.两性离子如蛋白两性离子如蛋白质质、核苷酸、氨基酸等与离子交、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂换剂的的结结合力，主合力，主要决定于它要决定于它们们的理化性的理化性质质和特定的条
78、件下呈和特定的条件下呈现现的离子状的离子状态态。当。当pHpI时时，能被阴离子交，能被阴离子交换剂换剂吸附。吸附。若在相同若在相同pI条件下，且条件下，且pIpH时时，pI越高，碱性越越高，碱性越强强，就越容易被阳离，就越容易被阳离子交子交换剂换剂吸附。吸附。离子交离子交换层换层析就是利用离子交析就是利用离子交换剂换剂的荷的荷电电基基团团，吸附溶液中相反，吸附溶液中相反电电荷的离子或离子化合物，被吸附的物荷的离子或离子化合物，被吸附的物质质随后随后为带为带同同类类型型电电荷的其他离子荷的其他离子所置所置换换而被洗脱。由于各种离子或离子化合物而被洗脱。由于各种离子或离子化合物对对交交换剂换剂的的
79、结结合力不同，合力不同，因而洗脱的速率有快有慢，形成了因而洗脱的速率有快有慢，形成了层层析析层层。这这种方法种方法对对分离神分离神经肽经肽很有效，因很有效，因为为只要改只要改变变溶液的溶液的PH，使其不，使其不等于多等于多肽肽的等的等电电点，就可使其点，就可使其带电带电荷。荷。.示意示意图图（离子交（离子交换过换过程）程）电电离基离基团团（磺酸根）（磺酸根）可交可交换换离子（离子（钠钠离子）离子）交交换换离子离子不交不交换换离子离子.1.1.平衡平衡阶阶段段: :离子交离子交换换剂剂与反离子与反离子结结合合2.2.吸附吸附阶阶段：段：样样品品与反离子与反离子进进行交行交换换3 3、4. 4.
80、解吸附解吸附阶阶段：段：梯度梯度缓缓冲溶液先洗下冲溶液先洗下弱吸附物弱吸附物质质，后洗下，后洗下强强吸附物吸附物质质5.5.再生再生阶阶段：段：用原始用原始平衡液平衡液进进行充分洗行充分洗涤涤，既可重复使用既可重复使用. 凝胶凝胶层层析是以各种多孔性凝胶填料析是以各种多孔性凝胶填料为为固定相，利用流固定相，利用流动动相中所含各种相中所含各种组组分的相分的相对对分子分子质质量不同而达到物量不同而达到物质质分离分离的一种技的一种技术术。 突突出出优优点点是是：凝凝胶胶不不带带电电荷荷、吸吸附附力力弱弱、不不需需再再生生处处理理可可反反复复使使用用、操操作作条条件件温温和和、对对分分离离成成分分不不
81、变变性性和和破破坏坏、对对高分子物高分子物质质有很好的分离效果。有很好的分离效果。 凝胶凝胶层层析析.126基本原理基本原理凝凝胶胶层层析析的的分分离离过过程程是是在在装装有有多多孔孔物物质质填填料料的的柱柱中中进进行行的。的。当当具具有有一一定定分分子子量量分分布布的的高高聚聚物物溶溶液液从从柱柱中中通通过过时时，较较小小的的分分子子在在柱柱中中停停留留时时间间比比大大分分子子停停留留的的时时间间要要长长，于于是是样样品品各各组组分分即即按按分分子子大大小小顺顺序序而而分分开开，最最先先淋淋出出的的是是最大的分子。最大的分子。. 1 1、比比孔孔穴穴孔孔径径大大的的分分子子不不能能扩扩散散到
82、到孔孔穴穴内内部部，完完全全被被排排阻阻在在孔孔外外，只只能能在在凝凝胶胶颗颗粒粒外外的的空空间间随随流流动动相相向向下下流流动动，它它们经历们经历的流程短，流的流程短，流动动速度快，所以首先流出；速度快，所以首先流出； 2 2、较较小小的的分分子子则则可可以以完完全全渗渗透透进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部，经经历历的流程的流程长长，流，流动动速度慢，所以最后流出；速度慢，所以最后流出； 3 3、分分子子大大小小介介于于二二者者之之间间的的分分子子在在流流动动中中部部分分渗渗透透，渗渗透透的的程程度度取取决决于于它它们们分分子子的的大大小小，所所以以它它们们流流出出的的时时间间介于二者之介于
83、二者之间间。 .也叫凝胶也叫凝胶过滤层过滤层析析.凝胶凝胶过滤层过滤层析析过过程示意程示意图图小分子小分子大分子大分子凝胶基凝胶基质质凝胶凝胶珠珠.t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量： . 分分子子越越大大的的组组分分越越先先流流出出，分分子子越越小小的的组组分分越越后后流流出出。这这样样样样品品经经过过凝凝胶胶层层析析后后，各各个个组组分分便便按按分分子子从从大大到到小小的的顺顺序序依依次次流流出出，从从而而达达到到了了分离的目的。分离的目的。 .亲亲和和层层析析 生物生物亲亲和作用：和作用：生物物生物物质质具有具有识别识别特定物特定物质质并与并与该该物物质质的的分子相分子相结结
84、合的能力。合的能力。这这种种识别识别并并结结合的能力具有排他性合的能力具有排他性（能区分（能区分结结构和性构和性质质非常相近的其它分子）。非常相近的其它分子）。 亲亲和和层层析析(Affinity Chromatography(Affinity Chromatography，AC)AC)是利用生物大是利用生物大分子具有分子具有对对一一类类生物大分子生物大分子特异特异识别识别和和可逆可逆结结合合的特性而的特性而建立起来的一种分离的色建立起来的一种分离的色谱谱方法，也叫做生物方法，也叫做生物亲亲和或生物和或生物特异性特异性亲亲和色和色谱谱。.其固定相与被分离的物其固定相与被分离的物质质呈高呈高亲亲
85、和性、特异性的和性、特异性的结结合，合，因此可使因此可使样样品中所含的微量的被分离物品中所含的微量的被分离物质质与固定相与固定相结结合，合，而而这这种种结结合又是可逆的，因而能被洗脱下来。由于可逆性合又是可逆的，因而能被洗脱下来。由于可逆性的特异的特异结结合在生命合在生命现现象中比象中比较较普遍而且非常重要，如普遍而且非常重要，如抗原抗原-抗体抗体、受体受体-配体配体、酶酶-底物底物之之间间的的结结合等，因此合等，因此亲亲和和层层析析是一种很重要而又常用的分离生物活性物是一种很重要而又常用的分离生物活性物质质的方法。的方法。亲亲和和层层析可分析可分为为两大两大类类：一一类类是将配体、底物共价是
86、将配体、底物共价结结合于凝胶上，以此作合于凝胶上，以此作为为固定相固定相用于分离受体和用于分离受体和酶酶蛋白，蛋白，总总称称为为配体配体亲亲和和层层析；析；另一另一类类是将抗体固定于凝胶，用于分离抗原，称是将抗体固定于凝胶，用于分离抗原，称为为免疫免疫亲亲和和层层析。析。.(1) (1) 酶酶底物或抑制底物或抑制剂剂(2) (2) 抗原抗原抗体。抗体。(3) (3) 激素激素受体。受体。(4) (4) 糖蛋白与凝集素糖蛋白与凝集素, ,(5) (5) 生物素生物素生物素生物素结结合蛋白等合蛋白等 .高效液相高效液相层层析析高效液相高效液相层层析（析（highperformanceliquidc
87、hromatography,HPLC）是溶）是溶质质在固定相和流在固定相和流动动相之相之间间进进行的一种行的一种连续连续多次的交多次的交换过换过程程，它借溶，它借溶质质在两相在两相间间分配分配系数、系数、亲亲合力、吸附能力、离子交合力、吸附能力、离子交换换或分子大小不同引起或分子大小不同引起的排阻作用的差的排阻作用的差别别使不同溶使不同溶质进质进行分离。行分离。HPLC分析蛋白分析蛋白质质不不仅简仅简便快捷，而且便快捷，而且选择选择性好，分离效性好，分离效率高，率高，检测检测灵敏度高（灵敏度高（pmol甚至甚至fmol水平）。水平）。.HPLC的原理和普通柱的原理和普通柱层层析完全相同，所不同
88、的是用高析完全相同，所不同的是用高压压加快了洗脱液在加快了洗脱液在层层析柱内的流速，使分离速度析柱内的流速，使分离速度缩缩短到几十短到几十分分钟钟甚至几分甚至几分钟钟；解决了微粒型（直径解决了微粒型（直径5-10m）填料的高）填料的高压压匀匀浆浆装柱技装柱技术术，使使层层析柱的柱效达到每米几万甚至十万以上的理析柱的柱效达到每米几万甚至十万以上的理论论塔数塔数（理（理论论塔数反映了移塔数反映了移动动相和固定相之相和固定相之间间的分配次数，普通的分配次数，普通层层析柱的理析柱的理论论塔数塔数为为每米数千），因而极大地提高了分离每米数千），因而极大地提高了分离的效率，即分辨率。的效率，即分辨率。HP
89、LC的的仪仪器已配上高灵敏度的在器已配上高灵敏度的在线检测线检测器，包括紫外光器，包括紫外光检测检测器、器、电电化学化学检测检测器、放射性核素器、放射性核素检测检测器等，因此可将器等，因此可将分离和分析一步完成。分离和分析一步完成。.层层析法是根据物析法是根据物质质的理化性的理化性质质不同而建立的分离分析方法。不同而建立的分离分析方法。根据根据层层析峰的位置及峰高或峰面析峰的位置及峰高或峰面积积，可以定性及定量。，可以定性及定量。层层析法与光学、析法与光学、电电学或学或电电化学化学仪仪器器连连用，可用，可检测检测出出层层析后各析后各组组份的份的浓浓度或度或质质量，同量，同时绘时绘出出层层析析图
90、图。层层析析仪仪与与电电子子计计算机算机联联用，可使操作及数据用，可使操作及数据处处理自理自动动化，大大化，大大缩缩短分析短分析时间时间。由于由于层层析法具有分辨率高、灵敏度高、析法具有分辨率高、灵敏度高、选择选择性好、速度快等特性好、速度快等特点，因此适用于点，因此适用于杂质杂质多、含量少的复多、含量少的复杂样杂样品分析，尤其适用于品分析，尤其适用于生物生物样样品的分离分析。品的分离分析。.2、放射免疫、放射免疫测测定法定法 在在20世世纪纪60年代初，年代初，Berson和和Yalow首次首次应应用放射免用放射免疫分析法定量疫分析法定量测测定胰定胰岛岛素，开素，开创创了生物活性物了生物活性
91、物质质微量微量测测定定技技术术的新的新时时代，是微量分析方法学上的一个突破。从此放代，是微量分析方法学上的一个突破。从此放射免疫分析以其灵敏度高、特异性射免疫分析以其灵敏度高、特异性强强、重复性好、准确度、重复性好、准确度高等特点而被广泛高等特点而被广泛应应用于医用于医药药研究中。研究中。.基本原理基本原理放射性放射性标记标记抗原与非抗原与非标标记记抗原（包括抗原（包括标标准抗原准抗原或待或待测测抗原）与有限量抗原）与有限量的特异性抗体的特异性抗体发发生可逆生可逆性性竞竞争争结结合。合。Ag*Ag*和和AgAg具有等同的与具有等同的与AbAb结结合能合能力。力。.AbAb限量，限量，Ag*Ag
92、*定量定量, ,Ag*Ag*和和AgAg的量大于的量大于AbAb结结合位点，二者合位点，二者通通过竞过竞争方式与争方式与AbAb结结合；随着合；随着AgAg增加，增加，Ag*Ag*与与AbAb结结合形成合形成Ag*AbAg*Ab复合物的放复合物的放射量降低射量降低, ,二者二者变变化成函数关系。化成函数关系。 .以未以未结结合的合的Ag*Ag*为为F F，Ag*AbAg*Ab复合复合物物为为B B，则则B/FB/F或或B/(BB/(BF)F)与与AgAg的的量量变变存在着函数存在着函数关系关系剂剂量反量反应应曲曲线线 注：注：T即是即是B与与F的的总总和和.基本步基本步骤骤样样品的品的处处理理
93、加加样样：将不同量的：将不同量的标标准品和准品和样样品加到一排品加到一排试试管内，每管加管内，每管加已已选选定的的定的的Ag*量和抗血清（量和抗血清（Ab），用），用缓缓冲液冲液补补充到相同充到相同的容的容积积。在一定的温度放置一定的在一定的温度放置一定的时间时间，使，使Ag、Ag*和和Ab的的竞竞争争结结合反合反应应达到平衡。达到平衡。将将结结合的合的Ag*与游离的与游离的Ag*分离：分离的方法分分离：分离的方法分为为非特异非特异吸附法和双抗体法两大吸附法和双抗体法两大类类。测测量量Ag*-Ab的放射性，制作的放射性，制作标标准曲准曲线线，从，从标标准曲准曲线线上上查查出出样样品中品中Ag的
94、含量。的含量。. 放放射射免免疫疫分分析析技技术的的灵灵敏敏度度高高、特特异异性性强、精精密密度度好好, , 常常用用于于各各种种激激素素、微微量量蛋蛋白白质、肿瘤瘤标志志物物和和药物物等等微微量量物物质的的测定定。但但由由于于放放射射污染染和和危危害害，常常用用核核素素半半衰衰期期短短，试剂盒盒稳定定期期不不长等等诸多多不不足足, , RIARIA将逐将逐渐被取代。被取代。应应用用.（1 1）甲状腺的激素与自身抗体的含量）甲状腺的激素与自身抗体的含量测测定；定；（2 2）性腺和胎）性腺和胎盘盘激素激素类类的含量的含量测测定；如雌二醇（定；如雌二醇（E2E2）、雌三）、雌三醇（醇（E3E3）、
95、促）、促滤滤泡激素（泡激素（FSHFSH）、促黄体激素（）、促黄体激素（LHLH）、人）、人胎胎盘盘泌乳素（泌乳素（hPLhPL）的）的检测检测、绒绒毛膜促性腺激素（毛膜促性腺激素（HCGHCG）等；）等；（3 3）垂体激素）垂体激素类类的的测测定：促甲状腺素（定：促甲状腺素（TSHTSH）、垂体泌乳素）、垂体泌乳素（PRLPRL）；）；（4 4）肿肿瘤瘤诊诊断方面断方面 检测检测血清血清AFPAFP以以诊诊断肝癌、断肝癌、检测检测血清血清CEACEA以以监测结肠监测结肠癌等多种癌瘤的癌等多种癌瘤的扩扩散、复散、复发发或或转转移等移等（5 5）心血管疾病）心血管疾病诊诊断方面断方面 检测检测血
96、清肌血清肌红红蛋白可早期蛋白可早期诊诊断急性断急性必肌梗塞；血必肌梗塞；血浆肾浆肾素素- -血管血管紧张紧张素素- -醛醛固固酮酮系系统统的的RIARIA法的建法的建立，立，对对高血高血压压病、病、醛醛固固酮酮增多症的分型和增多症的分型和鉴别诊鉴别诊断有相当大断有相当大的价的价值值。.3、酶酶联联免疫吸附法（免疫吸附法（ELISA）它采用抗原与抗体的特异反它采用抗原与抗体的特异反应应将待将待测测物与物与酶酶连连接，然后接，然后通通过过酶酶与底物与底物产产生生颜颜色反色反应应，用于定量，用于定量测测定。定。测测定的定的对对象可象可以是抗体也可以是抗原。以是抗体也可以是抗原。在在这这种种测测定方法
97、中有定方法中有3种必要的种必要的试剂试剂：固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附免疫吸附剂剂）酶酶标记标记的抗原或抗体（的抗原或抗体（标记标记物物）酶酶作用的底物（作用的底物（显显色色剂剂）常用的常用的ELISA方法包括：双抗体方法包括：双抗体夹夹心法、心法、间间接法、接法、竞竞争法等。争法等。.抗原（抗体）先抗原（抗体）先结结合在固相合在固相载载体上，但仍体上，但仍保留其免疫活性，然后保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与加一种抗体（抗原）与酶酶结结合成的偶合成的偶联联物（物（标标记记物），此偶物），此偶联联物仍保物仍保留其原免疫活性与留其原免疫活性与酶酶活活性，当偶性，当偶联联物与
98、固相物与固相载载体上的抗原（抗体）反体上的抗原（抗体）反应结应结合后，再加上合后，再加上酶酶的的相相应应底物，即起催化水底物，即起催化水解或氧化解或氧化还还原反原反应应而呈而呈颜颜色。色。其所生成的其所生成的颜颜色深色深浅与欲浅与欲测测的抗原（抗体）的抗原（抗体）含量成正比。含量成正比。.酶酶 底底 物物显色显色反应反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色
99、蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+ +重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405405420 420 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 荧光荧光黄色黄色 360,4
100、50360,450420420 .双抗体双抗体夹夹心法，属于非心法，属于非竞竞争争结结合合测测定。它是定。它是检测检测抗原抗原最常用最常用ELISAELISA，适用于，适用于检测检测分子中具有至少两个抗原决定分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。簇的多价抗原。基本工作原理基本工作原理：利用：利用连连接于固相接于固相载载体上的抗体和体上的抗体和酶酶标标抗体抗体分分别别与与样样品中被品中被检测检测抗原分子上两个抗原决定簇抗原分子上两个抗原决定簇结结合，形合，形成固相抗体成固相抗体- -抗原抗原- -酶酶标标抗体免疫复合物。复合物的形成量抗体免疫复合物。复合物的形成量与待与待测测抗原的含量成正比。
101、抗原的含量成正比。测测定复合物中的定复合物中的酶酶作用于加入作用于加入的底物后生成的有色物的底物后生成的有色物质质量量(OD(OD值值) )，即可确定待，即可确定待测测抗原含抗原含量。量。双抗体双抗体夹夹心法心法.一一步步法法二二步步法法.以以测测HBsAgHBsAg为为例：例：试剂试剂：HBsAgHBsAg诊诊断断试剂试剂盒盒器材器材：酶酶联仪联仪，微量加，微量加样样器，吸器，吸头头等等方法方法加加样样：每：每组组7微孔，待微孔，待检检4孔，空白孔，空白对对照照1孔，阴、阳性孔，阴、阳性对对照各照各1孔。分孔。分别别加阴、阳性加阴、阳性对对照照1滴和滴和50ul待待测样测样本于相本于相应应孔
102、内，置孔内，置37水浴箱温育水浴箱温育30分分钟钟。加加酶酶：除空白：除空白对对照孔外，每孔加照孔外，每孔加1滴滴酶酶标标溶液，混匀后封板，置溶液，混匀后封板，置37水浴水浴箱温育箱温育30分分钟钟。洗洗涤涤：用洗：用洗涤涤液（按液（按说说明配制）注明配制）注满满各孔，静置各孔，静置20秒，甩去洗秒，甩去洗涤涤液，重液，重复复4次，最后一次在吸水次，最后一次在吸水纸纸上拍干。上拍干。显显色：每孔加底物液色：每孔加底物液A、B各各1滴（滴（50ul），），轻轻拍混匀，置拍混匀，置37水浴水浴15分分钟钟，肉眼，肉眼观观察。察。终终止：每孔加止：每孔加终终止液止液1滴（滴（50ul），），轻轻拍混
103、匀。拍混匀。结结果果测测定定用用酶酶标仪标仪（450nm）测测定各孔吸光度定各孔吸光度OD值值（先用空白孔校零），（先用空白孔校零），P/N值值2.1者判者判为为HBsAg阳性，阳性，2.1者判者判为为阴性。阴性。.间间接法接法间间接法是接法是检测检测抗体最常用的方法，其原理抗体最常用的方法，其原理为为利用利用酶酶标记标记的抗抗体以的抗抗体以检测检测已与固相已与固相结结合的受合的受检检抗体，故称抗体，故称为间为间接法。接法。.以以测结测结核抗体核抗体为为例：例：试剂试剂：结结核抗体核抗体诊诊断断试剂试剂盒盒器材器材：酶酶联仪联仪，微量加，微量加样样器，吸器，吸头头等等方法方法包被抗原：在聚苯乙
104、包被抗原：在聚苯乙烯烯微量反微量反应应板孔中加抗原板孔中加抗原100l，41218小小时时。用用1BSA或正常兔血清或正常兔血清4、1218小小时时阻断，阻断，4冰箱冰箱备备用。用。洗洗涤涤：用前：用前应进应进行漂洗去除行漂洗去除杂杂蛋白，用洗蛋白，用洗涤涤液洗液洗3次，每次次，每次3分分钟钟。加待加待测样测样本：将血清稀本：将血清稀释释成成1：50，每份，每份标标本加复孔，每孔本加复孔，每孔100l，37保温保温30分分钟钟。设设已知的阳性和阴性血清已知的阳性和阴性血清对对照。照。洗洗涤涤3次后，加兔抗次后，加兔抗IgG酶酶结结合物，合物，37保温保温30分分钟钟，以相同的方法洗，以相同的方
105、法洗涤涤3次。次。加新加新鲜鲜配制的配制的邻邻苯二胺底物溶液和双氧水溶液各苯二胺底物溶液和双氧水溶液各100l。静止。静止20分分钟钟，再加入再加入3mol/L硫酸每孔硫酸每孔50l终终止反止反应应。结结果果测测定：定：酶酶联仪联仪比色比色.固相固相载载体在体在ELISA测测定定过过程中作程中作为为吸附吸附剂剂和容器。和容器。最最常用的是常用的是聚苯乙聚苯乙烯烯和聚和聚氯氯乙乙烯烯。它。它们们有有较较强强的吸附蛋白的吸附蛋白质质的性能，抗体或蛋白的性能，抗体或蛋白质质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。学活性。微量滴定板，量滴定板微量滴定板，量滴定板为为812的
106、的96孔式。孔式。ELISA板板的特点是可以同的特点是可以同时进时进行大量行大量标标本的本的检测检测，并可在特制的比，并可在特制的比色色计计上迅速上迅速读读出出结结果。聚苯乙果。聚苯乙烯经烯经射射线线照射后，其吸附性照射后，其吸附性增加。增加。.DNM-9602GDNM-9602G酶酶标标分析分析仪仪DNM-9602 DNM-9602 标标配配酶酶标标分析分析仪仪DNM-9602ADNM-9602A酶酶标标分析分析仪仪几种几种酶酶标标分析分析仪仪.应应用用ELISA法是免疫法是免疫诊诊断中的一断中的一项项新技新技术术，现现已成功地已成功地应应用于用于多种病原微生物所引起的多种病原微生物所引起的
107、传传染病、寄生虫病及非染病、寄生虫病及非传传染病等方面染病等方面的免疫的免疫诊诊断。也已断。也已应应用于大分子抗原和小分子抗原的定量用于大分子抗原和小分子抗原的定量测测定，定，根据已根据已经经使用的使用的结结果，果，认为认为ELISA法具有法具有灵敏灵敏、特异特异、简单简单、快速快速、稳稳定定及及易于自易于自动动化操作化操作等特点。不等特点。不仅仅适用于适用于临临床床标标本的本的检查检查，而且由于一天之内可以，而且由于一天之内可以检查检查几百甚至上千份几百甚至上千份标标本本,因此，因此，也适合于血清流行病学也适合于血清流行病学调查调查。本法不。本法不仅仅可以用来可以用来测测定定抗体抗体，而，而
108、且也可用于且也可用于测测定体液中的循定体液中的循环环抗原抗原，所以也是一种早期，所以也是一种早期诊诊断的断的良好方法。因此良好方法。因此ELISA法在生物医学各法在生物医学各领领域的域的应应用范用范围围日益日益扩扩大，可概括四个方面：大，可概括四个方面：1、免疫、免疫酶酶染色各种染色各种细细胞内成份的定位。胞内成份的定位。2、研究抗、研究抗酶酶抗体的合成。抗体的合成。3、显现显现微量的免疫沉淀反微量的免疫沉淀反应应。4、定量定量检测检测体液中抗原或抗体成份。体液中抗原或抗体成份。.印迹法（印迹法（blotting）是指将）是指将样样品品转转移到固相移到固相载载体上，而后利体上，而后利用相用相应
109、应的探的探测测反反应应来来检测样检测样品的一种方法。品的一种方法。1975年，年，Southern建立了将建立了将DNA转转移到硝酸移到硝酸纤维纤维素膜（素膜（NC膜）膜）上，并利用上，并利用DNARNA杂杂交交检测检测特定的特定的DNA片段的方法，称片段的方法，称为为Southern印迹法。印迹法。而后人而后人们们用用类类似的方法，似的方法，对对RNA和蛋白和蛋白质进质进行印迹分析，行印迹分析，对对RNA的印迹分析称的印迹分析称为为Northern印迹法，印迹法，对单对单向向电电泳后的蛋白泳后的蛋白质质分子的印迹分析称分子的印迹分析称为为Western印迹法印迹法，对对双向双向电电泳后蛋白泳
110、后蛋白质质分子的印迹分析称分子的印迹分析称为为Eastern印迹法印迹法。4、免疫印迹法探、免疫印迹法探测测抗原分子抗原分子.先将先将样样品通品通过过凝胶凝胶电电泳，按分子量分离出一些条泳，按分子量分离出一些条带带，再将再将这这些条些条带转带转移到特殊的移到特殊的滤滤膜上，加抗体，使其在膜上膜上，加抗体，使其在膜上与其中的一个条与其中的一个条带带，即抗原，即抗原结结合，合，显显色。色。基本原理基本原理.优优点点 高分辨率的高分辨率的电电泳技泳技术术 特异敏感的抗原特异敏感的抗原- -抗体反抗体反应应 1-5ng 1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白.基本操作步基本操作步骤骤制制备样备样品
111、：如品：如样样品品为组织为组织，则则匀匀浆浆后离心。后离心。电电泳：最常用的是泳：最常用的是SDS电电泳，可泳，可测测定抗原的分子量。定抗原的分子量。电电泳条泳条带带的的转转移：将移：将电电泳胶上的蛋白泳胶上的蛋白质质条条带转带转移到移到滤滤膜上。最膜上。最常用的是硝酸常用的是硝酸纤维滤纤维滤膜。将膜。将电电泳胶和泳胶和滤滤膜膜层层叠，用叠，用滤纸滤纸包裹，包裹，放在放在电电泳泳转转移槽内，槽内放碱性的移槽内，槽内放碱性的转转移移缓缓冲液，通冲液，通电电后后带负电带负电的蛋白的蛋白质质便泳向便泳向带带正正电电的的滤滤膜，因此，胶面要面向阴极。膜，因此，胶面要面向阴极。转转移完移完毕毕后，将后，
112、将滤滤膜浸入含有抗体的封膜浸入含有抗体的封闭闭液中。封液中。封闭闭液内有非液内有非抗体蛋白（常用的是牛血清白蛋白，其作用是封抗体蛋白（常用的是牛血清白蛋白，其作用是封闭闭抗体和抗体和滤滤膜膜之之间间的的结结合）和皂化合）和皂化剂剂（如（如Tween-20，其作用是减少蛋白，其作用是减少蛋白质质分分子之子之间间的非共价的非共价结结合，包括抗体和非抗原蛋白之合，包括抗体和非抗原蛋白之间间的的结结合），合），以降低本底。以降低本底。加二抗以加二抗以显显示与一抗特异示与一抗特异结结合的抗原条合的抗原条带带。多种。多种标记标记的二抗可的二抗可供供选择选择.WesternBlot流程流程l蛋白蛋白样样品的
113、制品的制备备SDS-PAGE转转膜膜封封闭闭一抗一抗杂杂交交二抗二抗杂杂交交底物底物显显色色.间间接接WesternBlotting操作流程操作流程:.显显色方法色方法化学化学显显色法色法:方便、便宜、有毒、灵敏度方便、便宜、有毒、灵敏度较较低、低、费费抗体、反抗体、反应应慢、慢、线线性窄、不易保存、不能重新剥离性窄、不易保存、不能重新剥离检测检测化学化学发发光法光法:灵敏、快速、灵敏、快速、节节省抗体、反省抗体、反应应快、快、线线性性宽宽、无害、特异、无害、特异性高、可重新剥离性高、可重新剥离检测检测同位素法同位素法:灵敏度高、不安全、灵敏度高、不安全、环环境境污污染、不方便和半衰期短染、不
114、方便和半衰期短荧荧光底物法：光底物法：Krypton荧荧光底物光底物.（四）（四）电电生理学方法生理学方法1、细细胞外胞外纪录纪录(extracellularrecording):2、细细胞内胞内纪录纪录(intracellularsingleunitrecording)：3、电压钳电压钳（voltageclamp）4、膜片、膜片钳钳（patchclamp）5、脑电图脑电图(EEG)和和诱发电诱发电位（位（evokedpotential）.（1)阴极射阴极射线线示波器（示波器（oscillograph）：）：显显示示电电信号，信号，电电子流惰性小，是子流惰性小，是记录记录神神经经非非常短促和微
115、弱常短促和微弱电电流最好的方法。流最好的方法。（2）生物）生物电电放大器放大器(amplifier):生物生物电电信号信号电压电压很低，而且信号源内阻大，必很低，而且信号源内阻大，必须须加接加接一个具有以下性能的放大器才能在一个具有以下性能的放大器才能在荧荧光屏上光屏上显显示出清晰的波形。示出清晰的波形。频频率响率响应应范范围围大大（通（通频带频带从从0100kHz），有足），有足够够高的放大能力，低噪声，高高的放大能力，低噪声，高输输入阻抗，高的辨差入阻抗，高的辨差比。比。（3）电电子刺激器（子刺激器（electronicstimulator）:矩形脉冲：幅度（刺激矩形脉冲：幅度（刺激强强度
116、度:电压电压最大瞬最大瞬时值时值，0.01200V之之间间，连续连续可可调调）、波）、波宽宽（时间时间：10 s1s）、）、频频率率(波波宽宽和延和延迟时间迟时间之和小于之和小于频频率的倒数率的倒数)、延、延迟迟、刺激方式（、刺激方式（单单，连续连续，双脉冲刺激）、同步，双脉冲刺激）、同步输输出（触出（触发发其他需要与刺激同步的其他需要与刺激同步的仪仪器如示波器，微器如示波器，微电电泳，照相等一起工作、刺激泳，照相等一起工作、刺激隔离器（隔离器（insulator:减少刺激减少刺激伪伪迹使刺激迹使刺激伪伪迹与迹与电电位分开）。位分开）。（4）储储存和分析存和分析电电生理生理实验结实验结果的果的
117、仪仪器：器：示波器照相机、示波器照相机、录录音机、音机、计计算机（叠加，算机（叠加，直方直方图图，平均等，平均等)。常用的主要常用的主要仪仪器器. 电记录电记录的技的技术术(A) 细细胞外胞外记录记录法法记录记录法法记录单记录单个个细细胞或一群胞或一群细细胞的胞的电电活活动动。(B) 微微电电极极细细胞内胞内记录记录法法记录记录膜内外的膜内外的电电位差：静息位差：静息电电位和位和动动作作电电位。位。(C) 全全细细胞膜片胞膜片钳记录钳记录法法记录记录当膜上当膜上单单个通道开启或关个通道开启或关闭时闭时的的电电流。流。.工作原理工作原理：把引：把引导电导电极安放在神极安放在神经组织经组织的表面或
118、附近引的表面或附近引导导神神经组织经组织的的电电活活动动。由于活。由于活动动部位的神部位的神经经元元产产生去极化，未活生去极化，未活动动部位部位处处于正常极于正常极化状化状态态，在容，在容积导积导体中的两部位体中的两部位间电间电位不同，位不同，电电流从一点流向另外一流从一点流向另外一点。放置于点。放置于细细胞表面的胞表面的电电极会极会纪录纪录出两者出两者间间的的电电位差。位差。优优点点：方便，：方便，电电极不插入极不插入细细胞。胞。特点特点：细细胞外胞外电电位的波形因位的波形因记录细记录细胞的不同部位而异胞的不同部位而异这这种方法在神种方法在神经经科学科学领领域主要用于域主要用于检测检测神神经
119、动经动作作电电位位产产生的部位，生的部位，时时间间以及放以及放电电序列的序列的频频率与模式率与模式。1、细细胞外胞外纪录纪录ExtracellularRecording.CNS神神经经元元细细胞外胞外记录记录：在接受其他神在接受其他神经经元元传传来的来的兴奋兴奋性或抑制性的信息被激活后，性或抑制性的信息被激活后，可在所可在所记录记录神神经经元的被激活部位（元的被激活部位（电电穴）和穴）和该该神神经经元的其他部位（元的其他部位（电电源）源）间间形成局部形成局部电电流。流。玻璃微玻璃微电电极极:尖端直：尖端直：0.5 m; 电电极极电电阻：阻：520M ; 充灌液：充灌液：3mol/L KCI,
120、4mol/L NaCI, 2%旁胺天旁胺天蓝蓝，0.5mol/L醋酸醋酸钠钠溶溶液液pH7.7。钨丝钨丝金属微金属微电电极：极：尖端尖端4070 m, 电电阻低阻低，机械，机械强强度高，直接穿透硬度高，直接穿透硬脑脑膜，膜，电电噪声低，噪声低，可反复使用；可反复使用； 根据细胞外记录微电极处于电源或电穴的位置关系，能记录一个极性不同的电位，向下的（正电位）或向上的（负电位）。胞外胞外电电极极记录记录的的电电位大小和波形会有多位大小和波形会有多种种变变化。因此，重点分析放化。因此，重点分析放电频电频率和潜率和潜伏期，而不去比伏期，而不去比较较放放电电的幅度。的幅度。.常用的几种常用的几种细细胞外
121、胞外记录记录方法：方法：单单个神个神经细经细胞胞电电活活动动的的记录记录神神经纤维电经纤维电活活动动的的记录记录：非：非线线性分析、神性分析、神经经信息信息传导传导方方式、慢性痛信号的研究式、慢性痛信号的研究 在提示在提示显显微微镜镜放大条件下，通放大条件下，通过过精心修磨的游精心修磨的游丝丝镊镊在石蜡油槽中在石蜡油槽中轻轻巧撕去巧撕去严严密包密包围围神神经经干的外膜，然后干的外膜，然后逐条撕离神逐条撕离神经细经细束，再将分离的神束，再将分离的神经细经细束的一端束的一端悬悬挂在挂在单单根或双根根或双根铂铂金金丝丝引引导电导电极上。极上。经过经过放大器将神放大器将神经纤维经纤维的放的放电电脉冲脉
122、冲显显示在示波器上，并示在示波器上，并经过计经过计算机分析算机分析处处理。理。.神神经经干干电电活活动动的的记录记录是是记录记录神神经经干内干内许许多神多神经纤维动经纤维动作作电电位的复合位的复合 双向和双向和单单向向动动作作电电位位 记录电记录电极：极：可分可分为单为单极极记录记录和双极和双极记录记录 单单极极记录记录：一极接地，一极接触神一极接地，一极接触神经经干。干。记录记录到的到的电电信信号反映号反映电电极接触部位与大地的极接触部位与大地的电电位差。位差。 双极双极记录记录：两极都与神两极都与神经经干接触，干接触，记录记录到的到的电电信号反映信号反映两两电电极接触部位的极接触部位的电电
123、位差。位差。.单单极极记录记录双极双极记录记录或或两两电电极极间间距很近距很近时时两两电电极极间间距距较远时较远时记录仪记录仪记录仪记录仪.阴极刺激原阴极刺激原则则兴奋总兴奋总是是发发生在阴极生在阴极电电极下方，极下方，阳极下方甚至出阳极下方甚至出现现超超级级化化 刺激器刺激器.双向双向动动作作电电位位的形成机理的形成机理神神经经局部阻滞后局部阻滞后单单向向动动作作电电位的形成机理位的形成机理.工作原理：工作原理：在膜两在膜两侧侧各置一个各置一个电电极形成一极形成一个回路，个回路，记录记录膜膜电电位（位（membrane potential）：）：EPSP, IPSP，动动作作电电位。位。优优
124、点点: 准确准确测测量膜量膜电电位的位的绝对值绝对值， 因膜内因膜内到膜外到膜外电电阻很大阻很大,值值可高达可高达100mV。意意义义：是研究神是研究神经经元基本生物物理特性的元基本生物物理特性的有效手段。有效手段。关关键问题键问题（成功而持久的胞内（成功而持久的胞内记录记录）：）：1）稳稳定：排除机械和定：排除机械和动动物呼吸和循物呼吸和循环环功能功能引起的运引起的运动动；2）合格的玻璃微）合格的玻璃微电电极。尖端口径小于极。尖端口径小于0.5 m。管内充灌。管内充灌3mol/LKCl或或2mol/L醋酸醋酸钾钾。2、细细胞内胞内纪录纪录IntracellularSingleUnitReco
125、rding(Hodgkin and Huxley). 由于插入神由于插入神经经元内胞体并元内胞体并记录细记录细胞内胞内电电位的微位的微电电极技极技术术的的发发展，展，Eccles等首先将微等首先将微电电极插入脊髓运极插入脊髓运动动神神经经元的胞体，元的胞体，记录记录哺乳哺乳类动类动物脊髓物脊髓的大运的大运动动神神经经元胞内元胞内电电位。位。运运动动神神经经元的胞体直径元的胞体直径70 m;微微电电极尖端直径极尖端直径0.5 m；跨膜跨膜电电位差位差6080mV。.图7.3：用微电极在猫脊髓运动神经元内记录的突触后突触后电电位位A.B.C:三种不同的阈下刺激(40秒扫描的叠加)； D:10次刺激
126、引起的峰电位。图7.2：枪乌贼星状神经节的突触前纤维表现的动动作作电电位位和在突触后神经元诱发的局部局部电电位位。. 20世世纪纪50年代，年代，Hodgkin and Huxley 首次首次应应用用电压钳电压钳技技术对枪乌贼术对枪乌贼的的标标本本进进行膜行膜电电流的流的测测定。定。工作原理：工作原理：离子流离子流过过通道所形成的离子流是形成通道所形成的离子流是形成动动作作电电位的基位的基础础。电电生理生理实实验验以以电电流作流作为为刺激源，使可刺激源，使可兴奋细兴奋细胞胞产产生生兴奋兴奋，然后，然后测测定其膜定其膜电压电压以确定离子以确定离子通道的状通道的状态态。但在形成。但在形成动动作作电
127、电位位时时所所产产生的离子流可影响膜生的离子流可影响膜电电位，而膜位，而膜电电位的位的变变化又会影响化又会影响该该离子的通透性的离子的通透性的变变化。因而，化。因而，须须人人为为地使膜地使膜电电位在一定位在一定时间时间内内维维持在一个固定水平。持在一个固定水平。电压钳电压钳技技术术是通是通过过插入插入细细胞内的一根微胞内的一根微电电极人极人为为向胞内向胞内补补充充电电流，流，补补充的充的电电流正好等于跨膜流出的反向离子流正好等于跨膜流出的反向离子电电流（大小相等方向相反）流（大小相等方向相反）。意意义义 ：1）确保膜通透性）确保膜通透性发发生改生改变时变时，控制膜，控制膜电电位始位始终维终维持
128、在指令持在指令电电位的水平位的水平（不（不变变）；）；2）通）通过电过电流流检测检测装置，装置，记录记录到到补补充入胞内的注入充入胞内的注入电电流，它相当于流，它相当于离子离子电电流的反相流的反相电电流。流。这样这样可可测测定在不同膜定在不同膜电电位水平的离子位水平的离子电电流，从而了解膜流，从而了解膜通道的通道的电导电导及功能活及功能活动动。3、电压钳电压钳voltageclamp. 20世世纪纪50年代，年代，Hodgkin and Huxley 首次首次应应用用电压钳电压钳技技术对枪乌贼术对枪乌贼的的标标本本进进行膜行膜电电流的流的测测定。定。工作原理：是用工作原理：是用负负反反馈馈放大
129、器，在放大器，在监测监测到瞬到瞬时时膜膜电电位与位与设设定的指令定的指令电压电压有差有差异异时时，向，向细细胞内注入相胞内注入相应应极性的极性的电电流使之恢复到指令流使之恢复到指令电压电压水平，从而保持膜水平，从而保持膜电电位不位不变变（电压钳电压钳），而），而记录记录到的注入到的注入电电流流应应与引起膜与引起膜电电位波位波动动的跨膜离子的跨膜离子电电流流大小相等、方向相反。大小相等、方向相反。意意义义 ：1）确保膜通透性）确保膜通透性发发生改生改变时变时，控制膜，控制膜电电位始位始终维终维持在指令持在指令电电位的水平位的水平（不（不变变）；）；2）通）通过电过电流流检测检测装置，装置，记录记
130、录到到补补充入胞内的注入充入胞内的注入电电流，它相当于流，它相当于离子离子电电流的反相流的反相电电流。流。这样这样可可测测定在不同膜定在不同膜电电位水平的离子位水平的离子电电流，从而了解膜流，从而了解膜通道的通道的电导电导及功能活及功能活动动。3、电压钳电压钳voltageclamp.电压钳电压钳装置装置图图在在枪乌贼枪乌贼大大纤维纤维内内纵纵向插入两向插入两根根细铂丝细铂丝，一根，一根记录电压记录电压E E （V V电电极），另一根极），另一根记录电记录电流流I I （I I电电极）。当信号从此极）。当信号从此V V电电极极输输入入到一个高到一个高频频响响应应反反馈馈放大器放大器时时（A A
131、FBFB）就有）就有电电流流输输出到插入出到插入枪枪乌贼轴乌贼轴突内的突内的I I电电极。当来自极。当来自轴轴突内的突内的电电极极电电位（即膜位（即膜电电位）位）与与钳钳制制电压电压不在同一不在同一电电位水平位水平时时，则则在放大器两端即有在放大器两端即有电电位位差，放大器即向差，放大器即向轴轴突突输输出出电电流，流，以使以使轴轴突的突的电压维电压维持于持于预预置的置的钳钳制制电压电压水平，水平，这这是一个是一个负负反反馈过馈过程。程。.内内内内尔尔尔尔(Neher)(Neher)萨萨萨萨克曼克曼克曼克曼(Sakmann)(Sakmann)1976年德国年德国马马普生物物理化学研究所普生物物理
132、化学研究所Neher和和Sakmann合作合作发发明了膜明了膜片片钳钳技技术术，并，并应应用用这这一技一技术术首次在青蛙肌首次在青蛙肌细细胞上胞上记录记录到到Ach激活的激活的单单通通道离子道离子电电流流。二人共二人共获获1991年年诺贝诺贝尔尔生理学与医学生理学与医学奖奖。4、膜片、膜片钳钳PatchClamp.用微玻管用微玻管电电极极接触接触细细胞膜，以吉胞膜，以吉欧姆（欧姆（G）以上）以上的阻抗使之封接，的阻抗使之封接，使使电电极开口极开口处处的的细细胞膜与其周胞膜与其周围围膜在膜在电电学上学上绝缘绝缘，在此，在此基基础础上固定上固定电电位，位，对对此膜片上离子通此膜片上离子通道的道的电
133、电流流进进行行监测监测记录记录的方法。的方法。.Patchclamp镜镜下下观观. 膜片膜片膜片膜片钳钳钳钳的基本工作原理的基本工作原理的基本工作原理的基本工作原理同同电压钳电压钳，即在人，即在人为设为设置置电压电压并并固定的情况下固定的情况下记录记录分析离子通道。分析离子通道。膜片膜片钳钳技技术术使用玻璃微使用玻璃微电电极吸管把极吸管把只含只含1-3个离子通道、面个离子通道、面积为积为几个几个mm2的的细细胞膜通胞膜通过负压过负压吸引封接起吸引封接起来。由于来。由于电电极尖端与极尖端与细细胞膜表面形胞膜表面形成成紧紧密封接，其密封接，其电电阻阻值值可达数个或可达数个或数十个千兆欧，也称巨阻封
134、接。数十个千兆欧，也称巨阻封接。实实际际上将吸附在上将吸附在电电极尖端下的那片膜极尖端下的那片膜与膜的其他部分从与膜的其他部分从电电学上完全隔离学上完全隔离开。由于开。由于紧紧密封接密封接显显著降低了著降低了记录记录中的背景噪声，提高了信噪比，因中的背景噪声，提高了信噪比，因而可以而可以记录记录到小片膜上到小片膜上仅仅有几个有几个pA的的单单个通道个通道电电流。然后将膜流。然后将膜电电位位钳钳制到不同水平，制到不同水平，记录电记录电流的流的变变化，化，便可分析离子通道的功能。便可分析离子通道的功能。.膜片膜片钳钳与与电压钳电压钳的区的区别别膜片膜片钳钳 电压钳电压钳相同点相同点都是通都是通过钳
135、过钳制膜制膜电电位而位而记录记录离子通道离子通道电电流流不同点不同点钳钳制方法不同制方法不同高阻封接高阻封接细细胞内插入胞内插入电电极极所用所用电电极不同极不同低阻抗低阻抗电电极极2-15M2-15M高阻抗高阻抗电电极极10-100M10-100M钳钳制面制面积积不同不同小片膜小片膜整个或大整个或大块细块细胞膜胞膜记录记录的通道数不同的通道数不同一个或几个一个或几个所有通道所有通道. 根据根据实验实验要求，可要求，可组组建不同的建不同的实验实验系系统统。但也。但也有一些共同的基本有一些共同的基本组组成部成部件，其中包括件，其中包括电电子学部件子学部件: :放大器；放大器；计计算机接口，数据采集
136、、分算机接口，数据采集、分析系析系统统。光学部件和光光学部件和光电电接口接口：显显微微镜镜；监视监视器等。器等。机械系机械系统统: :防震台等。防震台等。辅辅助系助系统统：电电极拉制器；极拉制器；切片机；孵育槽；灌流系切片机；孵育槽；灌流系统统等等膜片膜片钳记录钳记录的常用的常用设备设备.倒置倒置显显微微镜镜、微操、微操纵纵器、器、给药给药系系统统、防震工作台等、防震工作台等.膜片膜片钳钳放大器、数据采集装置、放大器、数据采集装置、计计算机、采集分析算机、采集分析软软件等件等.EPC-7EPC-7膜片膜片钳钳放大器放大器( (德国德国) ).电电极拉制极拉制仪仪，抛光，抛光仪仪等等.前面两部分
137、介前面两部分介绍绍了膜片了膜片钳钳技技术术的原理及膜片的原理及膜片钳钳的系的系统组统组成，在此基成，在此基础础上本部分上本部分简简要介要介绍绍：膜片膜片钳钳放大器的工作模式放大器的工作模式膜片膜片钳钳的的记录记录方式方式膜片膜片钳实验钳实验基本基本过过程程膜片膜片钳记录钳记录的信息的信息.膜片膜片钳钳放大器的工作模式：放大器的工作模式：(1).(1).电压钳电压钳模式：模式：在在钳钳制制细细胞胞膜膜电电位的基位的基础础上改上改变变膜膜电电位，位，记录记录离子通道离子通道电电流的流的变变化，化，记录记录的是的是诸诸如通道如通道电电流；流；EPSC;IPSCEPSC;IPSC等等电电流信号流信号。
138、是膜片。是膜片钳钳的基本工作模式的基本工作模式. .(2).(2).电电流流钳钳模式模式: :向向细细胞内注入胞内注入刺激刺激电电流，流，记录记录膜膜电电位位对对刺激刺激电电流流的反的反应应。记录记录的是的是诸诸如如动动作作电电位，位，EPSP;IPSPEPSP;IPSP等等电压电压信号。信号。.膜片膜片钳钳的基本的基本记录记录模式模式细细胞膜上所有通道：胞膜上所有通道：全全细细胞式胞式Whole-cellrecordin细细胞膜上胞膜上单单通道：通道：细细胞胞贴贴附式附式Cell-attached/oncellmode内面向外式内面向外式Inside-outmode外面向外式外面向外式Out
139、side-outmode.紧紧密封接密封接细细胞外表面（浴液）胞外表面（浴液）细细胞内表面（浴液）胞内表面（浴液）.将将电电极尖端的膜片打穿，极尖端的膜片打穿，电电极内液与极内液与细细胞内液交胞内液交换换。在在电压钳电压钳制模式下，制模式下，记录记录整个整个细细胞的胞的电电流和不同的离子流和不同的离子通道通道电电流流在在电电流流钳钳制模式下，制模式下，记录记录膜膜电电位和位和动动作作电电位位是最常用的是最常用的记录记录方式方式可以可以进进行行细细胞外胞外给药给药或将或将药药物加到物加到电电极液中，极液中，进进行行细细胞胞内内给药给药。缺点：破膜后，随着胞内成分（如第二信使）向缺点：破膜后，随着
140、胞内成分（如第二信使）向电电极的极的流失，所流失，所记录记录到的到的电电流出流出现缓现缓慢的衰退。慢的衰退。为为弥弥补这补这种缺种缺点可以在点可以在电电极内液中加入极内液中加入ATP、cAMP等。等。全全全全细细细细胞式胞式胞式胞式记录记录记录记录：Whole-cellrecordingWhole-cellrecording.电电极极仅仅与与细细胞膜很小部分形成胞膜很小部分形成Giga-seal,不不损损害害细细胞膜的完胞膜的完整性整性;膜片小，噪声极低，适合膜片小，噪声极低，适合单单通道通道记录记录（single-channelrecording)某一特定的离子通道某一特定的离子通道细细胞不
141、同部位的胞不同部位的电电流流缺点：无法缺点：无法记录记录到静息膜到静息膜电电位，但可在位，但可在实验结实验结束后破膜束后破膜补补充充记录记录。细细胞胞贴贴附式：附式：Cell-attached.细细胞膜内胞膜内侧侧暴露在浴槽溶液中暴露在浴槽溶液中用于用于单单通道通道记录记录（single-channelrecording)可方便地通可方便地通过过改改变变浴槽灌流液（浴槽灌流液（此此时时相当于相当于细细胞内液胞内液）来了解来了解药药物物对对离子通道的影响离子通道的影响常用于研究常用于研究钙钙、细细胞内源性物胞内源性物质质及第二信使及第二信使对对离子通道离子通道的影响的影响内面向外式：内面向外式：
142、内面向外式：内面向外式：Inside-outInside-out.细细胞膜外胞膜外侧侧暴露在浴槽溶液中暴露在浴槽溶液中可方便地通可方便地通过过改改变变外液来了解外液来了解药药物物对对离子通道的影响离子通道的影响常用于研究常用于研究钙钙、细细胞内源性物胞内源性物质质及第二信使及第二信使对对离子通道的离子通道的影响影响外面向外式：外面向外式：外面向外式：外面向外式：Outside-outOutside-out.膜片膜片钳实验钳实验的基本的基本过过程：程：1 1、液体配制：主要根据研究通道的不同，配制相、液体配制：主要根据研究通道的不同，配制相应应的液体，基本原的液体，基本原则则是保持两个平衡：渗透
143、是保持两个平衡：渗透压压平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必须过滤须过滤。2.2.标标本制本制备备3.3.记录记录4 4、资资料分析：料分析：（1 1）一般）一般电电学性学性质质：通：通过过I-VI-V关系关系计计算算单单通道通道电导电导，观观察通道有无察通道有无整流。通整流。通过过离子离子选择选择性、翻性、翻转电转电位或其它通道激活条件初步确定通位或其它通道激活条件初步确定通道道类类型。（型。（2 2）动动力学：开放力学：开放时间时间、开放概率、关、开放概率、关闭时间闭时间、通道的、通道的时时间间依依赖赖性失活、开放与关性失活、开放与关闭类闭类型（簇状猝型（簇
144、状猝发发（BurstBurst）样样开放与开放与闪动闪动样样短短暂暂关关闭闭（flickeringflickering），化学），化学门门控性通道的开、关速率常数等。控性通道的开、关速率常数等。（3 3）通）通过对过对全全细细胞激活曲胞激活曲线线或失活曲或失活曲线线的分析，可得到半数激活或的分析，可得到半数激活或失活失活电压电压VhVh及斜率因子及斜率因子K K。（。（4 4）药药理学：阻断理学：阻断剂剂、激、激动剂动剂或其它或其它调调制因素制因素对对通道活通道活动动的影响。的影响。 （5 5）综综合分析得到最后合分析得到最后结论结论。 .10M10Ma膜片膜片钳钳使用的使用的标标本本 1.1
145、.单细单细胞：胞：急性分散细胞和培养细胞2.2.脑脑片或片或组织块组织块。要求：要求：膜片钳80%的工夫在于制备细胞。细胞表面要干净,不能有胶质细胞等蛋白质物质。细胞状态良好，表面光滑，无麻斑，无肿胀或皱缩。脑片单细胞.全全细细胞胞记录记录的操作步的操作步骤骤1拉制玻璃拉制玻璃电电极极2灌注灌注电电极液，安装极液，安装电电极极3在在显显微微镜镜下找到微下找到微电电极，移极，移动动三三维维操操纵仪纵仪，使，使电电极极尖端接触尖端接触细细胞胞4用用负压轻轻负压轻轻抽吸，抽吸，钳紧细钳紧细胞，形成全胞，形成全细细胞胞记录记录模式模式5给给予一定的予一定的钳钳制制电压电压并并观观察察电电流流.电电极液
146、的的拉制和充灌极液的的拉制和充灌:无气泡无气泡充灌玻璃充灌玻璃电电极极长长度的度的1/3.微微电电极的安装极的安装.Patchclamp镜镜下下观观.全全细细胞胞记记录录的的形形成成过过程程.电电流信号流信号单单通道通道电电流流全全细细胞胞电电流流突触突触电电流流电压电压信号信号阈电阈电位位静息静息电电位位动动作作电电位位膜片膜片钳记录钳记录的信息的信息电压钳电压钳模式模式电电流流钳钳模式模式.膜片膜片钳钳技技术术的的应应用用 由于膜片由于膜片钳钳技技术术不不仅仅可以可以观观察离子察离子单单通道通道电电流，而且有流，而且有多种模式可以方便地多种模式可以方便地对细对细胞胞进进行行电压钳电压钳制和
147、制和电电流流钳钳制，制，观观察察各种离子通道的各种离子通道的电电流，流，检测检测体内源性活性物体内源性活性物质质和外源性和外源性药药物、物、毒物等毒物等对对离子通道离子通道电电流的影响，因此，流的影响，因此，现现已广泛已广泛应应用于生理用于生理学、学、药药理学、生理学、生经经生物学、生物物理学、生物学、生物物理学、临临床心血管内外科、床心血管内外科、神神经经内外科、耳鼻喉科、毒理学等生命科学内外科、耳鼻喉科、毒理学等生命科学领领域。域。.细细胞特性的研究胞特性的研究离子通道的离子通道的鉴别鉴别电压门电压门控性离子通道的控性离子通道的动动力学特性研究力学特性研究突触突触联联系、突触系、突触传递传
148、递的研究：突触后的研究：突触后电电流流疾病机制研究疾病机制研究:离子通道结构和功能的异常可导致离子通道病药药物物筛选筛选:膜片钳已成为抗心率失常药物筛选的金标准。细细胞的胞吐与胞吞功能胞的胞吐与胞吞功能测测定：定：几乎所有细胞的脂质双层膜其电容均为1F/cm2，因此通过测定膜电容可精确反映细胞表面积的变化。.脑电图脑电图（Electroencephalogram，EEG）是指在人）是指在人或其他或其他动动物物颅颅骨表面安置骨表面安置电电极，极，记录记录大大脑脑整体整体电电活活动动的的电电生理生理记录记录方法。方法。1924年德国年德国HansBerger第一次第一次纪录纪录人人类脑电图类脑电图
149、。严严格来格来讲讲，人，人们们通常所通常所说说的的EEG特指特指记录记录到大到大脑脑皮皮质质的的综综合合电电位。位。EEG产产生的原理是由于生的原理是由于脑脑内大量神内大量神经经元元（如皮（如皮质质和和锥锥体神体神经经元元）树树突排列方向一致，突排列方向一致，这这些些神神经经元元兴奋产兴奋产生的突触后生的突触后电电位在位在细细胞外胞外总总和形成和形成EEG。5、脑电图脑电图与与诱发电诱发电位位.双极或双极或单单极引极引导导法法:将引将引导电导电极放在极放在颅颅骨表面之上，骨表面之上，记录记录脑脑活活动时动时微弱微弱电电流，通流，通过过强强力放大力放大记录记录出来的出来的电电位成位成为脑为脑电图
150、电图（EEG）。）。单单极引极引导导可更好地确定可更好地确定电电信号的信号的发发源地，源地，有利于有利于临临床病灶床病灶诊诊断定位。断定位。正常正常脑电图脑电图： ， 两种两种节节律。律。优优点：是点：是对对大大脑电脑电活活动动的直接的直接测测量，而且是无量，而且是无创创的，有的，有较较好的好的时间时间分辨率，可以分辨率，可以应应用于多种不同用于多种不同环环境。境。缺点：由于缺点：由于电电信号很弱（信号很弱（V级级），信噪比），信噪比较较低，易被低，易被头头部部运运动动、身体肌肉运、身体肌肉运动动等造成的等造成的伪伪迹所淹没。迹所淹没。.自自发脑电发脑电波形波形2.波波：波波频频率率约为约为1
151、3-30Hz，振幅振幅约为约为5-20V，是一种是一种快波，快波，波的出波的出现现一般意味着大一般意味着大脑脑比比较兴奋较兴奋。3.波波：波波频频率率为为4-8Hz，振幅振幅约为约为10-50V，它是在困倦它是在困倦时时，中枢神，中枢神经经系系统处统处于抑制状于抑制状态时态时所所记录记录的波形。的波形。4.波波：在睡眠、深度麻醉、缺氧或大：在睡眠、深度麻醉、缺氧或大脑脑有器有器质质性病性病变时变时出出现现，频频率率为为1-3.5Hz，振幅振幅为为20-200V。1.波波：可在：可在头颅头颅枕部枕部检测检测到，到，频频率率8-13Hz，振幅振幅20-100V，它是它是节节律性律性脑电脑电波中最明
152、波中最明显显的波。的波。.图：正常成年人的典型脑电图注意节律在头的后部占优势.影响影响脑电图脑电图的因素：的因素：1. 神神经细经细胞代胞代谢谢（缺氧、低血糖和酒精）：（缺氧、低血糖和酒精）：脑脑电图电图出出现现慢慢节节律，律，电压电压降低。降低。2. 药药物：抗物：抗痉挛药痉挛药，麻醉，麻醉药药：乙：乙醚醚，巴比妥，巴比妥盐盐。EEG与知与知觉觉水平相关；水平相关；3. 睡眠：睡眠：EEG变变化非常复化非常复杂杂。. 诱发电诱发电位（位（EP）又叫事件相关）又叫事件相关电电位（位（event related potential, ERPevent related potential, ERP
153、）。它是）。它是指中枢神指中枢神经经系系统对统对感感觉觉刺激的直接刺激的直接电电反反应应。 与与EEGEEG相比，其相比，其产产生的基生的基础础是一是一样样的，都是由突触后的，都是由突触后电电位位总总和的和的结结果。所不同果。所不同的是，的是，EEGEEG是外界是外界环环境安静情况下境安静情况下记录记录的大的大脑脑自自发发活活动动，而，而ERP则则是保持某种外是保持某种外界刺激界刺激记录记录到的到的脑电诱发脑电诱发活活动动。 性性质质：慢：慢电电位位变变化，主要是突触后化，主要是突触后电电位位总总和而成。和而成。波幅一般在波幅一般在0.1200.120 V V之之间间。由于波幅小，多在由于波幅
154、小，多在自自发发放放电电的背景上的背景上产产生生诱发电诱发电位。位。 平均平均诱发电诱发电位（位（AEP）：）：诱发电诱发电位出位出现现与施加的刺激有一定与施加的刺激有一定时间时间关系。相同关系。相同实实验验条件下，同一系条件下，同一系统统，潜伏期的，潜伏期的长长短是恒定的。用短是恒定的。用计计算机平均叠加技算机平均叠加技术术把多次反把多次反应应的微弱的微弱电电信号叠加起来，使其从背景信号叠加起来，使其从背景电电波中清晰地波中清晰地记录记录。 临临床床应应用：听用：听觉诱发电觉诱发电位，位，视觉诱发电视觉诱发电位，躯体感位，躯体感觉诱发电觉诱发电位，从其中相关波位，从其中相关波形的形的变变化判
155、定化判定该该感感觉传导觉传导途径中特定部位的功能改途径中特定部位的功能改变变.诱发电诱发电位位 EvokedPotential.躯体感躯体感觉诱发电觉诱发电位位:在躯体感在躯体感觉觉系系统统中，从楔中，从楔核、丘核、丘脑脑和皮和皮层层可可记录记录到到刺激外周神刺激外周神经经引起的反引起的反应应。刺激右刺激右侧侧上肢皮肤在左上肢皮肤在左侧侧中央后回中央后回纪录纪录的的诱发电诱发电位位.（五）（五）分子生物学方法分子生物学方法聚合聚合酶酶链链式反式反应应(polymerasechainreactionPCR). PCR（PolymeraseChainReaction)技技术术即聚合即聚合酶酶链链反
156、反应应，又称又称DNA体外体外扩扩增技增技术术。是指在是指在DNA聚合聚合酶酶催化下，以母催化下，以母链链DNA为为模板，以特定引物模板，以特定引物为为延伸起点，通延伸起点，通过变过变性、退火、延伸等性、退火、延伸等步步骤骤，体外复制出与母，体外复制出与母链链模板模板DNA互互补补的子的子链链DNA的的过过程。程。简单简单的的说说，PCR就是利用就是利用DNA聚合聚合酶酶对对特定基因做体外或特定基因做体外或试试管内的大管内的大量合成。量合成。1985年由美国年由美国PE-Cetus公司的公司的Mullis等人等人发发明的一种具有划明的一种具有划时时代意代意义义的分子生物学技的分子生物学技术术，
157、被誉，被誉为为无无细细胞分子克隆。胞分子克隆。 聚合聚合酶酶链链式反式反应应.加加热热使双使双链链DNADNA解开螺旋解开螺旋在退火温度条件下引物同模板在退火温度条件下引物同模板DNADNA杂杂交交在在Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶，dNTPsdNTPs，MgMg2+2+和合适和合适pHpH缓缓冲液冲液存在条件下延伸引物存在条件下延伸引物重复上述重复上述变变性性退火退火引物延伸引物延伸过过程至程至25-4025-40个个循循环环。靶序列被靶序列被扩扩增上百万倍，达到体外增上百万倍，达到体外扩扩增核酸序增核酸序列的目的。列的目的。热变性（94度）引物退火（55度）延伸（72度）DNA聚
158、合酶dNTP基本原理基本原理.变性退火引物.经经2530次循次循环环，目的目的DNA增加增加106-7.PCR反反应应的特点的特点灵敏度高灵敏度高1.皮克皮克(pg=10-12g)量量级扩级扩增到微克增到微克(ug=10-6g)水平水平2.能从能从100万个万个细细胞中胞中检检出一个靶出一个靶细细胞胞3.病毒病毒检测检测的灵敏度可达的灵敏度可达3个个RFU4.细细菌菌检测检测的最小的最小检检出率出率为为3个个细细菌菌简简便、快速便、快速1.一次性加好反一次性加好反应应液，液，2-4小小时时完成完成扩扩增增2.扩扩增增产产物一般用物一般用电电泳分析泳分析适用适用样样品的广泛性品的广泛性血液、体腔
159、液、洗嗽液、毛血液、体腔液、洗嗽液、毛发发、细细胞、活胞、活组织组织等等组织组织的的粗提粗提DNA.一一. .研究研究基因克隆，基因克隆，DNADNA测测序，分析突序，分析突变变二二. .诊诊断断细细菌、病毒、寄生虫菌、病毒、寄生虫检测检测，诊诊断断三三. .人人类类基因基因组组工程工程遗传图谱遗传图谱的构建，的构建，DNADNA测测序，表达序，表达图谱图谱四四. .法医法医犯罪犯罪现场标现场标本分析本分析五五. .肿肿瘤瘤各种各种肿肿瘤瘤检测检测六六. .其他其他PCRPCR技技术术的的应应用用.（六）（六）脑脑功能性磁共振成像功能性磁共振成像术术 MagneticResonaceImaging功能性磁共振成像技功能性磁共振成像技术检测视术检测视皮皮层层的功能活的功能活动动A 未刺激未刺激时组织时组织的去氧血的去氧血红红蛋白比例高；蛋白比例高；B. 刺激后刺激后组织组织氧合血氧合血红红蛋白增高；蛋白增高；C. 视觉视觉刺激后刺激后脑脑影像影像视视皮皮层层活活动动区。区。.此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！感谢你的观看！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！感谢你的观看！
