基因工程工具酶

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1、 基基 因因 工工 程程工工 具具 酶酶基因工程工具酶基因工程工具酶 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNADNA进而降解非己进而降解非己DNADNA的防御工具。的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。最好的

2、基因工程工具。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶( (如限制性如限制性核酸内切酶，连接酶，核酸内切酶，连接酶，DNADNA聚合酶等聚合酶等) )作为工具对基因进行人工切割，拼接作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶工具酶”。工具酶是对野生菌株。工具酶是对野生菌株（或（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开发成产随着越来越多的酶分子被发现，许

3、多厂商已将其克隆并开发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。拓宽了研究领域。 本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。基因工程工具酶基因工程工具酶 限制性内切酶 甲基化酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶 DNA连接酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction enzyme)(restriction enzyme)细菌的限制细菌的限制修饰作用和限制性内切酶的发现修饰作用和限制性内切酶的发现限制性内切酶的分类限制性内切酶的

4、分类限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的性质及切割特点限制性内切酶的性质及切割特点限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用细菌的限制细菌的限制修饰作用和限制性内切酶的发现修饰作用和限制性内切酶的发现 1 1、细胞的限制、细胞的限制修饰作用修饰作用 5050年代后年代后LuriaLuria和和Human(1952) Human(1952) BertaniBertani和和Weigle(1953)Weigle(1953)发发现细菌的现细菌的“限制限制”现象：现象：Phage（k）感染感染E.colik

5、不不感染感染E.coliB【E.coliB限制限制（k）】 仍有少量仍有少量(K)(K)可在可在 E.coliE.coli B B中生存，是因中生存，是因 E.coliE.coli B B对对(K)(K)进行进行了修饰。了修饰。E.coliE.coli B B修饰修饰(k)(k)* *(k)(k)感染感染E.coli(BE.coli(B) )细菌如何对细菌如何对噬菌体进行限制和修饰。噬菌体进行限制和修饰。2 2、细菌的限制、细菌的限制修饰系统修饰系统 19621962年年W.ArberW.Arber( (瑞士瑞士) )发现，寄主对噬菌体的修饰是在发现，寄主对噬菌体的修饰是在PhagePhage

6、入的入的DNADNA上。上。 19651965年，年，ArberArber发现修饰与发现修饰与的降解有关，提出：细胞中存在位点特的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制修饰系统。修饰系统。R-MR-M系统是细系统是细菌安内御外的积极措施。菌安内御外的积极措施。 3 3、限制性内切酶的发现、限制性内切酶的发现 19681968年年LinnLinn和和ArberArber从从E.coliE.coli B B中发现限制酶中发现限制酶, ,M.MeselsonM.Meselson和和R.yuanR.yuan从从E.coliE

7、.coli K K中分离到另一限制性的内切酶。中分离到另一限制性的内切酶。 19701970年年Smith (Smith (美美) )在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶。 限制酶的功能：降解不同源限制酶的功能：降解不同源DNADNA，而不降解同源而不降解同源DNADNA。 19781978年年W.ArberW.Arber、H.O.Smith(H.O.Smith(美美) )，NathansNathans( (美美) )因发现限制性内切因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。 限制性内切酶的分类：

8、限制性内切酶的分类： 目前已发现的限制酶有三大类：目前已发现的限制酶有三大类：限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名EcoRIEscherichia属名属名Coli种类种类Ry13株系株系编号编号 若若种种名名头头2 2个个字字母母相相同同则则其其中中一一个个可可用用种种名名的的第第一一和和第第三个字母。三个字母。限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的活性单位 50l 50l BufferBuffer中中，含含1g1g底底物物DNADNA，于于最最适适反反应应条条件件和和温温度度下下，保保温温1 1小小时时，能能使使1g 1g DNADNA完完全全降降解解所所需需的的酶酶蛋蛋白白量量即即为为一一个

9、个酶酶单单位位，用用U U表表示示。（bufferbuffer：pH=8.0pH=8.0，50mmol/L 50mmol/L Tris-HClTris-HCl，10mmol/L 10mmol/L MgClMgCl2 2 ，1mmol/L DTT1mmol/L DTT或巯基乙醇，或巯基乙醇，100g BSA/ml100g BSA/ml）限制性内切酶的性质及切割特点限制性内切酶的性质及切割特点 1 1、裂解产物均具有、裂解产物均具有33羟基和羟基和55磷酸残基，磷酸残基，5P-N N5P-N NNNNNNN-OH 3NN-OH 3。 2 2、识别序列及切点的高度专一。识别序列及切点的高度专一。EC

10、ORI5GAATTC33CTTAAG5BamHIGGATCCCCTAGG3 3、有三种不同裂解方式：、有三种不同裂解方式：a.平齐未端平齐未端环形环形DNA:如如Hind、Hpa、Sma、Alu、Hae。CCCGGG3.3GGGCCC5.CCCGGG33GGGCCCb.5粘性末端粘性末端GAATTC33CTTAAGG5AATTC33CTTAA5G如如Ecolc. 3c. 3粘性末端粘性末端如如 PstPstCTGCAG33GACGTCCTGCAG33GACGTC同裂酶同裂酶(isoschizomer)1. 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种定义：能识别相同序列但来源不同的两种 或多种限

11、制或多种限制 酶酶2. 2. 特点：特点：1 1）识别相同顺序）识别相同顺序 2 2）切割位点的异同）切割位点的异同 KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstIICCGCGGSacIICCGCGGSmaICCCGGGXmaICCCGGG同同尾尾酶酶如：如：BamHIGGATCC BglIIAGATCT MboI,Sau3AINGATCN上述几种限制酶产生的上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形片段仍可相连，由此形成的重组分子能被成的重组分子能被MboI和和Sau3AI识别和酶切，但识别和酶切，但BamHI和和BglII的识别机率只有的识别机率只有1/16。 BamHI+Mb

12、oIA/C/G/TGATCT/C/G/A BamHI和和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。连后不能为两种酶所识别和酶切。 BamHI+BglIIA/GGATCT/C限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的反应条件 1 1、底物、底物 DNADNA a a. DNA . DNA 纯度纯度: RNA : RNA 与与 E E 结合影响有效酶浓度；结合影响有效酶浓度；RNARNA影响影响( (干扰干扰) )电泳区带。电泳区带。 b b. DNA. DNA浓度浓度: : DNADNA过大，会抑制酶活过大，会抑制酶活( (影响酶分子扩

13、散影响酶分子扩散) )。 如：如：4g DNA /1U 4g DNA /1U HPaHPa 50l 50l 在在3737下下 15h15h 而而 1g DNA /1U 1g DNA /1U HPaHPa 50l 50l 在在3737下下 1h1h c c. . 识别位点及邻近位点特异性序列识别位点及邻近位点特异性序列 由于切点邻近序列不同，水解速度不同。由于切点邻近序列不同，水解速度不同。如：如： DNADNA有有5 5个个ECORIECORI切点，其中两个相差切点，其中两个相差1010倍。倍。 pBR322 pBR322 DNA DNA 有有4 4个个NarNar切切点点(GGCGCC)(G

14、GCGCC)其其中中2 2个个切切点点用用1U1U酶酶水水解解1h1h完完全全切开切开,2,2个切点用个切点用50U50U酶水解酶水解16h16h水解不完全。水解不完全。 XmaXma切点是切点是CGGCCGCGGCCG，但在但在GGGGCGGCCGCGGCCGCCCC时不切割时不切割 d d. DNA. DNA二级二级/ /三级结构三级结构 超螺旋超螺旋DNA(DNA(病毒或质粒病毒或质粒) )比线状比线状DNADNA需更多酶。需更多酶。 e. e. 提取时混入杂质可改变识别特异性提取时混入杂质可改变识别特异性 如：如： 高浓度高浓度HgHg2+2+、酚，氯仿、乙醇、酚，氯仿、乙醇、EDTA

15、 SDSEDTA SDS、NaClNaCl等。等。 2 2、反应系统因素、反应系统因素 a. a. 缓冲液（无菌、无污染、配成核心缓冲液，即几种酶的相近缓冲液（无菌、无污染、配成核心缓冲液，即几种酶的相近bufferbuffer） b. b. 金属离子金属离子 如如型酶需型酶需MgMg2+2+，若以若以MnMn2+2+代替代替MgMg2+2+（如（如HindHind，ECORIECORI）则特异性改变。则特异性改变。 离子浓度，合适离子浓度，合适激发酶活；不合适激发酶活；不合适抑制酶活。抑制酶活。 c. c. 牛血清蛋白牛血清蛋白(BSA)(BSA) BSA BSA 是酶稳定剂，机制：减少蛋白

16、酶及非特异性吸附作用。避免热、表面张是酶稳定剂，机制：减少蛋白酶及非特异性吸附作用。避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量力、化学品导致的酶变性。过量BSABSA会引起电泳拖尾。可通过加会引起电泳拖尾。可通过加SDS/65/5minSDS/65/5min除除去。去。 e. e. 水质：无离子水，水质：无离子水，ddHddH2 2O O，双蒸水。双蒸水。 3 3、星活性、星活性 识别特异性放宽，如识别特异性放宽，如GAATTCAATTGAATTCAATT，为，为ECORIECORI。 造成星活性参数：造成星活性参数： 甘油浓度甘油浓度12-20%12-20%，酶与，酶与DNADNA比例，离子

17、强度，比例，离子强度，45%45%聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)，有机溶有机溶剂，剂，8%8%二甲基亚枫，二介阳离子，二甲基亚枫，二介阳离子，12%12%乙醇。乙醇。 星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。Lane1:PUC19质粒DNALane2:经EcoRI酶切的酶切产物Lane3:质粒经PvuII酶切产物Lane4:质粒经Taq酶切产物质物M:Axygen1KbDNALadderLane1:质粒DNALane2:经EcoRI酶切的酶切产物M:Axygen1KbDNALadder限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用1 1、重组、重组DNA

18、DNA前的切割前的切割 2 2、构建新质粒、构建新质粒3 3、构建物理图谱、构建物理图谱4 4、DNADNA分子杂交分子杂交 用限制性内切酶消化受体用限制性内切酶消化受体DNADNA 5 5、制备制备DNADNA探针探针 6 6、亚克隆以用作序列分析、亚克隆以用作序列分析7 7、基因定位，、基因定位，DNADNA同源性研究。同源性研究。1、大多数大多数 E.coliE.coli 中中含有含有两种两种可甲基化可甲基化DNADNA的酶的酶 dam dam 甲基化酶甲基化酶 DcmDcm 甲基化酶甲基化酶 dam dam 可将甲基引入可将甲基引入 GATC GATC 序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N

19、N6 6位。位。 dcmdcm 甲基化酶可将甲基引入甲基化酶可将甲基引入 CCA/TGG CCA/TGG 序列中的胞嘧啶残基甲基化。序列中的胞嘧啶残基甲基化。 甲基化酶甲基化酶在在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同不同MHpaICmCGGHpaICCGG相同相同2、制备细菌、制备细菌DNA时，应注意时，应注意DNA在原细胞中的被修在原细胞中的被修

20、饰，选用无限制系统细菌饰，选用无限制系统细菌(E.coli)或选用甲基化不敏或选用甲基化不敏感的同裂酶。感的同裂酶。3 3、用甲基化酶进行甲基化、用甲基化酶进行甲基化 a.a.对大多数对大多数型限制酶来说，都已分离出相应的甲基化酶型限制酶来说，都已分离出相应的甲基化酶( (methylasemethylase) )。 b.b.甲基化酶也称修饰酶甲基化酶也称修饰酶(modification enzyme)(modification enzyme)已做为一种商品广泛应用。已做为一种商品广泛应用。 c.c.甲基化酶的用途甲基化酶的用途 1) 1) 保护某些切点不被切割；保护某些切点不被切割；对甲基化

21、敏感的限制性内切酶对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶限制酶 识别序列识别序列* * 甲基化酶甲基化酶AvaAva GG(A/T)GG(A/T)CCCC(A/T)GG (A/T)GG dcmdcmBclBcl T TGATCGATCA A dam dam ClaCla G GATCATCGATGAT dam dam EcoEcoR R CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmHphHph GGTGGTGAGATCTC dam damMboMbo GATCGATC dam damNruNru GAGATCTCGCGAGCGA dam damSauSau96 96 GGNGGNCCCC(A/

22、T)GG(A/T)GG dcmdcmSauSauF F CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmStuStu AGGAGGCCTCCTGGGG dcmdcmTagTag GATCGATCGA damGA damXbaXba TCTATCTAGAGATCTC dam dam * *下横线字母表示限制酶识别序列下横线字母表示限制酶识别序列, , 绿色字母表示绿色字母表示damdam甲基化酶识别序列甲基化酶识别序列, ,红色字红色字母表示母表示dcmdcm甲基化酶识别序列甲基化酶识别序列 2) 2) 配合连接子的使用，建立配合连接子的使用，建立DNADNA片段粘性末端；片段粘性末端；在建立

23、基因文库时，可先使在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切分子部分甲基化，然后再用限制酶切M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连与载体相连甲基甲基化酶化酶人工人工接头接头RE用于基因组文库的建立用于基因组文库的建立用于用于cDNA的连接的连接RERERE DPNIDPNI是唯一识别是唯一识别GAGAm6m6TCTC的限制酶，而不降解的限制酶，而不降解GATCGATC。 M.Taq1M.Taq1可使可使TCGATCGA甲基化甲基化TCGATCGAm6m6 TCGA + TCGA TCGA + TCGA 或或DNAD

24、NA中的中的 TCGATCGATCGATCGA序列。序列。连接酶连接酶TCGATCGATCGATCGA M.TaqlM.Taql TCTCGAGAm6m6TCTCGAGAm6m6DPNIDPNI切点切点 3) 3) 构建新的酶切位点构建新的酶切位点 如：如：4)4)封闭封闭DNADNA链中某些识别位点，交叉保护通过修饰封闭多余的限制性切点。链中某些识别位点，交叉保护通过修饰封闭多余的限制性切点。 如：一段如：一段DNADNA有二个有二个BamHIBamHI识别位点，其中一个识别位点，其中一个BamHIBamHI与修饰位点重叠与修饰位点重叠 可通过修饰将此位点封闭。可通过修饰将此位点封闭。 DN

25、ADNA聚合酶：指在聚合酶：指在DNA(DNA(或或RNA)RNA)模板指导下，以模板指导下，以4 4种种dNTPdNTP为底物，在引物为底物，在引物3 3 OH OH末端聚合末端聚合DNADNA链的一类酶。链的一类酶。 特点：特点： 需模板需模板(DNA(DNA或或RNA)RNA)； 需引物；需引物； 聚合方向聚合方向5353； 同时具有同时具有3535和外切和外切5353外切作用。外切作用。DNA聚合酶聚合酶种类：种类： 目前已发现的和已开发的此类酶有以下几种：目前已发现的和已开发的此类酶有以下几种： DNADNA聚合酶聚合酶(全酶全酶)()(E.coliE.coli) ) KlenowK

26、lenow片段片段( (E.coliE.coli) ) T TDNADNA聚合酶聚合酶(T(TPhagePhage感染的感染的E.coliE.coli) ) T TDNADNA聚合酶聚合酶(T(TPhagePhage感染的感染的E.coliE.coli) ) 修饰的修饰的T TDNADNA聚合酶聚合酶( (测序酶测序酶) ) TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶( (耐热耐热)()(ThermusaqraticusThermusaqraticus) ) DNADNA末端转移酶末端转移酶( (小牛胸腺小牛胸腺) ) 反转录酶反转录酶( (依赖依赖RNA)RNA)聚合酶聚合酶 -为依赖为依赖DNA

27、DNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 为不依赖为不依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。 为依赖为依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。活性与用途活性与用途 1 1、 E.coli DNA聚合酶聚合酶I（polI）来来源源：E.coliE.coli，由由染染色色体体DNADNA基基因因编编码码。商商品品上上用用的的此此酶酶来来源源于于Phage NM964Phage NM964整合的溶源性整合的溶源性E.coliE.coli。结构：一条多肽链，结构：一条多肽链，MW = 109MW = 109，000 D000 D。具两种外切酶活性和具两种外切酶活性和DNA聚合酶聚合酶活性，

28、在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具外切酶活性，大片段具35外切酶活性外切酶活性(大片段亦称为大片段亦称为Klenow片段片段,polIK)聚合酶活性，聚合酶活性，53,要求要求3-OH引物和模板引物和模板DNA，其延续性受反应条，其延续性受反应条件的影响件的影响E.coli DNAPolI的延续性的延续性DNA模板模板-引物类型引物类型反应条件反应条件延续性延续性(碱基数碱基数)切口切口ColE137C,低盐低盐8缺口缺口ColE137C,低盐低盐47切口切口/缺口胸腺缺口胸腺DNA

29、37C,低盐低盐24poly)5C,低盐低盐14polyd(ATd(AT)37C,低盐低盐188polyd(AT)5C,高盐高盐3用用途途1）除去除去3-端突起的单链端突起的单链DNA（在无（在无dNTP时）时）2）补齐补齐5-突起端突起端3）合成第二条合成第二条cDNA4）切口移位制备探针切口移位制备探针其中用途其中用途2)和和3)常用大片段常用大片段 来来源源：E.coliE.coli DNA DNA PolymerasePolymerase经经蛋蛋白白酶酶水水解解的的大大片片段段( (KlenowKlenow和和Henningseon.1970)Henningseon.1970)DNAp

30、olymerasel枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶或胰蛋白酶C端端76，000dKlenow活性活性 聚合聚合5外切外切N端端36，0005外切外切 Jacobsen(1974),Joyce Jacobsen(1974),Joyce 和和 Grindley,(1983)Grindley,(1983)克隆此大片段。克隆此大片段。2.klenow(E.coli)用途：用途： 填补限制酶的填补限制酶的5-5-粘性末端为平齐末端：粘性末端为平齐末端： C C C CGGAATTKlenowCCTTAAGGAATT末端标记a.平齐末端中用（平齐末端中用（-32p)dNTP,底物可标记底物可标记末

31、端末端b.对于对于粘性末端粘性末端AAGGCCTTAATTCCGG外切外切外切外切无底物时无底物时KlenowAATTCCGG4种种Dnap+-32pdNTPKlenowAAGGCCTTCCGGKlenow在无底物时只进行在无底物时只进行外切；有底物存在时则聚合。外切；有底物存在时则聚合。以上也称作交换标记，但此作用不如以上也称作交换标记，但此作用不如T4DNA聚合酶。聚合酶。在在cDNA克隆中合成克隆中合成cDNA第二链。第二链。RNA逆转录逆转录RNAcDNARnaseHSScDNAKlenowdscDNA DNADNA测序测序末端终止法末端终止法(Sanger 1977)(Sanger

32、1977) 通通过过3535外外切切，平平齐齐限限制制酶酶切切产产生生的的33粘粘性性末末端端( (现现在在多多用用T TDNA DNA polymersasepolymersase) ) 最早用于最早用于PCRPCR聚合反应，现已用聚合反应，现已用TaqTaq酶取代。酶取代。3 3、T T4 4DNADNA聚合酶聚合酶 来源：来源： T T4 4PhagePhage感染的感染的E.coliE.coli结构：结构：MW=114000dMW=114000d活性：活性： 5353聚合反应；聚合反应； 3535外切活性对单链活性大于双链外切活性对单链活性大于双链DNADNA，外切酶活性比外切酶活性比

33、KlenowKlenow大大200200倍。倍。用途：用途：5533补齐或末端标记，补齐或末端标记，同于同于Klenow 3-3-粘性末端的标记制备粘性末端的标记制备DNADNA探针探针, ,同同 KlenowKlenow 末端标记末端标记b b。延伸结合于单链延伸结合于单链DNADNA模板上的诱变寡核苷酸引物。模板上的诱变寡核苷酸引物。D诱变引物诱变引物T T4 4 DNA聚合酶聚合酶诱变诱变DNA5533 填补或标记限制酶切后产生的填补或标记限制酶切后产生的5-粘性末端的粘性末端的3-凹缺末端。凹缺末端。外切酶活性外切酶活性聚合酶活性聚合酶活性无无dNTPdNTP4 4、T T7 7DNA

34、DNA聚合酶（测序酶）聚合酶（测序酶） 来源：来源：T T7 7PhagePhage感染的感染的E.coliE.coli 结构：结构：由由2 2个蛋白亚基组成：个蛋白亚基组成：a.Ta.T7 7phage gene5phage gene5蛋白、外切蛋白、外切 3535末端末端 b. b. 宿主硫氧蛋白宿主硫氧蛋白活性：活性：5353聚合，在所有聚合，在所有DNADNA聚合酶中持续反应时间最长，所以合成聚合酶中持续反应时间最长，所以合成 的的DNADNA链长。故在链长。故在DNADNA测序中有很大优越性测序中有很大优越性 3535外切活力外切活力(T(TPhage gene5Phage gene

35、5编码编码) )是是DNA DNA 聚合酶聚合酶I I的的 10001000倍。倍。用途：用途： 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列 用填补或交换反应快速进行末端标记。用填补或交换反应快速进行末端标记。55333355与与T TDNApolDNApol一样，平齐粘性末端。一样，平齐粘性末端。定点突变中互补链的合成。定点突变中互补链的合成。5 5、修饰的、修饰的 T T7 7DNA DNA 聚合酶聚合酶( (测序酶测序酶) )来源：来源：天然天然 T TDNAPolymeraseDNAPolymerase 经经修饰处理。修饰处理。结构：结构：同同T

36、T聚合酶，用还原剂、分子氧、低浓度聚合酶，用还原剂、分子氧、低浓度 FeFe与酶保温几天，可与酶保温几天，可使使PhageTPhageT7 7 gene5gene5蛋白蛋白N-N-端端3535外切酶活性中心失活外切酶活性中心失活(O(O- - 修饰修饰) )。即：即：5353聚合酶作用提高，持续性长。聚合酶作用提高，持续性长。3 53 5外切作用下外切作用下降降99%99%以上。以上。已用基因工程方法生产出改进的测序酶已用基因工程方法生产出改进的测序酶2.02.0其已完全无外切酶活性。其已完全无外切酶活性。用途：用途：DNADNA序列分析，可读出较长的序列。序列分析，可读出较长的序列。聚聚合合

37、能能力力高高，可可有有效效地地将将低低水水平平dNTPdNTP( (0.1mol/L)0.1mol/L)掺掺入入到到被被标记底物中。标记底物中。 填补末端标记填补末端标记5-5-粘性末端的粘性末端的33端。端。6 6、TaqTaq DNA DNA 聚合酶聚合酶( (ThermusaqraticusThermusaqraticus) ) 来源：来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。结构：结构：单亚基单亚基MW=94000dMW=94000d。活性：活性：聚聚 合合 最最 适适 温温 度度 为为 75-8075-80， 不不 具具 3535外外 切切 酶

38、酶 活活 性性 ， 具具5353外切。外切。用途：用途： PCRPCR反应；反应； 测序，高温下进行测序，高温下进行DNADNA合成可减少模板二级结构。合成可减少模板二级结构。53变性变性3553引物引物35复性复性535335引物引物3553延伸延伸5335357 7、末端转移酶、末端转移酶( (不依赖模板的不依赖模板的DNADNA聚合酶聚合酶) )来源：来源：是一种只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的是一种只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNADNA聚合酶聚合酶(Chang(Chang和和Bollum,1986)Bollum,1986)。 结构：结构：MW=

39、60MW=60，000d.000d.活性：活性： 催化催化dNTPdNTP掺入掺入DNA 3-DNA 3-羟末端，形成同聚物末端羟末端，形成同聚物末端 反应不需模板反应不需模板DNADNA，需，需CoCo2+2+。用途：用途： 克隆克隆DNADNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。末端标记末端标记切平反应和补平反应切平反应和补平反应5AAGCTT3HindIII5AAGCTT33TTCGAA53TTCGAA5S1dNTP+klenowfrag5AT35AAGCTAGCTT33TA53TTCGATCGAA5T4DNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连

40、接酶5AT35AAGCTAGCTT33TA53TTCGATCGAA5四种不同补平反应四种不同补平反应5-GGATCC-3BamHI5-GGATCC-33-CCTAGG-53-CCTAGG-5dNTPdGTPdGTP/dATPdGTP/dATP/dTTP5-GGATC5-GG5-GGA5-GGAT3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAGGATCC-3GATCC-3GATCC-3GATCC-3CTAGG-5GG-5AGG-5TAGG-5IS1S1S15-GGCC-35-GGATCC-35-GGATATCC-33-CCGG-53-CCTAGG-53-CCTATAGG-5IIIII8

41、8、反转录酶、反转录酶 来源：商品反转录酶有两种来源：商品反转录酶有两种来自禽类成髓细胞瘤病毒来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)(AMV)。来自能表达来自能表达MoloneyMoloney鼠白血病毒鼠白血病毒(M-MLV)(M-MLV)反转录酶基因的反转录酶基因的E.coliE.coli。结构和活性：结构和活性：合成长合成长cDNAcDNA M-MLV M-MLV优于优于AMV.AMV.均无均无3535核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。用途：用途： 合成合成cDNAcDNA克隆至载体中；克隆至载体中；粘性末端补平、标记；粘性末端补平、标记；双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。双脱氧测

42、序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。RNA RNA 聚合酶聚合酶1 1、RNARNA聚合酶聚合酶 来源：商品酶为来源：商品酶为T T7 7、T T3 3RNA RNA 聚合酶在聚合酶在E.coliE.coli中的克隆表达。中的克隆表达。T T7 7、T T3 3、RNA RNA 聚合酶在酵母中的克隆表达。聚合酶在酵母中的克隆表达。E.coliE.coli RNA RNA聚合酶。聚合酶。酶活：酶活：DNADNA指指导导下下的的RNARNA合合成成，结结合合于于启启动动子子部部位位。转转录录无无意意义义链链( (一一) )产产生生与与有有意意义链相似义链相似( (以以U U代替模板中代替模板

43、中T)T)的链。的链。转录链为无意义链，负链转录链为无意义链，负链(-)(-)。不转录链为有意义链，正链不转录链为有意义链，正链(+)(+)2 2、多聚、多聚(A)(A)聚合酶聚合酶( (E.coliE.coli) ) 结构：结构： MW=58000MW=58000，一条多肽链。一条多肽链。活性：活性：催化催化RNA 3RNA 3末端加末端加AMPAMP。用途：用途：在在RNA 3RNA 3末端加末端加Poly(A)Poly(A)，以合成以合成cDNA(GethincDNA(Gethin等等.1980).1980)。用用3232PATPPATP标记标记RNA 3RNA 3末端。末端。3 3、鸟

44、苷酸转移酶、鸟苷酸转移酶( (GuanylytransferaseGuanylytransferase) )来源：来源：牛痘病毒。牛痘病毒。活性：活性：催化催化GTPGTP转移转移GMPGMP至至5 5PPPPPPRNARNA的的 55末端。末端。5 5PPP-RNA + GTP PPP-RNA + GTP 或或5 5PPRNAPPRNA。ppippiG G5 5PPPPPP5 5NRNANRNA用途：用途： 体外转录体外转录RNARNA产物加帽。产物加帽。磷酸激酶和磷酸酶磷酸激酶和磷酸酶 磷酸激酶和磷酸酶分别催化核酸磷酸激酶和磷酸酶分别催化核酸 5-OH 5-OH 加加 P P 和去除和去除

45、 5- P 5- P ： 5p A T T A G C 5p A T T A G C C C G C C G T A A T C G T A A T C G G G C p 5 G G C p 5PNKasePMase 5HO A T T A G C 5HO A T T A G C C C G C C G T A A T C G T A A T C G G G C OH 5 G G C OH 5多核苷酸激酶多核苷酸激酶磷酸甲酯酶磷酸甲酯酶Phosphomonoesterase应用：应用： 标记标记 5-5-末端。末端。 基基因因重重组组中中，酶酶切切后后先先去去掉掉5P5P，以以防防止止自自身

46、身重重组组( (连连接接) )，以以提提 高重组效率。高重组效率。 重组前磷酸化。重组前磷酸化。商品酶：商品酶： T T4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶T T4 4Polynucleotide Polynucleotide kinasekinase碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline (alkaline phosphatasephosphatase) )牛肠碱性磷酸酶牛肠碱性磷酸酶(BAP)(BAP)大肠杆菌磷酸酶大肠杆菌磷酸酶( (ClPClP) )-32PATPATP5POH3532POH33HOP53HO32P5III5POH35HOOH35POH33HOP53HOOH53HOP5磷酸酶

47、磷酸酶(I)与磷酸激酶与磷酸激酶(II)活性活性磷酸激酶的交换反应磷酸激酶的交换反应核酸酶核酸酶外切核酸酶外切核酸酶内切核酸酶内切核酸酶核糖核酸酶核糖核酸酶ds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口缺口缺口(gap)切口切口(nick)断口断口(cut)3HOP53HOP5 外切核酸酶外切核酸酶单链单链 5 35 3和和 3 53 5外切核酸酶。外切核酸酶。外切核酸酶外切核酸酶(exovexov) ) 。exovexovNMP5 35 3DNA应用：应用： 基因组基因组DNADNA中内含子的位置作图。中内含子的位置作图。切除通过切除通过Poly(dA-dTPoly(dA-dT) )加尾

48、插入到质粒载体中的加尾插入到质粒载体中的DNADNA片段。片段。双链双链5 35 3末端外切酶末端外切酶 1. 1. 入入PhagePhage外切核酸酶外切核酸酶( (入入exoexo) ) 降解降解 5-P5-P的核苷酸，不降解的核苷酸，不降解 5-OH5-OH核苷酸。如降解核苷酸。如降解 PNNNNPNNNN, ,不不降解降解 HONNNHONNN55dsDNAP555533ssDNA应用：应用： 在双脱氧测序时，将在双脱氧测序时，将dsDNAssDNAdsDNAssDNA。 平齐平齐5-5-粘性末端，便于末端转移酶加尾。粘性末端，便于末端转移酶加尾。2. T2. T7 7 基因基因6 6

49、外切核酸酶外切核酸酶应用：应用：降降解解5-P 5-P DNADNA末末端端，也也可可降降解解5-OH5-OH末末端端, ,与与其其它它酶酶一一起起使使DNADNA链链变短。变短。双链双链3535外切酶外切酶外切核酸酶外切核酸酶(exoexo)55333355exoexo5555 NMP32pNTPKlenow放射性探针放射性探针应用：应用： 制备链特异性探针。制备链特异性探针。制备制备SSDNASSDNA用于双脱氧测序做为模板。用于双脱氧测序做为模板。内切核酸酶内切核酸酶Bal核酸酶核酸酶同时具有内切酶活性的外切酶，也可降解同时具有内切酶活性的外切酶，也可降解RNA。既具有单链特异性，同时具

50、有既具有单链特异性，同时具有双链特异性。双链特异性。Bal31活性需活性需Ca2+，也需也需Mg2+，反应液中加入反应液中加入EDTA，便可终止便可终止Ca2+活活性，而不改变性，而不改变Mg2+浓度，所以在终止浓度，所以在终止Bal31下不影响限制性酶活性。下不影响限制性酶活性。EDTA55 dNMP或或rNMPa.ssDNA或或RNA55EDTA5533335555333355b.已知已知DNA或或RNAc.水解水解dsDNA末端末端EDTAS1核酸酶核酸酶对对 SSDNA SSDNA 有高度特异性。有高度特异性。S1绿豆核酸酶与绿豆核酸酶与S1S1类似类似ExoIIIS1S1S1S1S1

51、S1Poly(A)Poly(A)555555核酸酶核酸酶S1活性活性5PP53HOOH3核酸酶核酸酶Bal31的活性的活性DNaseDNase 1 1、来源：来源： 牛胰牛胰2 2、结构：、结构：MW=37KD MW=37KD 为为- -糖蛋白糖蛋白3 3、活性：、活性： 水解位点：优先水解嘧啶水解位点：优先水解嘧啶5 5P P与一个核苷核与一个核苷核的磷酸二酯键位点。的磷酸二酯键位点。A A P P G G P P C C P P T T P P C C P P G G P P T T P P A A OHOH MgMg2+2+存在下，随机切割存在下，随机切割DNADNA双链中的任一条。双链

52、中的任一条。MnMn2+2+存在时，切割双链。存在时，切割双链。无无RNaseRNase活性的活性的DNaseDNase处理：处理：DNase/0.1molDNase/0.1mol碘乙酸，碘乙酸，0.15mol0.15mol乙酸钠乙酸钠(pH5.3)55(pH5.3)55加热加热40min40min，+1molCaCl+1molCaCl2 2至至5mmol5mmol。4 4、用途：用途： 切口平移时切口产生。切口平移时切口产生。裂解双链裂解双链DNA(MnDNA(Mn2+2+）。）。Mn+存在时存在时Mg+存在时存在时DNaseI作用特点作用特点DNaseIHOP535353DNaseI与与P

53、olI的的切口移位切口移位PolI核糖核酸酶核糖核酸酶RNaseARNaseA 1 1、来源：来源： 牛胰牛胰2 2、活性：、活性： RNARNA内切酶内切酶 无无DNaseDNase的的RnaseRnase处理：处理：用用TE(Tris-HClTE(Tris-HCl) )溶解后溶解后(1mg/ml)(1mg/ml)煮沸煮沸10-30min10-30min，分小份存分小份存2020。3 3、应用：、应用：ApUpGpCpGpApUpC抑制：抑制：人类胚胎特异性抑制剂人类胚胎特异性抑制剂Rnasin，钒氧核苷酸复合物。用蛋白钒氧核苷酸复合物。用蛋白酶处理可除去酶处理可除去RNaseA。 在制备在

54、制备DNADNA中除去中除去RNARNA。 RNARNA测序。测序。 除去除去DNA-RNADNA-RNA杂交链中的杂交链中的RNARNA。RNaseRNase H H来源：来源：E.coliE.coli活性：活性： RNA RNA 内切酶降解内切酶降解 RNA-DNA RNA-DNA 杂交链中的杂交链中的 RNA RNA 链。链。应用：应用：降解降解RNA-DNARNA-DNA中的中的mRNAmRNA，利于利于cDNAcDNA第二链合成。第二链合成。RAaseRAase T T1 1来源：来源： 米曲霉米曲霉活性：活性： 内切酶，特异降解内切酶，特异降解G G残基后的残基后的- -磷酸二酯键

55、。磷酸二酯键。应用：应用： RNA RNA 测序测序ApUpGpCpCpUpA中间产物无环化的单核苷酸。中间产物无环化的单核苷酸。连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶 连接连接DNADNA末端，可连接平齐末端，所需酶是粘性末端连接的末端，可连接平齐末端，所需酶是粘性末端连接的10-10010-100倍。倍。酶活单位用酶活单位用WeissWeiss1Weiss1Weiss单位单位=60=60个粘性末端单位个粘性末端单位E.coliE.coli连接酶连接酶活性：活性： 与与 T T4 4DNA DNA 连接酶同，但不连接平齐末端。在非平端连接时，连接酶同，但不连接平齐末端。在非平端连接

56、时，可代替可代替 T T4 4DNALigase DNALigase 。酶活单位用酶活单位用Modrich-lehmanModrich-lehman1Modrich-lehman=61Modrich-lehman=6个个WeissWeissRNA RNA 连接酶连接酶T T4 4RNA RNA 连接酶连接酶活性：活性：在在ATPATP存在下，可催化单链存在下，可催化单链DNADNA或或RNARNA连接。连接。应用：应用： RNA3RNA3末端放射性标记。末端放射性标记。 增加增加 T T4 4DNA DNA ligaseligase 的的平端连接活性。平端连接活性。练练习习题题1.一种一种DN

57、A分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：EcoRI5kbEcoRI/HindIII1、2、3、4kbHindIII3kb、7kbEcoRI/PstI2、3、5kbPstI10kbHindIII/PstI1、3、6kb将各限制酶位点绘制在将各限制酶位点绘制在DNA分子上。分子上。2.另一另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。分子上。EcoRI1、3、6kbEcoRI/HindIII1、3kbHindIII4、6kbEcoRI/PstI1、3、5kbPstI2、8kbHindIII/

58、PstI2、6kb3.下图中的一段下图中的一段DNA分子上有两个限制酶分子上有两个限制酶PstI和和EcoRI识别位点，两位点相距识别位点，两位点相距10bp，现有一研究生要分析，现有一研究生要分析EcoRI右侧右侧500bp区域内的功能，他需要在这一区域内区域内的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定EcoRIPstI间间的的10bp除去后并不影响任何结果分析，但除去后并不影响任何结果分析，但PstI位点左侧的位点左侧的DNA不能除去不能除去10bp500bp PstIEcoRI4.假如假如

59、PstI位点为另一限制酶位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？，实验又该如何设计？10bp500bp HindIIIEcoRI5.现有一研究者打算将一现有一研究者打算将一EcoRIDNA片段克隆到另一个片段克隆到另一个DNA分子的分子的BamHI位点以便位点以便DNA扩增，但扩增后的扩增，但扩增后的DNA分子又可用分子又可用BamHI限制酶限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。将插入的片段回收，如何设计此实验。6.一研究生要将一质粒（一研究生要将一质粒（pI）上的）上的BamHI-HindIII片段取代另一质粒片段取代另一质粒（pII）上的）上的BamHI-XbaI片段，所获重组

60、质粒（片段，所获重组质粒（pIII）上的插入片段）上的插入片段要求能用要求能用BamHI-HindIII进行回收，问如何设计此实验？进行回收，问如何设计此实验？HXbH5kbpI1kb6kbpII.5kb6kbpIII1kbBBB7.现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示：现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示：已知已知HindIII克隆片段中的克隆片段中的BamHI（3kb）片段含有一完整的基因编码区，现要）片段含有一完整的基因编码区，现要将将3kb的的BamHI片段克隆到另一表达载体片段克隆到另一表达载体pB的的BamHI位点，如何才能使插入片位点，如何才能

61、使插入片段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相同的？同的？HindIIIPstIBamHIPstIBamHIBamHIHindIIIpA8kbpB0.52.58.为了检测绿豆核酸酶对为了检测绿豆核酸酶对5-端突起的单链端突起的单链DNA切割是否准确有效，切割是否准确有效，即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常精巧的实验，其中一个实验是将一精巧的实验，其中一个实验是将一XbaI片段插入片段插入pBR322的的Apr基因内的

62、基因内的ScaI位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆核酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验核酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验？(pBR322除含有除含有Apr基因外，还含有基因外，还含有Tcr基因基因)。ScaIXbaI片段片段Tcr（当有外源当有外源DNA插插入，入， 该基因失活）该基因失活） pBR322AprTcr9.某研究者计划将具有限制酶某研究者计划将具有限制酶BamHI粘性末端结构的一段低聚核苷酸分子插粘性末端结构的一段低聚核苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低聚核苷酸插入

63、的重组质粒，入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低聚核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的方向他应做什么实验来检查插入片段的方向AprHSIBXbSKENSpSISfGATCCGGCCTAGpA图中字母代表的意义：图中字母代表的意义：N-NotI；Sp-SpeI；SI-SacI；Sf-SflI；H-HindIII；B-BamHI；Xb-XbaI；S-SalI；K-KpnI；E-EcoRI10.一一DNA分子中有一个分子中有一个SmaI识别位点识别位点(CCCGGG),现有一研究生想要将这识别位现有一研究生想要将这识别位点顺序完全除去点顺序完全除去,现已知该位点及两侧的序列为

64、现已知该位点及两侧的序列为ACCCGGGT,他应该如何设计实验他应该如何设计实验?EcoRIBamHIHindIIIBamHISmaI SacIEcoRIPstIBamHI+EBPESISmBH11.一研究者想在下列三种限制酶位点的一研究者想在下列三种限制酶位点的BamHI中插入另外一段中插入另外一段低聚核苷酸低聚核苷酸,该段低聚核苷酸中的限制酶位点如下所示该段低聚核苷酸中的限制酶位点如下所示,要求要求获得的重组获得的重组DNA分子的各种限制酶位点按一种方式排列分子的各种限制酶位点按一种方式排列,他他应如何设计实验分离到所需的应如何设计实验分离到所需的DNA分子分子?12.如何使下列的限制酶识

65、别位点由一种序列变为第二种如何使下列的限制酶识别位点由一种序列变为第二种,或由第或由第一种变为第三种一种变为第三种?GATCGATATCGATCGATC；TCGATCGCGATCGCGCGCGA；Sau3AIEcoRVClaITaqIREIIBssHIAAGCTTAAGCGCTTHindIIIThaI，HaeII13.下图的质粒载体中的四环素抗性基因内有一下图的质粒载体中的四环素抗性基因内有一BamHI位点位点,一研究一研究者想用体外缺失或插入的办法使者想用体外缺失或插入的办法使BamHI位点消除位点消除,并获得如图并获得如图所示的重组质粒，他应如何设计此实验所示的重组质粒，他应如何设计此实验?假定密码子的增减对基假定密码子的增减对基因的抗性无任何影响。因的抗性无任何影响。HindIIIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHI位位点消除点消除总长为总长为9kbTcr