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1、课题课题3 酵母细胞的固定化酵母细胞的固定化课题课题3 酵母细胞的固定化酵母细胞的固定化课题背景：课题背景：1.酶应用时存在的实际问题。酶应用时存在的实际问题。（1）对）对_和和_等等条件非常敏感，易失活。条件非常敏感，易失活。（2）酶很难回收，不能被）酶很难回收，不能被_,提高了提高了生产成本。生产成本。（3）反应后酶会混在产物中，可能影响产品的质量）反应后酶会混在产物中，可能影响产品的质量强酸、强碱、高温强酸、强碱、高温有机溶剂有机溶剂再次利用再次利用2.固定化酶的优点：固定化酶的优点： 酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被被_反复利用反复
2、利用3.固定化细胞的优点：固定化细胞的优点： 与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本_，操作，操作_更低更低更容易更容易基础知识：基础知识： （一）酶和细胞固定化方法（一）酶和细胞固定化方法思考：思考：固定化酶固定化酶或或固定化细胞固定化细胞可以采取哪些方法？可以采取哪些方法？各有什么利弊？各有什么利弊？1 1、物理吸附法、物理吸附法2 2、包埋法、包埋法3 3、化学结合法、化学结合法（二）酶和细胞固定方法的选择（二）酶和细胞固定方法的选择酶酶适合采用化学结合和适合采用化学结合和物理吸附法固定物理吸附法固定细胞细胞适合采用包埋法固定适合采用包埋法固定1
3、 1、方法、方法2 2、原因、原因细胞个大，酶分子很小细胞个大，酶分子很小个体大的细胞难以被吸附个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的酶容易从包或结合而个小的酶容易从包埋的材料中漏出埋的材料中漏出生产优点：生产优点：反应柱能连续使用反应柱能连续使用半年，大大降低了半年，大大降低了生产成本，提高了生产成本，提高了果糖的产量和质量果糖的产量和质量（三）固定化酶的应用实例（三）固定化酶的应用实例1 1、高果糖浆、高果糖浆三、实验操作三、实验操作（一）方法（一）方法1 1、包埋法固定化细胞、包埋法固定化细胞2 2、海藻酸钠海藻酸钠作载体包埋酵母细胞作载体包埋酵母细胞（二）制备固定化酵母细胞（二）制备固定
4、化酵母细胞1.酵母细胞的活化酵母细胞的活化2.配置物质的量浓度为配置物质的量浓度为0.05mol/L的的CaCl2溶液溶液3.配置海藻酸钠溶液配置海藻酸钠溶液4.海藻酸钠与酵母细胞混合海藻酸钠与酵母细胞混合5.固定化酵母细胞固定化酵母细胞一、课题背景一、课题背景阅读课题背景并思考：阅读课题背景并思考：1 1、直接使用、直接使用酶制制剂在在应用中各有什么用中各有什么优、缺点？如、缺点？如何解决使用何解决使用酶制制剂时的缺陷？的缺陷？2 2、固定化固定化酶技技术在在应用中各有什么用中各有什么优、缺点？如何、缺点？如何解决使用固定化解决使用固定化酶技技术在在应用用时的缺陷？的缺陷？3 3、固定化固定
5、化细胞胞在在应用中各有什么用中各有什么优、缺点？、缺点？1 1、直接使用酶制剂、直接使用酶制剂天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，剂等条件非常敏感，容易失活容易失活溶液中酶溶液中酶很难回收很难回收，不能再次利用，不能再次利用，提高提高了生产成本了生产成本反应后，反应后，酶会混在产物中酶会混在产物中，影响产品质量，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用难以在工业生产中广泛应用（1 1）优点优点（2 2）缺点缺点催化效率高、低耗能、低污染催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食，大规模地应用于食品、化工等各个领域品、化工等各个领域如何解决如
6、何解决这些问题这些问题？1 1、直接使用酶制剂、直接使用酶制剂（3 3）解决方案解决方案固定化酶技术固定化酶技术2 2、固定化酶、固定化酶（1 1）含义：）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。将酶固定在不溶于水的载体上。（3 3）优点：）优点：酶既酶既能与反应物接触能与反应物接触，又，又能与产物分离能与产物分离，同时，固，同时，固定在载体上的酶还可以被定在载体上的酶还可以被反复利用反复利用。（4 4）缺点缺点： 一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过很多产物的形成是通过一系列的酶促反应一系列的酶促反应才能得到。才能得到。（5
7、5）解决方案：）解决方案：固定化细胞技术固定化细胞技术（2 2）实例：）实例：利用固定化酶技术生产利用固定化酶技术生产“高果糖浆高果糖浆”。固定化酶的应用实例：固定化酶的应用实例：生产高果糖浆生产高果糖浆1 1、什么是高果糖浆？使用它有何好处？、什么是高果糖浆？使用它有何好处？高果糖浆是果糖含量为高果糖浆是果糖含量为42%42%左右的糖浆。作为蔗糖的替左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康有利。齿和心血管病，对人的健康有利。再思考：再思考：果糖属于什么糖果糖属于什么糖? ?果糖是一种：果糖
8、是一种：单糖单糖 分子式：分子式：C6H12O62 2、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？直接使用酶时有什么缺点？有何特点？直接使用酶时有什么缺点？生产高果糖浆需要：生产高果糖浆需要：作用：作用：特点：特点：直接使用酶时的缺点：直接使用酶时的缺点：葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶酶稳定性好，可持续发挥作用酶稳定性好，可持续发挥作用将葡萄糖转化为果糖将葡萄糖转化为果糖酶溶于葡萄糖溶液后，就无法酶溶于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，从糖浆中回收，造成很大的浪造成很大的浪费。费。如何改进如何改进？3 3、改进：、改进： 固定化酶技术固定化酶
9、技术 4 4、具体做法：、具体做法： 5 5、优点：、优点：反应柱能连续使用半反应柱能连续使用半年，大大年，大大降低了生产成降低了生产成本。本。提高了提高了果糖的产量和果糖的产量和品质品质。3 3、固定化细胞、固定化细胞（1 1）含义：）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。将细胞固定在一定空间内的技术。（2 2）优点：）优点：成本低、操作容易、成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收化一系列的反应、容易回收（3 3）缺点缺点：固定后的固定后的细胞与反应物不容易接近细胞与反应物不容易接近，可能导致反应可能导致反应效果下降，效果下降，由于由于大
10、分子物质难以自由通过细胞膜大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的因此固定化细胞的应用也受到限制。应用也受到限制。但相对较为完善。但相对较为完善。二、酶和细胞固定化方法二、酶和细胞固定化方法( (看课本看课本P P5050）思考：固定化酶或固定化细胞指什么？思考：固定化酶或固定化细胞指什么？ 可以采取哪些方法进行固定？各有什么利弊？可以采取哪些方法进行固定？各有什么利弊？ 物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法化学结合法化学结合法 1 1、固定化酶或固定化细胞：、固定化酶或固定化细胞：指利用指利用物理或化学方法物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间将酶或细胞固定在一定空间内的技术。内的技术。
11、2 2、方法：、方法：将酶（或细胞）包埋在细微网将酶（或细胞）包埋在细微网格里格里将酶（或细胞）相互结合，将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。或将其结合到载体上。将酶（或细胞）吸附在载体表将酶（或细胞）吸附在载体表面上面上包埋法包埋法化学结合法化学结合法物理吸附法物理吸附法固定化酶或固定化细胞采取的方法固定化酶或固定化细胞采取的方法【比较比较】酶和细胞的固定方法和特点酶和细胞的固定方法和特点酶分子很小，酶分子很小，容易从包埋材料中容易从包埋材料中漏出。漏出。细胞体积大，细胞体积大，难以被吸附或结合。难以被吸附或结合。 思考思考1 对固定固定酶的作用影响的作用影响较小的固定方法是什么？小
12、的固定方法是什么？ 思考思考2 将谷氨酸棒状杆菌生将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的谷氨酸的发酵酵过程程变为连续的的酶反反应，应当固定（当固定（酶、细胞胞）。）。吸附法。吸附法。三、实验操作：包埋法固定细胞三、实验操作：包埋法固定细胞明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。酰胺等。 1 1、包埋法固定细胞：、包埋法固定细胞：即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。载体中。 2 2、包埋时常用的载体包括：、包埋时常用的载体包括：海藻酸钠：海藻酸钠：一种天然一种天然多糖多糖，是由海带中提取的天然多糖碳
13、水化合，是由海带中提取的天然多糖碳水化合物，可作为食用的食品添加剂，也可作为支架材料用物，可作为食用的食品添加剂，也可作为支架材料用于医学用途，其温和的溶胶凝胶过程、良好的生物相于医学用途，其温和的溶胶凝胶过程、良好的生物相容性使其适于作为释放或包埋药物。容性使其适于作为释放或包埋药物。三、实验操作三、实验操作（一）制备固定化酵母细胞（一）制备固定化酵母细胞（二）用固定化酵母细胞发酵（二）用固定化酵母细胞发酵（一）制（一）制（一）制（一）制备备固定化酵母固定化酵母固定化酵母固定化酵母细细胞胞胞胞1、酵母、酵母细胞的活化：胞的活化：在缺水状态下，微生物处于休眠状态。在缺水状态下，微生物处于休眠状
14、态。活化是指让活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。程。n1g干酵母干酵母10mL蒸馏水蒸馏水50mL烧杯烧杯搅拌均匀搅拌均匀放置放置1h，使之活化。，使之活化。思考思考活化是指什么？活化是指什么？操作提示操作提示酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。容器外。2 2、配制物质的量浓度为、配制物质的量浓度为0.05mol/L0.05mol/L的的CaClCaCl2 2溶液：溶液：0.83g
15、CaCl0.83gCaCl2 2150mL150mL蒸馏水蒸馏水200mL200mL烧杯烧杯溶解备用。溶解备用。思考思考为什么要用蒸馏水，而不用自来水？为什么要用蒸馏水，而不用自来水？防止自来水中各种离子影响实验结果防止自来水中各种离子影响实验结果防止自来水中各种离子影响实验结果防止自来水中各种离子影响实验结果操作提示操作提示溶解物质要彻底。溶解物质要彻底。3 3、配制海藻酸钠溶液、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠海藻酸钠10mL水水50mL烧杯烧杯酒精灯酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化蒸馏水定容到蒸馏水定容到10mL。加热时要用加热时要用
16、小火小火，或者，或者间断加热间断加热，并搅拌，反复几，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止次，直到海藻酸钠溶化为止思考思考为什么要用小火或间断加热，并不断搅拌？为什么要用小火或间断加热，并不断搅拌？防止海藻酸钠发生焦糊。防止海藻酸钠发生焦糊。操作提示操作提示429572439gao4 4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液将溶化好的海藻酸钠溶液冷却冷却至室温，加入至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分已活化的酵母细胞，进行充分搅拌搅拌，再转移，再转移至注射器中至注射器中以免海藻酸钠温度过高杀死酵母菌以免海藻酸钠温度过高杀死酵母菌思考思考为什么要将海藻
17、酸钠冷却至室温？为什么要将海藻酸钠冷却至室温？海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。操作提示操作提示429572439gao（5 5）固定化酵母细胞）固定化酵母细胞以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加CaClCaCl2 2溶溶液中，将形成的凝胶珠在液中，将形成的凝胶珠在CaClCaCl2 2溶液中浸泡溶液中浸泡30min30min左左右。右。思考思考 CaCl CaCl2 2溶液有什么作用？溶液有什么作用？使胶体聚沉，形成结构
18、稳定的凝胶珠。使胶体聚沉，形成结构稳定的凝胶珠。刚形成的凝刚形成的凝刚形成的凝刚形成的凝胶珠应在胶珠应在胶珠应在胶珠应在CaClCaClCaClCaCl2 2 2 2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。的结构。的结构。的结构。操作提示操作提示滴加注射器中的溶液时，速度一定要恒定且缓慢，滴加注射器中的溶液时，速度一定要恒定且缓慢，以便形成的凝胶珠呈均匀的圆形或椭圆形。以便形成的凝胶珠呈均匀的圆形或椭圆形。429572439gao429572439gao（二）用固定化酵母细胞发酵（二）用固定化酵母细
19、胞发酵将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2 23 3次。次。将将150ml150ml质量分数为质量分数为1010的葡萄糖溶液转移至的葡萄糖溶液转移至200ml200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于2525C C下下发酵发酵24h24h思考思考 1 1、为什么要用蒸馏水冲洗凝胶珠？、为什么要用蒸馏水冲洗凝胶珠？洗去凝胶珠表面多余的洗去凝胶珠表面多余的CaClCaCl2 2溶液。溶液。以免对实验造成影响。以免对实验造成影响。思考思考 2 2、葡萄糖在这里有什么用？、葡萄糖在这里有什么用？既可以既可以作为发
20、酵底物作为发酵底物，也作为酵母菌细胞的，也作为酵母菌细胞的营养物质营养物质。429572439gao1 1、海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。、海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过如果海藻酸钠浓度过高高：四、特别注意：四、特别注意：将很难形成凝胶珠。将很难形成凝胶珠。高浓度海藻酸钠只能用粗针头注高浓度海藻酸钠只能用粗针头注射，针头粗也会粘着，难促使形成液滴。且高浓度海射，针头粗也会粘着，难促使形成液滴。且高浓度海藻酸钠不易形成滴状下落，形成条状，不是圆形或是藻酸钠不易形成滴状下落，形成条状，不是圆形或是椭圆形，品相极差，并且凝胶珠容易破裂。椭圆形，品相极差，并且凝胶珠容
21、易破裂。形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少。形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少。因为包埋因为包埋不紧密，细胞容易从包埋材料中漏出。且形成的凝胶不紧密，细胞容易从包埋材料中漏出。且形成的凝胶珠可能带细丝尾巴。珠可能带细丝尾巴。如果浓度过如果浓度过低低：刚形成的凝胶珠应在刚形成的凝胶珠应在CaClCaCl2 2溶液中浸泡一段时溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，
22、没有液体流出，就表明凝胶胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。珠的制作成功。二是二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的2 2、酵母细胞的固定化、酵母细胞的固定化（一）观察凝胶珠的颜色和形状（一）观察凝胶珠的颜色和形状五、结果分析与评价五、结果分析与评价（二）观察发酵的葡萄糖溶液（二）观察发酵的葡萄糖溶液如果制作的如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色：凝胶珠颜色过浅、呈白色：说明海藻酸钠的浓度偏说明海藻酸钠的浓度偏低低，固定的酵母，固定的酵母细胞数目较少细胞数目较少；
23、如果如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形：形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形：说明海藻酸钠的浓度偏高。说明海藻酸钠的浓度偏高。二者都说明制作失败，需要再作尝试。二者都说明制作失败，需要再作尝试。利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味生了很多气泡，同时会闻到酒味思考思考 1 1、发酵过程中锥形瓶为什么要密封？、发酵过程中锥形瓶为什么要密封？酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。思考思考 2 2、锥形瓶中的气泡和酒精是怎么形成的？、锥形瓶中的气泡和酒精是怎么形成的？酵母菌进行无氧呼吸产生的酵母菌进行无氧呼吸产生的
