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1、植物组织植物组织DNADNA的提取、分离的提取、分离 基础生物化学实验学时：学时：8 82009年年11月月2日日11 1、学习并掌握用、学习并掌握用CTABCTAB法法提取植物总提取植物总DNADNA的的 原理和方法。原理和方法。一、实验目的：2、学习并掌握核酸组分的分离技术、学习并掌握核酸组分的分离技术琼脂糖凝胶电泳方法琼脂糖凝胶电泳方法2 核酸在植物体内多与蛋白质结合，以核蛋白的形式存核酸在植物体内多与蛋白质结合，以核蛋白的形式存核酸在植物体内多与蛋白质结合，以核蛋白的形式存核酸在植物体内多与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在，因此提取分离核酸时，必须使核酸与蛋白质解离，并除在，因此提取分离
2、核酸时，必须使核酸与蛋白质解离，并除在，因此提取分离核酸时，必须使核酸与蛋白质解离，并除在，因此提取分离核酸时，必须使核酸与蛋白质解离，并除去蛋白质和多糖等杂质。去蛋白质和多糖等杂质。去蛋白质和多糖等杂质。去蛋白质和多糖等杂质。 本实验先将植物材料速冻、研磨，破碎细胞壁，然后加本实验先将植物材料速冻、研磨，破碎细胞壁，然后加本实验先将植物材料速冻、研磨，破碎细胞壁，然后加本实验先将植物材料速冻、研磨，破碎细胞壁，然后加入入入入十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵（CTABCTABCTABCTAB）分离缓冲液，使细胞膜破）分离缓冲液，使细胞膜破）分离缓
3、冲液，使细胞膜破）分离缓冲液，使细胞膜破裂，同时将核酸与蛋白质及多糖等杂质分开。一定浓度的裂，同时将核酸与蛋白质及多糖等杂质分开。一定浓度的裂，同时将核酸与蛋白质及多糖等杂质分开。一定浓度的裂，同时将核酸与蛋白质及多糖等杂质分开。一定浓度的CTABCTABCTABCTAB与核酸结合形成复合物，该复合物溶于高浓度的盐溶液，与核酸结合形成复合物，该复合物溶于高浓度的盐溶液，与核酸结合形成复合物，该复合物溶于高浓度的盐溶液，与核酸结合形成复合物，该复合物溶于高浓度的盐溶液，（而在低盐溶液中沉淀）再经（而在低盐溶液中沉淀）再经（而在低盐溶液中沉淀）再经（而在低盐溶液中沉淀）再经氯仿异戊醇氯仿异戊醇氯仿
4、异戊醇氯仿异戊醇抽提、离心，除抽提、离心，除抽提、离心，除抽提、离心，除去蛋白质等杂质，上清液中加入去蛋白质等杂质，上清液中加入去蛋白质等杂质，上清液中加入去蛋白质等杂质，上清液中加入异丙醇异丙醇异丙醇异丙醇，沉淀，沉淀，沉淀，沉淀DNADNADNADNA，而，而，而，而CTABCTABCTABCTAB溶溶溶溶于异丙醇。于异丙醇。于异丙醇。于异丙醇。二、实验原理:3 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖或优质琼脂粉作支琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖或优质琼脂粉作支琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖或优质琼脂粉作支琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖或优质琼脂粉作支持介质的一种电泳分离方法。它主要用于大于或等持介质的一种电泳分离方法。
5、它主要用于大于或等持介质的一种电泳分离方法。它主要用于大于或等持介质的一种电泳分离方法。它主要用于大于或等于于于于1Kb 1Kb 1Kb 1Kb 核酸的分离。有电荷效应和分子筛效应。其核酸的分离。有电荷效应和分子筛效应。其核酸的分离。有电荷效应和分子筛效应。其核酸的分离。有电荷效应和分子筛效应。其迁移率的大小，主要与迁移率的大小，主要与迁移率的大小，主要与迁移率的大小，主要与DNADNADNADNA分子大小和空间构象有关。分子大小和空间构象有关。分子大小和空间构象有关。分子大小和空间构象有关。其次，凝胶浓度、电泳电压、其次，凝胶浓度、电泳电压、其次，凝胶浓度、电泳电压、其次，凝胶浓度、电泳电压
6、、PHPHPHPH值也会影响迁移率。值也会影响迁移率。值也会影响迁移率。值也会影响迁移率。核酸区带观察，是利用核酸与核酸区带观察，是利用核酸与核酸区带观察，是利用核酸与核酸区带观察，是利用核酸与EBEBEBEB结合，在紫外光下结合，在紫外光下结合，在紫外光下结合，在紫外光下可发出橙黄色荧光的性质，借助于紫外观测仪来进可发出橙黄色荧光的性质，借助于紫外观测仪来进可发出橙黄色荧光的性质，借助于紫外观测仪来进可发出橙黄色荧光的性质，借助于紫外观测仪来进行。行。行。行。41 1、实验材料：、实验材料：三叶草叶片三叶草叶片三叶草叶片三叶草叶片2 2、仪器：、仪器： (1)(1)(1)(1)电热恒温水浴锅
7、电热恒温水浴锅电热恒温水浴锅电热恒温水浴锅 (2)(2)(2)(2)离心机离心机离心机离心机 (3)(3)(3)(3)液氮罐液氮罐液氮罐液氮罐 (4)(4)(4)(4)研钵等研钵等研钵等研钵等 三、实验材料、仪器和试剂：5 3 3、试剂：、试剂：（1 1）CTABCTAB分离缓冲液：分离缓冲液： 2%CTAB2%CTAB2%CTAB2%CTAB，1.4M NaCl1.4M NaCl1.4M NaCl1.4M NaCl， 20mM EDTA20mM EDTA20mM EDTA20mM EDTA，100mM Tris-HCl (pH8.0),0.2%100mM Tris-HCl (pH8.0),0
8、.2%100mM Tris-HCl (pH8.0),0.2%100mM Tris-HCl (pH8.0),0.2%巯基乙醇共巯基乙醇共巯基乙醇共巯基乙醇共100ml 100ml 100ml 100ml （2 2）洗涤缓冲液：）洗涤缓冲液：75%75%75%75%乙醇，乙醇，乙醇，乙醇，100mM 100mM 100mM 100mM 乙酸铵共乙酸铵共乙酸铵共乙酸铵共100ml 100ml 100ml 100ml （3 3）氯仿：异戊醇）氯仿：异戊醇24242424：1 1 1 1（V/VV/VV/VV/V）（4 4）异丙醇）异丙醇 （5 5）TETE液液 （6 6）液氮）液氮 （7 7）EBEB
9、液液（8 8）电泳缓冲液）电泳缓冲液TBETBE（9 9）凝胶加样缓冲液）凝胶加样缓冲液6（一）植物组织（一）植物组织DNADNA的提取：的提取： 1 1、取、取、取、取10mlCTAB10mlCTAB分离缓冲液加入离心试管中，于分离缓冲液加入离心试管中，于分离缓冲液加入离心试管中，于分离缓冲液加入离心试管中，于6060水水水水浴预热。浴预热。浴预热。浴预热。2 2、称取、称取、称取、称取1.5g1.5g新鲜叶片于预冷的研钵中，加入液氮，迅速新鲜叶片于预冷的研钵中，加入液氮，迅速新鲜叶片于预冷的研钵中，加入液氮，迅速新鲜叶片于预冷的研钵中，加入液氮，迅速将叶片研磨成很细的粉末。将叶片研磨成很细
10、的粉末。将叶片研磨成很细的粉末。将叶片研磨成很细的粉末。3 3、将叶片粉末直接加入预热的、将叶片粉末直接加入预热的、将叶片粉末直接加入预热的、将叶片粉末直接加入预热的CTABCTAB分离液中，轻轻转分离液中，轻轻转分离液中，轻轻转分离液中，轻轻转动混匀，动混匀，动混匀，动混匀，6060水浴保温水浴保温水浴保温水浴保温3030分钟分钟分钟分钟。4 4、将液体转入小烧杯中，加入等体积的氯仿异戊醇，、将液体转入小烧杯中，加入等体积的氯仿异戊醇，、将液体转入小烧杯中，加入等体积的氯仿异戊醇，、将液体转入小烧杯中，加入等体积的氯仿异戊醇，轻轻摇匀后，分装到两个离心管中，等重，轻轻摇匀后，分装到两个离心管
11、中，等重，轻轻摇匀后，分装到两个离心管中，等重，轻轻摇匀后，分装到两个离心管中，等重，4000r/min4000r/min，离心，离心，离心，离心8 8分钟分钟分钟分钟。5 5、用大开口滴管取出上层水相于另一洁净的离心管中，、用大开口滴管取出上层水相于另一洁净的离心管中，、用大开口滴管取出上层水相于另一洁净的离心管中，、用大开口滴管取出上层水相于另一洁净的离心管中，加入加入加入加入2/32/3体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，使体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，使体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，使体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，使DNADNA沉淀，沉淀，沉淀，沉淀，并与并与并与并与CTABCTAB分离。（注意现象
12、）分离。（注意现象）分离。（注意现象）分离。（注意现象）四、实验步骤： 76 6、收集、收集、收集、收集DNADNA：（：（：（：（1 1）如呈可见的丝状）如呈可见的丝状）如呈可见的丝状）如呈可见的丝状DNADNA，可用玻璃棒，可用玻璃棒，可用玻璃棒，可用玻璃棒（或小勺）轻轻搅起。（或小勺）轻轻搅起。（或小勺）轻轻搅起。（或小勺）轻轻搅起。 （2 2）如呈云雾状，再）如呈云雾状，再）如呈云雾状，再）如呈云雾状，再2000r/min2000r/min离心离心离心离心4min4min，小心倒去，小心倒去，小心倒去，小心倒去上清液。上清液。上清液。上清液。7 7、洗涤：（、洗涤：（、洗涤：（、洗涤：
13、（1 1）将丝状）将丝状）将丝状）将丝状DNADNA直接转移到直接转移到直接转移到直接转移到15ml15ml的洗涤缓冲的洗涤缓冲的洗涤缓冲的洗涤缓冲液中洗液中洗液中洗液中洗3030分钟（如不能搅起，可分钟（如不能搅起，可分钟（如不能搅起，可分钟（如不能搅起，可2000r/min2000r/min离心离心离心离心1010分钟分钟分钟分钟，转速不宜太高，否则形成坚实的沉淀）；，转速不宜太高，否则形成坚实的沉淀）；，转速不宜太高，否则形成坚实的沉淀）；，转速不宜太高，否则形成坚实的沉淀）； （2 2）在松散的沉淀物上加入）在松散的沉淀物上加入）在松散的沉淀物上加入）在松散的沉淀物上加入15ml15m
14、l洗涤液，洗涤洗涤液，洗涤洗涤液，洗涤洗涤液，洗涤3030分钟，分钟，分钟，分钟，用玻璃棒轻轻搅起沉淀。用玻璃棒轻轻搅起沉淀。用玻璃棒轻轻搅起沉淀。用玻璃棒轻轻搅起沉淀。8 8、保存：将、保存：将、保存：将、保存：将DNADNA从离心管中取出，于滤纸上干燥后溶从离心管中取出，于滤纸上干燥后溶从离心管中取出，于滤纸上干燥后溶从离心管中取出，于滤纸上干燥后溶于于于于1mlTE1mlTE中，低温保存备用。中，低温保存备用。中，低温保存备用。中，低温保存备用。8( (二）二）DNADNA组分的分离组分的分离琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1 1、琼脂糖凝胶的制备：以、琼脂糖凝胶的制备：以、琼脂糖凝胶的制备
15、：以、琼脂糖凝胶的制备：以5 X TBE5 X TBE电泳缓冲溶液配电泳缓冲溶液配电泳缓冲溶液配电泳缓冲溶液配制，浓度为制，浓度为制，浓度为制，浓度为0.7% 0.7% 。将琼脂糖粉和。将琼脂糖粉和。将琼脂糖粉和。将琼脂糖粉和TBETBE液于沸水浴液于沸水浴液于沸水浴液于沸水浴中加热至完全溶解，待冷却至中加热至完全溶解，待冷却至中加热至完全溶解，待冷却至中加热至完全溶解，待冷却至6060左右时加入左右时加入左右时加入左右时加入EBEB，使，使，使，使EBEB终浓度为终浓度为终浓度为终浓度为0 .5mg / ml 0 .5mg / ml 。2 2、凝胶板的制备：、凝胶板的制备：、凝胶板的制备：、
16、凝胶板的制备： A A、在胶床的两头贴上胶带，形成、在胶床的两头贴上胶带，形成、在胶床的两头贴上胶带，形成、在胶床的两头贴上胶带，形成8mm 8mm 高的挡高的挡高的挡高的挡 墙，压紧胶带，置于水平台面上。墙，压紧胶带，置于水平台面上。墙，压紧胶带，置于水平台面上。墙，压紧胶带，置于水平台面上。 B B、插入梳子，梳子下端距底板、插入梳子，梳子下端距底板、插入梳子，梳子下端距底板、插入梳子，梳子下端距底板0 .5-1mm 0 .5-1mm ，然后，然后，然后，然后将凝胶不间断地倒入胶床，高将凝胶不间断地倒入胶床，高将凝胶不间断地倒入胶床，高将凝胶不间断地倒入胶床，高3-4mm 3-4mm ，避
17、免产生，避免产生，避免产生，避免产生气泡，在室温下凝固。气泡，在室温下凝固。气泡，在室温下凝固。气泡，在室温下凝固。9 C、完全凝固后撕去胶带，于电泳槽中加入、完全凝固后撕去胶带，于电泳槽中加入电泳缓冲溶液，高于胶面电泳缓冲溶液，高于胶面1mm，从一端斜，从一端斜拉出梳子，除去产生的气泡。拉出梳子，除去产生的气泡。3、加样：将样品、加样：将样品DNA溶液与加样缓冲溶液溶液与加样缓冲溶液 以以5：1体积混合，加样量每孔体积混合，加样量每孔5-10 ul。4、电泳：阳向极电泳。电位、电泳：阳向极电泳。电位5V/cm ，当染料，当染料 前沿移至底边前沿移至底边1-2 cm 处时处时,停止电泳。停止电
18、泳。5、观察：将胶床置紫外检测仪上观察并记、观察：将胶床置紫外检测仪上观察并记 录。录。10五、思考题：五、思考题： 1 1 1 1、提取核酸时应注意些什么问题？、提取核酸时应注意些什么问题？、提取核酸时应注意些什么问题？、提取核酸时应注意些什么问题？2 2 2 2、EBEBEBEB在对核酸进行染色时有什么优点？其原理如何？在对核酸进行染色时有什么优点？其原理如何？在对核酸进行染色时有什么优点？其原理如何？在对核酸进行染色时有什么优点？其原理如何？3 3 3 3、用中文命名：、用中文命名：、用中文命名：、用中文命名：CTABCTABCTABCTAB、EBEBEBEB。 111 1 1 1、核酸
19、提取过程中的注意事项：、核酸提取过程中的注意事项：、核酸提取过程中的注意事项：、核酸提取过程中的注意事项：（1 1 1 1）避免过酸过碱或高温环境，合适的）避免过酸过碱或高温环境，合适的）避免过酸过碱或高温环境，合适的）避免过酸过碱或高温环境，合适的T T T T：0 0 0 04444， pH4-9pH4-9pH4-9pH4-9；（2 2 2 2）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；（3 3 3 3）防防防防止止止止核核核核酸酸酸酸酶酶酶酶的的的的降降降降解解解解作作作作用用用用，可可可可加加加加入入入入抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂EDTAEDTAEDTAEDTA，柠檬酸钠；，柠檬酸钠；，柠檬酸钠；，柠檬酸钠；（4 4 4 4）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，降）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，降）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，降）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，降 低，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。低，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。低，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。低，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。12终于下课了！13
