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1、 肝炎分子诊断项目开展介绍肝炎分子诊断项目开展介绍 目目 录录1、了解肝炎分子诊断2、分子诊断在HBV中的临床应用3、分子诊断在HCV中的临床应用4、ADICON已开展的肝炎分子诊断项目 我国乙肝病毒感染率概况我国乙肝病毒感染率概况 2006200620102010年全国乙型病毒性肝炎防治规划年全国乙型病毒性肝炎防治规划显示，中国是乙型肝炎病毒感染和发病人数最多的显示，中国是乙型肝炎病毒感染和发病人数最多的国家，全国有国家，全国有6.96.9亿亿人曾感染过乙肝病毒，其中人曾感染过乙肝病毒，其中1.21.2亿亿人长期携带乙肝病毒。人长期携带乙肝病毒。目前全国慢性乙肝病人目前全国慢性乙肝病人200
2、02000万万人，每年死于与乙人，每年死于与乙肝相关的肝病患者达肝相关的肝病患者达2828万万例，发病率和死亡率都位居例，发病率和死亡率都位居前三位。每年造成的直接经济损失约达前三位。每年造成的直接经济损失约达36003600亿亿元人民元人民币。币。我国乙肝病毒感染率概况我国乙肝病毒感染率概况什么是分子诊断什么是分子诊断 在在临临床床上上应应用用核核酸酸（D DN NA A/ /R RN NA A) ) 和和分分子子生生物物学学技技术术, , 在在基基因因水水平平诊诊断断和和监监控控疾疾病病情情况况和和疗疗效效，评评估估疾疾病病的的检检测测方方法法。分分子子技技术术在在乙乙肝肝诊诊断断与与治治
3、疗疗中中应应用用HBV HBV 分子诊断的分子诊断的临床应用临床应用高灵敏度高灵敏度HBV DNAHBV DNA定量定量HBV 感染监测药物疗效检测感染早期检测HBV HBV 基因分型基因分型病情预后发展检测抗病毒药物效果预测P P区耐药检测区耐药检测抗药性监测治疗药物选择S S 区变异区变异确定隐觅性病毒变异判断疫苗效果判断肝炎预后C C区启动子变异区启动子变异确定病毒变异类型判断治疗效果确定治疗方案高灵敏度乙肝DNA检测n n高精度病毒载量检测系统（ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ）高灵敏度乙肝DNA检测优势n n定量定量PCRPCR技术检测患者的血清技术检测患
4、者的血清HBVDNAHBVDNA含量，能更准确地反映病毒复制程度，含量，能更准确地反映病毒复制程度，对对HBVHBV相关疾病的诊断、治疗、判断预后意义重大。相关疾病的诊断、治疗、判断预后意义重大。n nQF-PCRQF-PCR是国内常用的定量检测血清是国内常用的定量检测血清HBVDNAHBVDNA水平的方法，水平的方法，COBAS COBAS 系统是美系统是美国食品药品监督管理局国食品药品监督管理局(FDA)(FDA)批准用于血清批准用于血清HBVDNAHBVDNA定量检测的方法。它定量检测的方法。它具具有灵敏度高有灵敏度高，线性范围广，实时监控，线性范围广，实时监控，重复性好重复性好，可检测
5、，可检测A A、B B、C C、D D、E E、F F、G G、前、前C C区变异等多基因型区变异等多基因型DNADNA载量优点。载量优点。n n由于本由于本QF-PCRQF-PCR试剂盒的线性范围为试剂盒的线性范围为1.0x 101.0x 103 3 copiescopiesmLmL1.0x 101.0x 108 8 copiescopiesmLmL，对于低于，对于低于1.0 x 101.0 x 103 3 copiescopiesmLmL标本的检测结果不能给出具体拷贝值，有存在标本的检测结果不能给出具体拷贝值，有存在漏检的可能。漏检的可能。 而而COBAS COBAS 系统线性范围为系统线
6、性范围为20-1.71020-1.7108 8 IU/mL IU/mL，因此，因此， COBAS COBAS 系统更能准确反映血清系统更能准确反映血清HBV DNAHBV DNA含量。含量。COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0Cobas高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度乙肝：乙肝：乙肝：乙肝：20 20 IU/mLIU/mL准确判断治疗起点准确判断治疗起点/终点终点线性范围线性范围乙肝：乙肝：20-1.7108 IU/mL极佳的重复性，结果可靠极佳的重复性，结果
7、可靠正确指导抗病毒治疗正确指导抗病毒治疗每批试剂均使用每批试剂均使用WHO标准品校准标准品校准保证定量结果的准确性保证定量结果的准确性和可溯源性和可溯源性每个样本使用同每个样本使用同源性内标定量源性内标定量避免结果不准确避免结果不准确采用采用AmpErase酶酶减少交叉污染减少交叉污染目前在目前在国内唯一国内唯一满足治疗指南和专家共识的满足治疗指南和专家共识的HBV HBV DNADNA和和 HCV RNAHCV RNA检测试剂检测试剂HBV DNA 监测的重要性 口服核苷（酸）类似物疗效评估部分病毒学应答部分病毒学应答60 2,000 IU/mL加其他药物治疗每3个月监测HBV DNA开始治
8、疗开始治疗- - 基于基于 HBV DNAHBV DNA、 ALTALT水平和疾病发展阶段水平和疾病发展阶段治疗第治疗第1212周评估是否存在原发性无应答周评估是否存在原发性无应答 (较基线下降1 log)治疗第治疗第2424周评估周评估完全病毒学应答完全病毒学应答 2,000 IU/mL改用或加用更强药物每6个月监测HBV DNA*Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897. 抗病毒治疗应将抗病毒治疗应将HBV DNAHBV DNA降至尽可能低的浓度，理想是低于实时定量降至尽可能低的浓度，理想是低于实时定量 PCRPCR方方法（法（
9、灵敏度灵敏度灵敏度灵敏度10-15 IU/mL10-15 IU/mL10-15 IU/mL10-15 IU/mL）的最低检出限的最低检出限1 1 1. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-2421. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-242CHB疾病管理:治疗目标HBsAgHBsAg清除及血清学转换清除及血清学转换治疗终点治疗终点ALTALT正常正常组织学改善组织学改善HBV DNAHBV DNA降低降低/ /消失消失HBeAgHBeAg血清学转换血清学转换HBeAgHBeAg
10、消失消失cccDNA cccDNA 清除清除*Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, No. 3, 2009, pgs 8-9 治疗终点治疗终点n n 20092009年年EASLEASL指南提出的治疗终点：指南提出的治疗终点：n n最最理想的理想的治疗终点：持续的治疗终点：持续的HBsAg HBsAg 消失，伴消失，伴或不伴抗或不伴抗HBs HBs 抗体出现。抗体出现。n n满意的满意的治疗终点：在治疗终点：在HBe Ag HBe Ag 阳性患者中，出阳性患者中，出现持续的现持续的HB
11、eAg HBeAg 血清转换血清转换n n次级的满意次级的满意治疗终点：尽可能降低病毒治疗终点：尽可能降低病毒DNADNA水水平（降至实时定量平（降至实时定量 PCRPCR检测限以下：检测限以下：10-10-15IU/ml15IU/ml）H HB BV V基基因因分分型型 根据根据HBVHBV全基因核苷酸序列的差异，分为不同全基因核苷酸序列的差异，分为不同基因型基因型: :A.B.C.D.E.F.G.H共8个型 不同的基因型具有不同地域分布不同的基因型具有不同地域分布 我国主要是BC型为主，偶有A型 北方C型HBV基因分型检测临床意义HBV变变异异的的基基础础n n乙肝病毒:高变异性 1/10
12、5 n n24h 一万亿-十万亿拷贝*变异：一千万一亿n n复制过程:DNA-RNA-DNAn nHBV逆转录酶:缺乏严格的校正机制n n变异:自然变异,免疫压力等等原本有效的药物原本有效的药物对发生耐药变异后的病毒束手无策对发生耐药变异后的病毒束手无策变异前，药物有效抑制病毒变异后，药物对病毒束手无策乙肝病毒乙肝病毒P P区耐药区耐药P P区区耐耐药药位位点点检检测测H HB BV V病病毒毒耐耐药药性性检检测测n n长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药的基因突变位点主要集中于P区n n原因：抗病毒药物作用在病毒P区药物靶点上，引起相关基因变异，使得药物与相关靶点作用下降，进而产生耐
13、药。抗病毒治疗后抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临从病毒变异到临床耐药床耐药原发无应答原发无应答病毒学（部分）病毒学（部分）应答应答临床耐药抗病毒治疗后抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药从病毒变异到临床耐药病病 毒毒 耐耐 药药 的的 临临 床床 影影 响响 耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低 耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处病毒反弹病毒反弹病毒反弹病毒反弹
14、, , , , 血清转氨酶升高血清转氨酶升高血清转氨酶升高血清转氨酶升高, HBeAg, HBeAg, HBeAg, HBeAg血清转换率降低血清转换率降低血清转换率降低血清转换率降低肝脏病理进展肝脏病理进展肝脏病理进展肝脏病理进展肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡肝移植后肝炎复发率增高肝移植后肝炎复发率增高肝移植后肝炎复发率增高肝移植后肝炎复发率增高 公共卫生危害公共卫生危害公共卫生危害公共卫生危害耐药病毒株的传播耐药病毒株的传播耐药病毒株的传播耐药病毒株的传播免疫逃逸免疫逃逸免疫逃逸免疫逃逸Lia
15、w et al. 1999Liaw et al. 1999. Hepatology . Hepatology 30: 56730: 567病毒的水平越低，耐药发生的几率越低病毒的水平越低，耐药发生的几率越低初治患者耐药发生率初治患者耐药发生率拉米夫定拉米夫定, ,阿德福韦阿德福韦, ,恩替卡韦为基因型耐药发生率恩替卡韦为基因型耐药发生率, ,替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率P区耐药位点检测区耐药位点检测n n长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药的基因突变位点主要集中于P区n n耐药基因分析在临床药物选择上的应用 目前最常见P区耐药位点11个（
16、169、173、180、181、184、194、202、204、233、236、250） 拉米夫定 M204I/V L180M V173L 恩曲他滨 V173L L180M M204I/V 阿德福韦 A181V N236T 恩替卡韦 T184A（G/I/S) M250V 特比夫定 M204I/V常用抗病毒药物的耐药位点常用抗病毒药物的耐药位点常见变异的交叉耐药性敏感敏感界于中间界于中间耐药耐药抗病毒药物的选择和使用抗病毒药物的选择和使用1.一种药物产生耐药时，需要用具有不同耐药位点药物代替2.为减少耐药情况，建议从治疗开始就使用具有两种不同耐药位点药物一起治疗3.由于抗病毒药物的耐药以及治疗的
17、长期性，在治疗过程中应该定期检查，或是在发现药物治疗效果不佳时需排除产生耐 药的可能药物治疗慢性乙肝患者管理路线药物治疗慢性乙肝患者管理路线图图检测检测检测检测耐药检测项目n n目目前前检检测测的的变变异异位位点点： P P区区耐耐药药位位点点1 11 1个个（1 16 69 9、1 17 73 3、1 18 80 0、1 18 81 1、1 18 84 4、1 19 94 4、2 20 02 2、2 20 04 4、 2 23 33 3、2 23 36 6、2 25 50 0）n n专专门门检检测测L LA AM M变变异异位位点点：1 18 80 0，1 18 81 1，2 20 04 4
18、，1 17 73 3n n专专门门检检测测A AD DV V变变异异位位点点：1 18 81 1，2 23 33 3，2 23 36 6艾迪康医学检验中心艾迪康医学检验中心P P区基因变异检验报告单区基因变异检验报告单样张样张 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒l传播途径传播途径: :主要血液主要血液/ /体液传播体液传播( (似似HBV)HBV)l是引起输血后慢性肝炎和肝硬化主要原因是引起输血后慢性肝炎和肝硬化主要原因l无症状无症状HCVHCV携带者和慢性丙肝者多见携带者和慢性丙肝者多见l感染感染HCVHCV后，慢性化的比例高达后，慢性化的比例高达50%50%以上以上l免疫力不牢固免疫力不牢固黄病毒科
19、黄病毒科 丙型肝炎病毒属丙型肝炎病毒属球形有包膜的球形有包膜的RNARNA病毒，直径病毒，直径50nm50nm病毒基因为单股正链病毒基因为单股正链RNARNA，链全，链全 长约长约10Kb10Kb HCV RNA HCV RNA 检测检测确定引起病毒性肝炎的直接原因通过病毒数量变化来监测治疗效果实时荧光实时荧光PCRPCR法：法：检测三个基因型（检测三个基因型（1 1型、型、2 2型、型、3 3型）型）PCRPCR产物直接测序法：产物直接测序法：1-61-6型及亚型型及亚型1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a,1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a,6b,6k6b,6kHCVHCV基因分型基因分型专专用用申申请请单单病程，病史病程，病史目前用药情况，服目前用药情况，服药时间药时间l 谢谢！谢谢！
