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1、课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离专题专题5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？ 根据不同根据不同生物大分子物理或化学性生物大分子物理或化学性质的质的差异，差异，选用一定的物理或化学的方选用一定的物理或化学的方法法进行进行分离。分离。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子
2、的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。一、基础知识：一、基础知识： 凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶具多孔的凝胶又又叫分子筛）叫分子筛） 2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的相对分子质分离物质的相对分子质量的大小量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。子筛作用，来进行分离。3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不
3、同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（ ）的蛋白质容易进）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（入凝胶内部的通道，路程（ ），移动），移动速度（速度（ ），而（），而（ ）的）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（）移动，路程（ ），移动速度（），移动速度（ ），），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、具体过程、具体过程相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 1、概念：在一定的
4、范围内，能对抗外、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量酸、碱或稍加稀释不引起溶液来少量酸、碱或稍加稀释不引起溶液PH发发生明显变化的作用叫做缓冲作用生明显变化的作用叫做缓冲作用。具有缓具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液： 2、作用：、作用： 能够抵制（能够抵制（ ）的对溶）的对溶液的（液的（ ）的影响，维持）的影响，维持PH基本基本不变。不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（）就可以制得（ ）
5、使）使用的缓冲液。用的缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3电泳：电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。生迁移的过程。 在在“血红蛋白血红蛋白提取和分离提取和分离”整个实整个实验室中验室中使使用的缓冲液是用的缓冲液是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目，目的是利用缓冲液模拟细胞内的的是利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（观察（如如红色）和红色
6、）和对对材料的科学研究材料的科学研究（使其保持正常使其保持正常活性）活性）。 2、原理：许多重要的生物大分子，如（、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有）等都具有( ) 在在( )下下，这些基团会带上（，这些基团会带上（ ） 。在。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（）以及分子本身（ ）、（）、（ ）的）的不同使带电分子产生不同使带电分子产生不同的（不同的（ ），从而实现样品中），从而实现样品中各种分子的分离。各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解
7、离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH分类：分类：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和和聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶电泳。如果如果测定（测定（ ） 通常用通常用SDS聚丙稀酰胺凝胶聚丙稀酰胺凝胶电泳电泳 SDS十二烷基十二烷基磺磺酸钠酸钠，其作用有其作用有:使蛋白质变性并解聚成单条使蛋白质变性并解聚成单条肽链；肽链； 与蛋白质形成与蛋白质形成SDS-蛋白质复蛋白质复合物从而掩盖蛋白质的电荷差异。合物从而掩盖蛋白质的电荷差异。蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量为了消除静电荷对迁移率
8、的影响可以在凝胶为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的的作用下会解聚成单条肽链，作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果因此测定的结果只是只是( )。SDS能与各种能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所所带带负负电荷电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于电泳迁移率完全取决于( )。 蛋白质在聚
9、丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它它所带静电荷的多少所带静电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小电泳检测结果电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳二、实验操作二、实验操作n蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：n（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。n（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。）粗分离：透析除去分子较小的杂质。n（3）纯化：通过凝胶色谱法将
10、分子量较大）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。的杂质蛋白质除去。n（4）纯度鉴定：通过）纯度鉴定：通过SDS聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。胶电泳鉴定。思考思考 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便，便于进行于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。提取血红蛋白。1.样品样品血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血
11、浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（ ）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链共四条肽链共四条肽链90n每条每条肽链环绕肽链环绕一个一个亚铁亚铁血血红红素素基基团团，可携，可携带带一一分子氧或一分子二氧化碳分子氧或一分子二氧化碳。血。血红红蛋白因含蛋白因含血血红红素素而呈而呈现红现红色。色。（一）样品处理（一）样品处理n1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：(n目的是去除杂蛋白目的是去除杂蛋白(血浆蛋白）血浆蛋白）。采血时采血时要加入柠要加入柠檬酸钠防止血液凝固；檬酸钠防止血液凝固；低速短时低速短时离心将血液
12、分层，离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用胶头吸管吸出黄色血浆；红细胞液红细胞液用生理盐水用生理盐水搅拌后低速短时离心搅拌后低速短时离心洗涤洗涤三次（上清液不呈黄色三次（上清液不呈黄色为止）为止）。红细胞的洗涤红细胞的洗涤思考思考洗洗涤红细胞胞时为什什么么不不能能用用蒸蒸馏水水代代替替生生理理盐水？水？【提示】【提示】生理生理盐水能保持水能保持红细胞的渗透胞的渗透压稳定定而不至于破裂。在未洗而不至于破裂。在未洗净血血浆中的中的杂质蛋白前，蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与蛋白与杂质血血浆蛋白混在一起，加大了分离的蛋白混在一起，加大了分离的难度。度。n
13、2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：n通过充分搅拌，通过充分搅拌，在蒸馏水和甲苯作用下，红细在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放胞破裂释放出血红蛋白。出血红蛋白。思考思考在在血血红蛋蛋白白释放放过程程中中，加加入入蒸蒸馏水水和和甲甲苯苯的的目的是什么？目的是什么？【提示】【提示】(1)加入蒸加入蒸馏水使水使红细胞吸水胞吸水涨破。破。(2)细胞膜的主要成分胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机磷脂，易溶于甲苯等有机溶溶剂，加入甲苯能加速，加入甲苯能加速红细胞破裂并胞破裂并释放出血放出血红蛋白。蛋白。n3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：n把把搅拌拌好好的的混混合合液液高高速速长时离离心心
14、后后,将将试管管中中的的液液体体用用滤纸过滤，除除去去脂脂溶溶性性沉沉淀淀层,于于分分液液漏漏斗斗中中静静置置片片刻刻后后，分分离离出出下下层的的红色色透透明明液液体。体。分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物n(二二) 粗分离粗分离 透析：透析：n(1)原原理理：透透析析袋袋（半半透透膜膜）能能使使小小分分子子自自由由进出，而将大分子物出，而将大分子物质（蛋白（
15、蛋白质）则保留在袋内。保留在袋内。n(2)目的：将目的：将样品中分子品中分子较小的小的杂质除去。除去。n(3)方方法法：将将血血红蛋蛋白白溶溶液液装装入入透透析析袋袋，将将透透析析袋袋放放入入一一定定量量适适宜宜浓度度的的磷磷酸酸缓缓冲冲液液（PH为为7.0）中，透析中，透析12 h.透析过程（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 （1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作： 取长取长40厘米，内径厘米，内径1.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。两端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100目尼龙
16、纱包好，目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端插到玻璃管的一端。注意事项注意事项注意事项注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相应位置组装成将上述三者按相应位置组装成一个整体一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。（2 2 2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝
17、胶的选择：A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75）。）。B、代表意义：、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水时吸水7.5克。克。 凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。液。凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：、固
18、定：将色谱柱装置将色谱柱装置固定在支架上。固定在支架上。B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性的装将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。均匀。注意注意装填凝胶柱时不得有气泡存在：装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml的的20mmol/l的的磷酸磷酸缓冲液（缓冲液（
19、pH为为7.0）充分充分洗涤平衡洗涤平衡12小时，使凝胶小时，使凝胶装填紧密装填紧密。注意：注意：注意：注意：1、液面、液面不要低于凝胶表面，否则不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象露出凝胶颗粒的现象。（3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。到与凝胶面平齐，关闭出口
20、。 滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。凝胶面。 样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液
21、到适当的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：收集：收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 注意：注意：注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动
22、。（三）纯度鉴定（三）纯度鉴定n使用最多的是使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳。n（SDS十二烷基磺酸钠）十二烷基磺酸钠）n电泳后，可以通过和标准蛋白电泳结果电泳后，可以通过和标准蛋白电泳结果比对，判断纯度（和相对分子质量）。比对，判断纯度（和相对分子质量）。练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得
23、高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过
24、程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数分子数或者或者CO2分子数分别是分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白、记住样品处理中的血红蛋白释放后释放后溶液溶液离心分层顺序离心分层顺序自上而下自上而下是：是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀
